Procédures modérées

Cinq jours de gavage quotidien, puis une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour y provoquer une lésion musculaire : 2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. S'y ajoutent deux tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prélèvements de sang à la queue, un régime enrichi en lipides dont le porteur indique que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines", et des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. L'objectif déclaré est d'établir un lien de cause à effet entre la graisse logée dans le muscle et deux mécanismes, la régulation du glucose et la régénération musculaire, chez des souris tuées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois selon les groupes. Le porteur justifie le recours à Mus musculus en le décrivant comme "le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature", ce qui permettrait "de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats".

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Chauffés jusqu'à la perte d'équilibre, 440 poissons d'eau douce capturés en nasses subissent une élévation rapide de la température pendant 80 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois espèces seront retenues parmi le gardon, la perche soleil, la grémille, le goujon, le rotengle et le gobie à tache noire, maintenues jusqu'à 48 heures en bourriche et à jeun, la manipulation pouvant leur faire perdre mucus et écailles. Tous sont ensuite tués pour des mesures sur les tissus. Le porteur qualifie pourtant le test employé, le CTmax, de "mesure de tolérance thermique non létale".

Objectifs

Les effets des changements climatiques se manifestent de manière particulièrement prononcée dans les écosystèmes d’eau douce, où les vagues de chaleur augmentent en fréquence et en intensité. Les organismes ectothermes (e.g. poissons) y sont particulièrement vulnérables, dans la mesure où leur température corporelle dépend de celle de leur environnement. En conséquence, la tolérance des organismes aquatiques aux variations rapides de la température dans leur environnement constitue un facteur déterminant de leur résilience et de leur survie. Toutefois, comment un individu répond au stress thermique dépend des interactions biotiques (interactions intra- et interspécifiques) inhérentes à tout écosystème et qui persistent pendant un épisode de vague de chaleur. En ce sens, des données indiquent que les interactions entre espèces peuvent influencer des processus physiologiques tels que la croissance, la reproduction et le taux métabolique. Cependant, les recherches sur la manière dont ces interactions influencent la tolérance thermique individuelle sont limitées, puisque les études se sont jusqu’à présent focalisées principalement sur des individus isolés, sans tenir compte des interactions intra- et interspécifiques. L’objectif du présent projet de recherche est de mesurer l’impact des interactions intra- et interspécifiques sur la tolérance thermique chez les poissons. Plus précisément, notre objectif sera composé de deux volets expérimentaux : (1) Établir si les interactions intra- et interspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale (volet 1) (2) Déterminer si les interactions intraspécifiques augmentent ou réduisent la tolérance thermique maximale, selon le sexe (mâle vs. femelle), en tenant compte de l’âge, de la taille et de la charge parasitaire comme covariables. (volet 2). Afin de répondre à nos objectifs de recherche, nous mesurons la tolérance thermique maximale via le test CTmax ; une mesure de tolérance thermique non létale couramment utilisée chez les poissons. La mesure de CTmax permet d’estimer rapidement la température maximale au-delà de laquelle les performances physiologiques d’un organisme ne sont plus soutenues. Pour chaque objectif nous quantifierons la charge parasitaire de chaque individu car cette interaction biotique peut avoir un effet sur la tolérance thermique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les limites thermiques des poissons, un aspect essentiel pour comprendre comment les organismes répondent au stress thermique dans leur environnement. Pour chaque espèce, il est possible de déterminer une température de tolérance maximale (CTmax), à partir de laquelle les performances de l'individu chutent fortement et comment la tolérance varie en fonction des facteurs biotiques (présence de congénères ou d’individu d’autres espèces). Dans un contexte de réchauffement climatique, la valeur de CTmax est particulièrement importante, puisqu’elle indique la température maximale que l'organisme peut supporter et donc prédire la résilience des populations face aux changements climatiques. Ce projet est novateur sur deux aspects, puisqu’il utilise des organismes issus de milieux naturels et réplique les interactions biotiques présentes dans l’écosystème, alors que la plupart des études sur la tolérance thermique maximale utilisent des organismes élevés en laboratoire et ne considèrent pas ces interactions.

Procédures

Pendant l’expérience de tolérance thermique, les individus subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre : 1 seule fois pendant 80 minutes

Impact sur les animaux

La mise en place du protocole expérimental décrit ci-dessus peut amener les nuisances ou effets indésirables suivants sur les animaux : (1) Stress lié à la capture en nasses (2) Stress lié au maintien temporaire en bourriche et au jeûne (maximum 48h). (3) Stress lié à la manipulation qui peut entrainer une perte de mucus ou d’écailles. (4) Stress lié à l’augmentation rapide de la température pendant le protocole de CTmax

Devenir

Tous les poissons utilisés seront mis à mort pour effectuer des mesures sur tissus.

Remplacement

Le but de notre étude est de comprendre comment la dynamique entre espèces et au sein d’une même espèce affecte la tolérance thermique de l’individu. Cela apportera des informations sur la dynamique de l’écosystème auquel ces espèces appartiennent, susceptible de changer en réponse aux changements climatiques. Le modèle animal demeure indispensable puisque nous examinons les interactions biotiques et la manière dont la réponse comportementale à une vague de chaleur est affectée par celles-ci. En conséquence, le remplacement est impossible ici, puisqu'il s’agit d'analyser la réponse intégrale de l'organisme face à une vague de chaleur à l'aide de mesures comportementales. Nous privilégions l'utilisation des poissons, qui sont souvent les principaux prédateurs poïkilothermes dans les écosystèmes aquatiques et jouent un rôle fonctionnel clé.

Réduction

Afin de répondre au principe de réduction, le nombre d’individus a été calculé pour fournir un pouvoir statistique suffisant pour évaluer les variations de la tolérance thermique maximale entre les trois groupes expérimentaux. Sur la base de publications récentes, nous estimons le CTmax du gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) autour de 35 °C, celle de la perche soleil (Lepomis gibbosus) à environ 34 °C, ainsi qu’à 30 °C chez la grémille (Gymnocephalus cernua), 32 °C chez le goujon (Gobio gobio) et 36 °C chez le rotengle (Scardinius erythrophthalmus).

Raffinement

Pour la stabulation, les poissons seront placés dans des bourriches immergées dans la rivière afin de maintenir les poissons en milieu semi-naturel avant le début du protocole expérimental CTmax. Entre le moment de la capture et le début du protocole expérimental (CTmax), un délai maximal de 48 h sera observé afin de limiter le temps passé en dehors de leur milieu naturel. Lors de la stabulation dans les bourriches, la densité sera limitée à un maximum de 12 individus pour permettre le maintien des interactions intra- et interspécifiques tout en évitant les interactions antagonistes. Les bourriches seront enrichies de rochers et de végétation pour refléter les conditions naturelles, tout en favorisant des zones de repli afin de réduire le stress. Pour les trois aquariums expérimentaux, nous utiliserons des aquariums non enrichis pour observer la perte des fonctions locomotrices, qui se traduit par un retournement indiquant que la limite de tolérance thermique maximale de l’individu est atteinte. Le protocole expérimental sera réalisé dans des glacières dont le fond et les quatre côtés seront opaques afin de limiter les stimulations visuelles liées à la présence humaine. La présence des manipulateurs sera limitée grâce à un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront équipés d’un bulleur afin de maintenir une concentration en oxygène dissous proche de 100 %. L’eau utilisée proviendra de la rivière. La température, le pH et l’oxygène dissous seront mesurés par sonde durant le test. Pour chaque test, les individus seront sous la surveillance d’un binôme formé et expérimenté en manipulation animal. Des limites établies pour assurer le bien-être animal permettront une intervention rapide en cas de signes indiquant que l’individu est en souffrance. Un arbre décisionnel guide les actions à entreprendre en fonction de l’état clinique observé. Si l’état des individus se dégrade, des critères d’arrêt peuvent entraîner la fin anticipée de l’expérience, conformément à la réglementation en vigueur. L’augmentation de la température sera planifiée de manière différenciée entre les trois set-up expérimentaux, de sorte que les individus d’une unité n’atteignent jamais simultanément leurs limites thermiques avec ceux d’un autre mésocosme, garantissant ainsi une prise en charge rapide et individualisée.

Choix des espèces

Afin de remplir l’objectif du volet 1, nous sélectionnerons parmi la liste d’espèces suivante, les trois espèces qui seront trouvées en abondance et dont la niche écologique est similaire : gardon (Rutilus rutilus) ; perche soleil (Lepomis gibbosus) ; grémille (Gymnocephalus cernua) ; goujon (Gobio gobio) ; rotengle (Scardinius erythrophthalmus) ; gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) Les trois espèces seront choisies pour leurs caractéristiques écologiques communes et leur pertinence pour l’étude des réponses aux stress thermiques. Les trois espèces d’écrevisses sont des espèces exotiques à fort impact écologique. Il est donc particulièrement pertinent d’étudier leur limite thermique. Pour le volet 2, nous avons choisi le gobie à tache noire, une espèce exotique envahissante à fort impact écologique, dont l’étude de la tolérance thermique permet de mieux comprendre son potentiel de persistance et d’expansion dans un contexte de réchauffement climatique.

Deux chirurgies, l'une d'une heure, l'autre d'une heure quarante-cinq, séparées d'au moins cinq jours, implantent des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au thorax et une canule nasale. Viennent ensuite des sessions d'enregistrement en contention allant jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, et pour une partie des 128 souris un entraînement quotidien à une tâche auditive qui peut se prolonger plusieurs mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, et subissent de brefs stimuli aversifs, goût amer ou jet d'air. À la fin, chaque souris est opérée sans réveil pour le prélèvement de son cerveau, destiné à l'analyse histologique.

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

MODIFICATION [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs.] Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

312 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, deux prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie et des tests métaboliques de deux heures avec cinq prises de sang. Une partie reçoit du chlorure de lithium dans l'eau de boisson, à 600 mg/L pour les jeunes de cinq semaines et 1 200 mg/L pour les adultes de trois mois, avec des effets secondaires attendus sur le poids et le comportement. Pour 32 d'entre eux, les prélèvements sanguins répétés peuvent entraîner une perte de sang incontrôlée, une anémie ou une détresse respiratoire, risques que le porteur énonce lui-même. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement des tissus, dont les îlots pancréatiques destinés à des expériences menées hors des rats.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui représente aujourd’hui un important problème de santé dans le monde. Elle apparaît lorsque le pancréas, un organe qui aide à contrôler le taux de sucre dans le sang grâce à une hormone appelée insuline, ne fonctionne plus correctement. Cette maladie touche des centaines de millions de personnes et peut entraîner de graves conséquences pour la santé, notamment des problèmes au niveau du cœur, des reins ou de la vue. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement permettant de guérir définitivement le diabète de type 2. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment cette maladie se développe afin de trouver de nouvelles solutions pour la traiter. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2, le pancréas est soumis à une inflammation chronique, c’est-à-dire une réaction de défense du corps qui dure trop longtemps et finit par endommager l’organe. Cette inflammation semble être provoquée par une présence excessive de cellules immunitaires, les cellules chargées normalement de défendre l’organisme contre les infections. Cependant, nous ne savons pas encore précisément d’où viennent ces cellules immunitaires. Nous pensons qu’elles pourraient être produites en grande quantité par la moelle osseuse, le tissu situé à l’intérieur des os qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire. Notre laboratoire a déjà montré que, dans le diabète, la moelle osseuse produit davantage de cellules immunitaires favorisant l’inflammation. Nous faisons donc l’hypothèse que réduire cette inflammation dans la moelle osseuse pourrait aussi diminuer l’inflammation du pancréas et ralentir sa dégradation. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’inflammation dans le pancréas et dans la moelle osseuse à l’aide de modèles de la maladie. Il vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques pour voir si elles permettent de limiter cette inflammation et de préserver le bon fonctionnement du pancréas. Cette étude sera réalisée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique peut améliorer l'état inflammatoire dans les deux sexes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes inflammatoires impliqués dans le diabète et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Une partie des animaux de la procédure 1 et 2 seront traités au chloride de lithium (LiCl) dans l’eau de boisson à une dose de 600mg/L (rattons de 5 semaines) et 1200mg/L (rats adultes de 3 mois). Les animaux de la procédure 1 et 2 (312 rats) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mes mesurer leur glycémie chaque semaine. Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, les rats subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute). Une fois, avant le début du traitement, et, une fois, à la fin du traitement, nous prélèverons une petite quantité de moelle osseuse chez les mêmes rats. Cette opération sera effectuée sous anesthésie générale et un anti-douleur sera injecté avant et après la procédure pour limiter au maximum la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer leur état. Certains animaux de la procédure 2 (32 rats) subiront plusieurs prélèvements d'un petit volume sanguin pour isoler leurs cellules immunitaires qui serviront à des analyses en dehors de l’animal. Ce prélèvement est réalisé sous anesthésie et dure quelques minutes. Dans cette procédure, nous prélevons du sang 2 fois au cours de toute la durée de vie de l’animal et chaque prélèvement sera espacé d’une semaine pour leur laisser le temps de se remettre totalement du geste.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 et 2, les nuisances attendues sont les potentiels effets secondaires liés au traitement (perte de poids, comportement modifié…etc.). Nous prévoyons de contrôler chaque semaine le poids, la glycémie et le comportement des animaux. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection aux cours des tests métaboliques, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. Le prélèvement de moelle osseuse peut également générer des douleurs post-opératoires. Nous utiliserons un anti-douleur pour limiter ces effets. Dans la procédure 2, les potentielles nuisances sont liées aux effets secondaires possibles lors du prélèvement de sang. Cela peut entrainer une perte de sang incontrôlée, une anémie ou encore détresse respiratoire. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés tout au long de la procédure. Nous prélèverons un petit volume sanguin et un point de compression sera réalisé jusqu’à l’arrêt du saignement. De plus, les animaux seront surveillés pendant et après la réalisation du geste pour s’assurer de leur bien-être.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque nous souhaitons étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (moelle osseuse, circulation sanguine et pancréas), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. De plus, les animaux utilisés pour les prélèvements sanguins sont les mêmes animaux utilisés pour les prélèvements d’îlots pancréatiques au vu des expériences ex vivo, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux total utilisé. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 10 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (matériel de nidification, abris), dans des conditions contrôlées de température, d’humidité et de cycle lumineux. Un suivi hebdomadaire sera assuré afin d’évaluer leur état général (poids, glycémie, comportement, aspect du pelage, posture, mobilité). Des points limites prédéfinis permettront d’interrompre rapidement une procédure en cas de signe de souffrance excessive. De plus, une anesthésie et/ou une analgésie adaptée sera utilisée chaque fois que nécessaire. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Les rats que nous utilisons dans ce projet développent une maladie proche du diabète de type 2 observé chez l’Homme. Ils permettent d’étudier en même temps le fonctionnement du pancréas, du système immunitaire et du métabolisme, ce qui n’est pas possible avec des cellules cultivées seules. Les animaux utilisés seront de jeunes rats de 5 semaines, pas encore totalement diabétiques ainsi que des adultes de 3 mois ayant déjà bien développé le diabète. Cela nous permettra d’étudier la manière dont évolue la maladie au cours du temps et de déterminer les effets du traitement en effet préventif (avant que le diabète ne s’installe totalement) et curatif (effet du traitement sur la maladie déjà déclarée).

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à 260 gavages ou 260 injections abdominales étalés sur douze mois. Le protocole commence tôt : biopsie de la queue à six jours pour l'identification génétique, injection unique d'un composé cancérogène à quinze jours, puis à partir de huit semaines l'administration répétée de benzo[a]pyrène, un polluant issu de la combustion, avec pour certains groupes des injections destinées à provoquer une fibrose du foie. Une inflammation hépatique, du tissu cicatriciel et des tumeurs du foie sont attendus et se développent progressivement. Les retombées annoncées, mieux évaluer le risque lié aux polluants et ouvrir des pistes de prévention, sont formulées au long terme, quand les atteintes du foie, elles, sont provoquées d'emblée.

Objectifs

Les polluants présents dans l’environnement peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé humaine. Parmi eux, le benzo[a]pyrène (B[a]P) est une substance produite lors de la combustion incomplète de matières organiques, par exemple par le trafic routier, le chauffage, certaines activités industrielles ou le tabagisme. L’être humain y est exposé quotidiennement, notamment par l’alimentation et l’air ambiant. Plusieurs études suggèrent qu’une exposition prolongée à cette substance pourrait favoriser le développement de maladies du foie, notamment la fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) et le cancer du foie. Cependant, les mécanismes par lesquels ce polluant agit sur le foie restent encore mal connus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une exposition chronique au benzo[a]pyrène influence l’apparition et l’aggravation des maladies hépatiques. Le projet vise également à déterminer si le benzo[a]pyrène peut aggraver une maladie hépatique déjà présente et favoriser la progression du cancer du foie. Enfin, il permettra d’évaluer si un traitement expérimental capable de bloquer certains effets de ce polluant peut limiter le développement des lésions hépatiques et du cancer. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les effets des polluants environnementaux sur le foie et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains polluants présents dans l’environnement, et en particulier le benzo[a]pyrène, peuvent contribuer au développement de maladies du foie lorsqu’une exposition se prolonge sur une longue période. Les connaissances acquises aideront à identifier les mécanismes responsables de l’apparition de la fibrose hépatique et du cancer du foie liés à ces polluants. Elles permettront également de mieux comprendre comment certaines cellules du foie sont affectées par l’exposition chronique à ces substances. Le projet évaluera par ailleurs l’intérêt d’une approche thérapeutique expérimentale visant à limiter les effets nocifs du benzo[a]pyrène sur le foie. Ces travaux pourraient ainsi contribuer, à plus long terme, au développement de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies hépatiques associées à l’exposition aux polluants environnementaux. Enfin, les résultats obtenus permettront d’améliorer l’évaluation des risques liés à l’exposition à ces polluants et pourront contribuer à l’élaboration de recommandations destinées à mieux protéger la santé humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions consistant principalement en l’administration répétée de substances par voie orale (gavage) ou par injection dans la cavité abdominale. Selon les groupes expérimentaux, les souris recevront : une biopsie de queue réalisée à l’âge de 6 jours pour l’identification génétique ; une injection unique à l’âge de 15 jours ; deux injections par semaine pendant 12 semaines (soit 24 injections au total) ; deux gavages par semaine pendant 12 semaines (soit 24 administrations) ; cinq gavages par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations) ; cinq injections par semaine pendant 12 semaines (soit 60 injections au total) ; cinq injections par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations). La durée de chaque intervention est courte : environ 5 à 30 secondes pour un gavage et environ 15 secondes pour une injection. À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux afin de permettre les analyses nécessaires au projet.

Impact sur les animaux

Les animaux participeront à des études nécessitant l’administration répétée de substances par voie orale ou par injection. Ces manipulations pourront entraîner un stress ou une gêne légère et de courte durée liés à la contention et à l’administration des traitements. Certaines souris seront exposées à une substance polluante susceptible d’induire progressivement des atteintes du foie. Selon les groupes expérimentaux, ces atteintes pourront se traduire par une inflammation du foie, l’apparition de tissu cicatriciel (fibrose) ou le développement de tumeurs hépatiques. Ces effets apparaîtront de manière progressive au cours de l’étude. Les animaux seront surveillés régulièrement tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets du B[a]P.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet. En effet, l’étude de l’impact d’une exposition chronique au benzo[a]pyrène (B[a]P) sur le développement de la fibrose et du cancer du foie nécessite l’analyse de processus physiopathologiques complexes impliquant de multiples types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ainsi que leurs interactions au sein d’un organisme intact. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière intégrée les phénomènes de fibrogenèse, d’inflammation chronique et de carcinogenèse hépatique induits par une exposition prolongée à un polluant environnemental. Les modèles in vitro, bien que complémentaires, ne permettent pas de recapituler l’ensemble des interactions cellulaires, des réponses systémiques et de la cinétique d’évolution des lésions observées in vivo. L’utilisation de la souris constitue un modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies hépatiques humaines, en particulier dans les modèles de fibrose et de carcinome hépatocellulaire chimio-induits. Elle permet notamment d’étudier de manière intégrée les effets du B[a]P sur le foie dans un contexte physiologique pertinent, incluant le métabolisme des xénobiotiques et les réponses inflammatoires et vasculaires. Ainsi, en l’absence de méthodes substitutives adaptées, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été limité à celui nécessaire pour obtenir une validation statistique des résultats expérimentaux. Il a été déterminé de manière à permettre la mise en évidence d’une différence statistiquement significative de 30 % d’un principal paramètre étudié, l’aire de fibrose hépatique. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques adaptés aux effectifs. Ce choix permet de garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier la fibrose et le développement du cancer du foie. Ce modèle présente également l’avantage de permettre l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous utilisons notamment des souris dans lesquelles le gène AhR, impliqué dans la réponse au stress cellulaire, est inactivé uniquement dans les cellules des vaisseaux sanguins du foie (cellules endothéliales). Cette inactivation est ciblée grâce à un système génétique permettant de supprimer ce gène uniquement dans ce type cellulaire, sans modifier les autres tissus de l’organisme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs des expériences. Dans les procédures visant à induire un cancer du foie, les souris recevront une injection unique d’un composé chimique (DEN) ou d’un produit contrôle à l’âge de 15 jours. Ce moment est choisi car le foie est encore en développement et les cellules se divisent activement, ce qui favorise l’apparition de modifications nécessaires à l’initiation de tumeurs. À l’âge adulte (8 semaines), certaines souris recevront des injections répétées de d’un autre composé chimique (CCl4) ou du produit contrôle afin d’induire une fibrose du foie, c’est-à-dire une accumulation excessive de tissu cicatriciel. Enfin, dans toutes les procédures, un polluant environnemental (B[a]P) ou son véhicule sera administré à partir de l’âge de 8 semaines, correspondant à l’âge adulte chez la souris.  

La souris sylvestre est un rongeur nocturne dont la reproduction varie avec la durée du jour, ce qui vaut à cette espèce d'être retenue pour un projet sur la pollution lumineuse. 312 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux groupes sont exposés sept semaines durant à des LED allumées la nuit, avec une prise de sang par semaine sur souris consciente, soit sept prélèvements par individu. Une partie des cerveaux sera prélevée pour des études ultérieures, et le porteur annonce que les corps des souris surnuméraires et de celles n'ayant subi que des prises de sang seront congelés puis mis à disposition des enseignants et des responsables d'animalerie de l'université pour des travaux pratiques d'anatomie comparée.

Objectifs

Chez tous les organismes, dont les mammifères, c’est l’horloge biologique interne qui contrôle les rythmes de nombreuses fonctions (sommeil, reproduction, etc.) selon un cycle d’environ 24 heures. Cette horloge est principalement synchronisée par l’alternance naturelle du jour et de la nuit grâce à la lumière, qui influence notamment la production de mélatonine, une hormone impliquée dans le rythme veille-sommeil. Lorsque l’environnement nocturne est éclairé artificiellement, comme avec l’éclairage public, ce signal naturel peut être perturbé. Cette pollution lumineuse risque alors de dérégler l’horloge biologique et d’avoir des conséquences sur la santé et le fonctionnement de l’organisme. Dans ce contexte, le projet a pour objectif de reproduire une exposition à la pollution lumineuse pendant la nuit (LAN) chez un mammifère nocturne particulièrement sensible à la durée du jour et de la nuit, la souris Sylvestre, en s’appuyant sur des protocoles expérimentaux réalisés en conditions contrôlées. Plus précisément, il vise à explorer les conséquences d’une exposition nocturne à deux types de lumières LED, l’une majoritairement utilisée dans l'éclairage public nocturne, qui stimule fortement les mécanismes contrôlant l’horloge biologique, et l’autre émettant dans une gamme de longueur d’onde plus élevée, qui pourrait être moins perturbatrice. Le projet a pour objectifs d’évaluer l’impact de la LAN sur : 1) les régions du cerveau qui contrôlent la reproduction ; 2) la production d’hormones liées à la reproduction. Les analyses seront réalisées sur des individus mâles et femelles de la génération F0 exposés ou non, ainsi que chez des individus mâles et femelles de la génération F1 afin de voir si les effets peuvent se transmettre à la génération suivante. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension des effets de la pollution lumineuse et permettront d'élaborer des stratégies d’éclairage respectueuses de la biodiversité pour une meilleure gestion environnementale de la pollution lumineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de 4 ordres principaux. 1/ Les résultats obtenus contribueront à mieux informer les décideurs sur les conséquences écologiques de la pollution lumineuse. En effet, les pouvoirs publics pourront s’appuyer sur les données scientifiques précises obtenues à l’issue de ce projet pour établir des recommandations visant à limiter l’exposition aux LED. Ces recommandations pourraient inclure une meilleure régulation de l’usage des LED en fonction de leur spectre lumineux, en privilégiant des spectres moins perturbateurs pour la biodiversité. 2/ Les mécanismes moléculaires et les systèmes neuroendocriniens sous-jacents au fonctionnement de l’horloge circadienne sont communs à une vaste majorité de vertébrés. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet seront donc susceptibles de concerner d'autres taxons et participeront à la compréhension du rôle de la lumière artificielle la nuit dans la contribution au déclin ou à l'extinction des populations d'espèces. 3/ Au-delà des aspects applicatifs et réglementaires, ce projet aura également un impact sociétal en sensibilisant le grand public aux effets des LED sur la biodiversité. 4/ Ce projet contribuera également à élargir nos connaissances sur les effets de la LAN sur la santé humaine, en particulier sur les rythmes circadiens et les régulations neuroendocriniennes. Les données scientifiques issues de ce projet pourront fournir des éléments contribuant au reclassement de la pollution lumineuse nocturne comme un agent physique à effet perturbateur endocrinien.

Procédures

Deux groupes de souris seront exposées à un traitement luminaux nocturne chacun durant 7 semaines. Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements/souris (vigile) au total. Chaque prélèvement dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables attendus sont les suivants : - Une exposition à des traitements lumineux nocturnes peut entrainer des perturbations comportementales et physiologiques, ce qui constitue l’objet de notre étude ; - Une douleur transitoire hebdomadaire suite à l’introduction de l’aiguille lors des prélèvements de sang ; - Un stress aigu de quelques dizaines de secondes n’induisant pas d’effet à long terme peut être généré dû à la manipulation des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort et pour une partie d’entre eux les cerveaux seront prélevés pour des études ultérieures. Nous congelerons des animaux surnuméraires ainsi que ceux n’ayant subit que des prises de sang et les mettrons à disposition des enseignants chercheurs ainsi des responsables d'animalerie de l’Université pour des TP d'anatomie comparée sur cadavres.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou in silico) ne peut être utilisée pour ce projet qui étudie l’effet d’une exposition à la LAN sur les systèmes neuroendocriniens. Il est donc impératif d’utiliser l’animal entier pour en comprendre les effets et étudier les mécanismes altérés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Afin de limiter le nombre de naissances et d'éviter la production d'animaux surnuméraires, une gestion rigoureuse des accouplements sera mise en place en adoptant une stratégie d'accouplements discontinus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux (3 à 5 souris par cage) en présence de plusieurs enrichissements (abris cartonnés avec matériel de nidification et jouets en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. La surveillance des souris sera accrue lors de leur première semaine d'exposition à la lumière artificielle nocturne. Suite à la prise de sang hebdomadaire, l’animal sera placé dans une cage sans congénère pour récupération et jusqu’à l’arrêt complet du saignement (1-2 min). Un petit morceau de cookie lui sera donné en récompense. Il sera ensuite replacé avec ses congénères. Une grille de score d'évaluation du comportement des souris sera mise en place afin d'identifier précocement d'éventuels points limites adaptés. Un arbre décisionnel guidera la décision de retrait des animaux du protocole lorsque les critères prédéfinis seront atteints afin d'interrompre toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos recherches portent sur les effets d’une exposition à la lumière artificielle nocturne sur les systèmes neuroendocriniens contrôlant la fonction de reproduction chez les mammifères nocturnes. La souris Sylvestre est un excellent modèle animal de référence puisqu’elle est photosensible et présente des variations saisonnières de ses fonctions de reproduction, physiologiques et comportementales. Ces caractéristiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux mâles et des femelles adultes qui seront âgés de 6 à 16 semaines au début des expériences.

Jusqu'à deux injections sous-cutanées par jour, trois injections intraveineuses par semaine, et selon les protocoles une injection dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine : 1 185 souris et 1 185 rats, soit 2 370 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est provoquée par immunisation, avec des atteintes motrices progressives allant de la faiblesse de la queue à une paralysie partielle, une perte de poids et une baisse de la vision. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre la sclérose en plaques et la névrite optique qui l'accompagne. Le porteur donne d'abord des raisons anatomiques et physiologiques au recours aux rongeurs, puis indique que "les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de névrite optique chez le rongeur dans le but de tester des traitements potentiels. La névrite optique (NO) est une inflammation aiguë du nerf optique qui entraîne une altération de la transmission des signaux visuels entre la rétine et le cerveau, elle survient essentiellement chez les jeunes adultes. Les symptômes sont une perte visuelle chez le jeune adulte, des douleurs optiques modérées qui sont amplifiées par des mouvement oculaires, chez l’homme les symptômes ne touchent généralement qu’un seul œil. Dans la majorité des cas la névrite optique est une manifestation de la sclérose en plaque. C'est une maladie auto-immune inflammatoire du SNC, dans laquelle des lymphocytes T et B auto-réactifs dirigés contre des antigènes de la myéline sont activés, traversent la barrière hémato-encéphalique, et produisent une inflammation du nerf optique avec une démyélinisation prédominante. D’autres causes sont possibles comme des maladies infectieuses (virales ou bactériennes), maladies auto-immunes (lupus, sarcoïdoses), toxiques ou médicamenteuses (plomb, tabac, antibiotiques). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour le développement préclinique de candidats médicaments destinés au traitement de la sclérose en plaques (SEP) et de la névrite optique associée en reproduisant de manière concomitante l’activation immune systémique, l’inflammation du SNC, la démyélinisation et la dégénérescence axonale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer au développement de traitements thérapeutiques destinés aux maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et les névrites optiques associées, en évaluant l’efficacité de candidats dans un contexte physiopathologique complexe intégrant inflammation, démyélinisation et atteinte neuro‑axonale.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par injection sous-cutanée en début d'étude, accompagnée de 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile pour stimuler le système immunitaire et déclencher la maladie auto-immune. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Le nombre d’administration varie en fonction du traitement à tester et du mode d’injection, avec un maximum de 2 injections par jour en sous cutané, une administration orale ou intrapéritonéale par jour ou de 3 injections intraveineuses par semaine. Si le produit doit être administré par injection au niveau de l’œil, l’animal sera anesthésié de façon générale et locale. La fréquence sera plus limitée, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle d’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale (EAE) et à l’évolution de la maladie. L’induction par immunisation induit un inconfort transitoire lié aux injections avec une réaction inflammatoire locale modérée au site d’injection. Au cours du développement de l’EAE, les animaux vont présenter des altérations motrices progressives, pouvant aller d’une faiblesse de la queue ou des membres postérieurs à une paralysie partielle, évaluée quotidiennement par un score clinique standardisé. Une diminution de l’activité spontanée et de la mobilité est observée, ainsi qu’une perte de poids liée à l’inflammation systémique et à la diminution de l’activité. La sévérité du projet est classée modérée, des points limites (score moteur, altération de l’état général, perte de poids excessive) permettront d’éviter l’apparition de cas sévères. Les animaux auront également une altération de la vision, d'après notre expérience pour d'autres modèles expérimentaux, les rongeurs qui ont une baisse de la vision, ont un comportement comparable aux animaux naifs, en terme de mobilité dans la cage, acces à la nourriture et l'eau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procedure pour réaliser des évaluation ex vivo des tissus, histologie, immuno marquage, dosage de biomarqueurs.

Remplacement

L’étude de la pathologie et des effets de potentiels traitements nécessitent l’analyse intégrée et dynamique des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central, la barrière hémato‑encéphalique et les cellules gliales, ainsi que l’évaluation de conséquences fonctionnelles et structurelles au niveau du nerf optique et de la rétine. À ce jour, aucune méthode alternative non animale (modèles in vitro, ex vivo, organoïdes, approches in silico) ne permet de reproduire la complexité de la réponse auto‑immune systémique impliquée dans l’EAE, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central, la démyélinisation inflammatoire in vivo, ni l’évolution temporelle des atteintes neuro‑axonales et visuelles. Les approches in vitro et ex vivo disponibles sont utiles pour l’étude de mécanismes cellulaires isolés ou pour le criblage préliminaire de composés, mais ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale et la tolérance d’un candidat médicament dans un contexte physiopathologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse de puissance, sera systématiquement réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Un test statistique sera utilisé pour conclure sur la significativité des résultats. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. L’induction de l’EAE repose sur un protocole standardisé et maîtrisé, largement validé dans la littérature et par l’expérience de l’équipe, afin de limiter la variabilité et la sévérité excessive du modèle. L’accès facilité à l’eau et à la nourriture sera facilité pour les animaux présentant des troubles moteurs (abreuvoirs et nourriture placés à hauteur accessible). La durée d’exposition à la maladie est strictement limitée aux temps nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques. Des points limites précoces et clairement définis sont appliqués (score moteur élevé, perte de poids excessive, altération marquée de l’état général). En cas d’atteinte sévère ou de dépassement des points limites, une mise à mort anticipée est réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs qui seront dejà formés aux techniques de manipulations, d'injections ou d'administration de substances avant d'intervenir sur le projet, ainsi qu' à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, dans le contexte de l’étude de névrite optique. Les rongeurs sont bien caractérisés pour l’étude de l’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale modèle de référence des maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central. Les mécanismes d’inflammation du système nerveux central, la démyélinisation et l’atteinte axonale secondaire du nerf optique est bien documentée. Les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat. Les rongeurs sont adaptés aux administrations systémiques, péri-oculaires et intra-oculaires, potentiellement utilisées dans les tests d’efficacité de traitement. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes. Les publications indiquent un âge de 8 à 10 semaines pour les souris et 8 à 12 semaines pour les rats au moment de l’induction. Le système immunitaire est alors pleinement mature pour obtenir une induction fiable et reproductible. Le système nerveux central est complètement développé et permet d’étudier la démyélinisation, d’inflammation et d’atteinte neuro‑axonale au niveau du nerf optique, de la rétine et de la moelle épinière. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils portent une altération génétique qui supprime la calpaïne-3, une protéine musculaire absente dans une forme de dystrophie des ceintures, et reçoivent des molécules par voie orale ou par injection dans l'abdomen jusqu'à cinq fois par semaine, avec des prélèvements sanguins et des tests fonctionnels qui peuvent léser leurs griffes. Les bénéfices médicaux annoncés, ralentir la maladie et préserver la force musculaire, sont renvoyés au conditionnel et au long terme, quand l'objectif immédiat reste d'identifier quels points du fonctionnement des mitochondries cibler. Sur le remplacement, le porteur explique que la calpaïne-3 n'apparaît qu'à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires et qu'aucune culture cellulaire disponible ne reproduit correctement cette apparition tardive.

Objectifs

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont des maladies génétiques qui touchent surtout les muscles proches du tronc, comme ceux des hanches et des épaules. Elles entraînent une fragilisation progressive des muscles, ce qui peut provoquer une diminution de la force et des difficultés à marcher, se lever ou lever les bras. Selon les familles, la maladie peut se transmettre de différentes façons : parfois un seul parent porteur du gène suffit à transmettre la maladie (forme dite « dominante »), et parfois il faut que les deux parents transmettent chacun une copie du gène modifié (forme dite « récessive »). Dans notre laboratoire, nous étudions notamment la LGMD R1, une forme liée à des anomalies d’un gène appelé CAPN3. Ce gène permet normalement de produire une protéine présente dans le muscle (la calpaïne-3). Quand cette protéine manque ou fonctionne mal, la maladie apparaît, mais les mécanismes exacts qui expliquent comment cela abîme le muscle ne sont pas encore totalement compris. Plusieurs observations réalisées à partir d’échantillons de muscle de patients suggèrent cependant que les mitochondries pourraient être impliquées. Les mitochondries sont des structures présentes dans les cellules, souvent décrites comme des « centrales énergétiques », car elles aident à produire l’énergie nécessaire au bon fonctionnement du muscle. Pour mieux comprendre la maladie et tester des pistes de traitement, un modèle de rat dépourvu de calpaïne-3 (appelé rat C3) a été développé au laboratoire. De manière intéressante, ce modèle présente des anomalies des mitochondries comparables à celles observées chez les patients : leur structure et leur fonctionnement sont altérés. L’objectif final de ce projet est de déterminer si des stratégies visant à améliorer le fonctionnement des mitochondries peuvent apporter un bénéfice thérapeutique en cas de déficit en calpaïne-3. Le projet se déroulera en deux étapes : 1) D’abord, identifier précisément quels « points d’action » dans le fonctionnement des mitochondries seraient les plus utiles à cibler pour améliorer la situation ; 2) Ensuite, tester des molécules connues, déjà autorisées chez l’être humain, et qui agissent sur ces points, afin d’identifier celles qui montrent un effet bénéfique dans le modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment un mauvais fonctionnement des mitochondries peut contribuer à la faiblesse et à la dégradation des muscles dans certaines dystrophies musculaires. Les mitochondries sont de petites structures présentes dans les cellules, souvent comparées à des « centrales énergétiques », car elles produisent l’énergie dont le muscle a besoin pour fonctionner. Les bénéfices attendus sont de deux ordres. D’une part, sur le plan de la recherche, ce travail apportera de nouvelles connaissances sur la façon dont les mitochondries s’adaptent et se régulent dans un muscle malade. D’autre part, sur le plan médical, il aidera à repérer des cibles thérapeutiques pertinentes et à évaluer des traitements potentiels, y compris des molécules déjà autorisées chez l’être humain. À terme, les résultats pourront guider le développement de traitements visant à préserver la force et la fonction musculaires, à ralentir l’évolution de la maladie et, ainsi, à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de dystrophies musculaires

Procédures

Des injections sont réalisées par voie intra-veineuse une seule fois dans la durée de l’étude en moins de 5 minutes sur animaux vigiles. L’administration des molécules se fait soit par injection intra-péritonéale sur animaux vigile (durée d’injection : 1 minute) ou par voie orale (durée d’administration 2 à 5 minutes), maximum 5 fois par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés aux manipulations, aux injections, aux administrations répétées de molécules, aux prélèvements sanguins et aux tests fonctionnels. Ils peuvent se traduire par un stress transitoire lié à la contention, une douleur de courte durée au site d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’un risque limité d’irritation locale. L’administration répétée de molécules par voie orale ou par injection peut également être source d’inconfort. Les tests fonctionnels peuvent exceptionnellement entraîner des lésions locales mineures au niveau des griffes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser des prélèvements d’organes et de muscles.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet sont limitées aux questions qui nécessitent d’observer le muscle dans son environnement réel, avec ses tissus, sa vascularisation, ses interactions biologiques et sa fonction. Ces éléments sont essentiels pour comprendre la maladie et évaluer l’effet d’un traitement, et ils ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec les modèles alternatifs disponibles. Par ailleurs, la calpaïne 3 n’apparaît qu’à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires. À ce jour, nous ne disposons pas d’un modèle in vitro qui reproduise correctement cette expression tardive. Il n’est donc pas possible, à ce stade, d’étudier de façon pertinente les conséquences d’un déficit en calpaïne 3 uniquement sur des cellules en culture.

Réduction

Le choix des gènes et des molécules étudiés dans ce projet repose sur une analyse approfondie de données scientifiques déjà publiées, ainsi que sur l’exploitation de bases de données existantes et d’analyses informatiques. Cette démarche permet de formuler des hypothèses solides avant de commencer les expérimentations et d’éviter de tester un trop grand nombre de pistes de manière exploratoire. Grâce à ce travail préparatoire, seules les pistes les plus pertinentes sont retenues pour être étudiées chez l’animal. Cette stratégie permet de limiter au maximum le nombre de gènes et de molécules à évaluer et contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Le nombre d’animaux par groupe a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux possible. Pour évaluer l’efficacité des approches testées, un indicateur précis de l’atteinte musculaire est utilisé. Les données déjà disponibles montrent que ce paramètre est mesurable de manière reproductible dans le modèle étudié. Les calculs statistiques réalisés indiquent qu’un petit nombre d’animaux par groupe est suffisant pour détecter une amélioration significative de cet indicateur. Les groupes contrôles sont partagés entre plusieurs expériences lorsque cela est possible, afin de limiter encore le nombre total d’animaux utilisés

Raffinement

Les animaux sont suivis tout au long de l’étude : ils sont observés au minimum une fois par semaine et lors des pesées ainsi qu’à chaque administration. En cas d’administration répétée, de perte de poids, d’altération de l’état général ou de signe clinique, la surveillance est renforcée jusqu’à deux fois par jour. Le poids sert notamment à ajuster la quantité de produit administrée. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Pour les administrations sur animaux vigiles, une contention douce et adaptée est utilisée pour limiter le stress et les mouvements, ces administrations peuvent nécessiter une phase d’habituation. Les prélèvements sanguins sont réalisés en privilégiant une technique rapide et la moins contraignante possible (moins de 5 minutes). Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer leur confort. Par exemple, lors des anesthésies, un gel protecteur pour les yeux est appliqué afin d’éviter le dessèchement des tissus. En cas de difficulté à s’alimenter, la nourriture est placée au sol facilement accessible. Enfin, des « points limites cliniques » (critères d’arrêt) sont appliqués grâce à une grille d’évaluation : si un animal présente des signes indiquant qu’il pourrait souffrir ou se dégrader, des mesures appropriées sont prises sans attendre.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons un modèle de rat appelé « rat C3 ». Ce modèle a été développé et bien décrit dans notre laboratoire. Il présente notamment des anomalies au niveau des mitochondries, de petites structures des cellules qui participent à la production d’énergie. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour étudier le rôle des mitochondries dans la maladie et mieux comprendre leur implication dans la dystrophie musculaire des ceintures de type LGMDR1 Dans cette étude, les animaux seront inclus lorsqu’ils sont de jeunes adultes. À partir du sevrage, leurs muscles ont une taille et un fonctionnement suffisamment établis pour permettre des mesures fiables. Cela rend possible l’évaluation de l’impact du fonctionnement des mitochondries sur les muscles squelettiques, dans des conditions proches de la physiologie normale

Une puce implantée sous la peau après incision, une pompe posée sous la peau ou dans la cavité abdominale pour cinq semaines de traitement continu, puis jusqu'à seize heures de tests par souris réparties sur quatre semaines : 2 784 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des crises d'épilepsie leur sont provoquées et leur sensibilité à la douleur est mesurée, deux points dont le porteur indique qu'ils entraînent un inconfort supérieur à celui des autres tests. L'objet déclaré est d'évaluer cinq médicaments déjà autorisés pour d'autres maladies neurologiques et de chercher des mécanismes communs à deux troubles du neurodéveloppement. Les tests restent désignés par leurs catégories, sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés, sans qu'aucun dispositif soit nommé, et l'effectif tomberait à 864 souris si deux mesures de réduction s'appliquaient, écart que le résumé laisse sans commentaire.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau touchent environ 1% de la population mondiale. Ils sont fréquemment associés à des formes d’autisme, des déficits intellectuels et moteurs, ainsi qu’à de l’anxiété, de l’épilepsie et à des altérations des sensations, notamment de la perception de la douleur. À ce jour, ces troubles ne disposent encore que de peu ou pas de médicaments efficaces. Dans le cadre d’un projet financé par le programme Européen sur les maladies rares (ERDERA) réunissant quatre associations de patients et cinq équipes de recherche, ces travaux, dans leur ensemble, visent à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces troubles, à identifier des marqueurs biologiques et à évaluer le potentiel de repositionnement de candidats médicaments dans des modèles murins. Comme ces troubles pourraient partager certains mécanismes communs, le premier objectif de cette étude est de les identifier en étudiant le comportement et le fonctionnement de ces neurones dans deux modèles murins de ces troubles. Le second objectif du projet consiste à évaluer cinq médicaments déjà approuvés pour d’autres maladies neurologiques (repositionnement) afin de déterminer s’ils pourraient également être bénéfiques pour ces deux troubles. Leur efficacité sera étudiée dans ces deux modèles murins en analysant leurs effets sur les anomalies comportementales et sur le fonctionnement neuronal. Les résultats de cette étude, intégrés au projet européen dans son ensemble, permettraient d’envisager un transfert vers la clinique et les patients à court terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau. Cette étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes communs à l’origine de ces maladies et évaluera le potentiel de médicaments déjà utilisés pour d’autres maladies. Dans leur ensemble, ces travaux permettront d’accélérer le développement de médicaments pour les patients concernés par ces troubles.

Procédures

Les souris anesthésiées seront implantées avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Si un des médicaments ne peut pas être donné oralement dans l’eau de boisson ou la nourriture, une pompe placée sous la peau pourra également être utilisée pour administrer certains traitements de façon continue pendant cinq semaines (en même temps que les puces). Si aucune de ces voies n’est possible, une intervention chirurgicale sera réalisée pour placer la pompe dans la cavité abdominale. Les souris seront évaluées sur leurs comportementaux sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés et leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition aux crises d’épilepsie (maximum 60 minutes par jour sur 4 semaines, soit un total de 16 heures par animal).

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. Leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition à l’épilepsie peuvent entraîner un inconfort modéré, supérieur à celui associé aux autres tests comportementaux. L'implantation des puces et des pompes peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. Des crises d’épilepsie seront induites, ce qui pourrait entraîner une diminution de leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Les médicaments seront d’abord testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour les expériences de comportement et tester des médicaments, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection, leur passage dans le cerveau jusqu’à l’observation de leurs effets in vivo.

Réduction

Le nombre de 2784 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé lors de la caractérisation des modèles, le nombre de souris sera réduit de moitié pour l’évaluation des effets des médicaments. De plus, si la dose la plus faible d’un médicament permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 864.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, mais également pour vérifier leur état de santé. Les caractéristiques génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition de signes indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour injecter des puces d’identification ou les pompes libérant le médicament seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. Les études seront réalisées chez des souris adultes âgées de deux mois, ayant un cerveau mature, qui recevront les traitements avec ces médicaments un mois ou une semaine avant l’évaluation de leurs comportements.

Les souris employées ici portent un marquage fluorescent de leurs fibroblastes, obtenu par modification génétique, pour suivre ces cellules pendant que la tumeur se développe. 2 862 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène chimique identique à ceux du tabac, une fois par semaine pendant dix semaines pour les tumeurs du poumon, ou dans l'eau de boisson pendant quatre à quatorze semaines pour celles de la vessie, et pour une partie d'entre elles une greffe de cellules tumorales introduite dans la vessie par un cathéter urétral sous une heure d'anesthésie, une tumeur trop volumineuse pouvant ensuite obstruer l'organe et provoquer une rétention d'urine douloureuse. Toutes sont tuées, celles dont le génotype ne sert pas au projet dès l'élevage, les autres pour l'analyse de leurs tumeurs après la mort.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines. (MODIFICATION) Dans une 3ème expérience, les animaux recevront une greffe de cellules tumorales avec ou sans fibroblastes directement dans la vessie via l’urètre. Ce geste provoque uniquement une gêne à l’animal, ce même geste étant appliqué aux patients atteints de tumeurs de vessie pour apporter localement le traitement anticancéreux[VD1.1]. Les animaux seront anesthésiés au début de l’expérience par injection d’un produit non douloureux pour effectuer ce geste afin de les stabiliser pour le succès de la greffe. Les animaux seront anesthésiés pendant 1 heure le temps de garantir l’entrée des cellules dans la vessie et éviter leur sortie à cause d’une potentielle miction des souris.

Impact sur les animaux

Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre) Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle. (MODIFICATION) Une gêne de courte durée peut survenir suite à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre afin d’injecter les cellules tumorales/fibroblastes dans la vessie.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. (MODIFICATION) En effet, nous avons montré in vitro que les CAFs issus de tumeurs humaines de vessies favorisent l’invasion des cellules tumorales de stade précoce. Cependant, l’invasion vers le muscle de la vessie étant critique cliniquement et ne pouvant être mimée in vitro, il nous est indispensable d’utiliser des modèles murins pour le montrer. De plus, seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’étudier l’origine et le devenir de ces populations au cours de la progression tumorale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici. Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure. MODIFICATION L’utilisation de l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés et suivre la progression tumorale in vivo. Une variabilité interindividuelle est attendue, notamment en raison des différences potentielles de prise de greffe et d’implantation tumorale. Ceci nécessite 15 animaux par groupe afin de pouvoir observer des différences biologiquement pertinentes entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. (MODIFICATION) Les souris opérées seront anesthésiées afin de réduire la gêne liée à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la greffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.