Procédures modérées

Les souris employées ici portent une mutation qui permet de tuer sélectivement leurs propres cellules du foie par injection, et un système immunitaire délibérément détruit, deux conditions qui rendent possible la greffe d'hépatocytes humains. 8 800 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections du composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules par la veine porte, jusqu'à deux puçages sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, le porteur signalant un risque hémorragique accru, une anémie possible et une gêne du transit intestinal. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur l'établissant d'après les études des années antérieures et "en accord avec le plan commercial". 8 600 souris sont tuées, 200 réutilisées dans d'autres projets, dont une formation interne aux gestes techniques sur souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales (e.g. hépatites), le cancer du foie ou des maladies métaboliques telles que la MASH (Metabolic dysfunction-Associated Steato Hepatitis), ou encore de traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines (greffe d’hépatocytes). Dans certains cas, l’humanisation du système immunitaire, en complément d’un foie humanisé, est essentielle pour étudier des processus physiopathologiques complexes, notamment dans le cadre de maladies métaboliques (par exemple, la MASH) ou d’infections virales (comme la dengue). Pour répondre de manière optimale aux objectifs scientifiques et aux questions posées, une double humanisation des souris, incluant à la fois le foie et le système immunitaire, pourra être mise en œuvre. Les cellules hépatiques humaines, et le cas échéant les cellules immunitaires humanisées, pourront ensuite être utilisées pour des études ciblées, comme l’infection par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire fidèlement le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable, bien caractérisée sur le plan génétique. Une souche de souris au foie non humanisé sera utilisée. Elle présenten une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Lorsque nécessaire, il sera également possible d’humaniser simultanément les compartiments hépatique et immunitaire. Cette double humanisation constitue un avantage majeur, car elle permet de modéliser de manière plus fidèle les interactions complexes entre le foie et le système immunitaire humain, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. Par ailleurs, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus spécifiques à l’humain, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, mieux caractérisée sur le plan génétique, et plus acceptable sur le plan éthique que l’utilisation de primates non-humains. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée offrent également des opportunités pour explorer les mécanismes d’insuffisance hépatique et développer des thérapies adaptées à cette pathologie. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’étudier les réponses immunitaires humaines dans des contextes complexes, tels que les traitements antiviraux ou les pathologies impliquant des mécanismes immunitaires.

Procédures

En fonction des besoins expérimentaux, les souris pourront recevoir, sous anesthésie générale, une puce classique et/ou une puce permettant la mesure de la température corporelle. En cas de perte ou de non-fonctionnement de leur puce électronique, elles pourront recevoir une nouvelle puce avec au maximum deux puçages pendant leur durée de vie. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Un maximum de 8 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : -identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -injections : douleur abdominale transitoire, et pour l’agent myéloablatif effets hématologiques possibles -actes chirurgicaux : douleur, risque hémorragique, risque anesthésique, défaut de cicatrisation -traitements et prélèvements sanguins : douleur, hématome ou lésion au point d’injection, anémie en cas de prélèvements répétés -injection d’hépatocytes via la veine porte : gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant, risque hémorragique accru -imagerie sous anesthésie : hypothermie, déshydratation, sécheresse oculaire (gel ophtalmique en prévention).

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Dans le cadre d’une réutilisation et afin d’affiner le protocole, les animaux issus des procédures « Humanisation du foie des souris via injection splénique d’hépatocytes » et « Humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte » pourront être utilisés dans la procédure « Mise au point d’un modèle de double humanisation : foie + système immunitaire » de ce même projet.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de l’implantation d’un patch contenant des hépatocytes humaines, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes de cette procédure, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, cette souche étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines. De plus, cette souche et ses dérivés présentent une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 12 semaines. Il a été néanmoins décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non. L'insuffisance hépatique pourra être induite chez la souris immunodéficiente par exemple par une ou plusieurs injection(s) causant la mort des hépatocytes murins, permettant ainsi d’étudier l’effet d’un implant contenant des hépatocytes.

Une injection de cellules tumorales directement dans le poumon ouvre le protocole, suivie de trente jours d'immunothérapie tous les quatre jours et de séances d'imagerie sous anesthésie. 84 souris mâles de 50 semaines sont utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois au cours du protocole, elles passent un test d'agrippement où le manipulateur les tire par la queue, une course sur tapis roulant poussée jusqu'à l'épuisement et un test d'équilibre au rotarod, pour mesurer si une supplémentation en acides gras et en bêta-hydroxybutyrate combinée à de l'activité physique volontaire renforce l'effet de l'immunothérapie. Le porteur annonce que la tumeur peut provoquer des difficultés respiratoires, de la léthargie et de l'agressivité, et qu'au-delà de trois points limites notables ou d'un point sévère "il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum", sans dire laquelle.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection intra-pulmonaire. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’isoflurane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura lieu en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutes. Le passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

Tonte, abrasion de la peau à la bande adhésive puis au dermaroller, avant l'application de bactéries destinées à provoquer une infection cutanée : 224 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les lésions attendues sont des rougeurs, des papules, des pustules et des croûtes, avec des démangeaisons, certains prélèvements se faisant par introduction d'une aiguille dans la lésion. Chaque chien porte une collerette pour l'empêcher de se lécher et vit en box individuel jusqu'à vingt jours, le temps que l'infection provoquée guérisse d'elle-même, l'ensemble servant à tester des traitements vétérinaires présentés comme une réponse à l'antibiorésistance. Aucun de ces chiens n'est tué : ils rejoignent le "stock des animaux hébergés dans les locaux" de l'établissement et pourront être réutilisés dans une étude suivante après guérison complète et six semaines de repos.

Objectifs

La pyodermite canine représente l'un des motifs de consultation les plus fréquents en médecine vétérinaire. C’est une infection bactérienne cutanée généralement causée par des bactéries. Lorsque la barrière cutanée est altérée, les bactéries commensales de la peau peuvent proliférer de manière excessive, entraînant un déséquilibre bactérien et une réponse inflammatoire locale. La pyodermite peut être classée en plusieurs catégories selon la profondeur de l’infection et les couches de peau affectées (de surface, superficielle ou profonde). Les chiens atteints de pyodermite présentent une barrière cutanée altérée avec la présence de croûtes, de pustules, de papules et des zones d’alopécie. La qualité de vie de l’animal est affectée, il se gratte et se lèche, ce qui peut augmenter l’infection.Les traitements classiques actuels reposent l'utilisation de topiques antiseptiques et l'utilisation d'antibiotiques par voie systémique. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouveaux traitements vétérinaires, pharmaceutiques ou non. Il se décomposera en 2 procédures: mise en place d’un modèle expérimental de pyodermite superficielle imitant étroitement la maladie naturelle et évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements de la pyodermite en vue d’optimiser et de réduire l’utilisation des antibiotiques lorsqu'ils s'avèrent nécessaires. Ces nouveaux traitements permettront également de limiter les conséquences de la maladie et amélioreront de façon notable le bien-être de l’animal. Le modèle de pyodermite sera mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature. Les traitements seront testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de solutions de traitement ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (excipient, volume à administrer…). Les traitements pourront être administrés par voie topique (sprays, mousses, gels, shampooings) ou par voie systémique (alternatives aux antibiotiques ou complémentaires aux antibiotiques)dans le strict respect des bonnes pratiques vétérinaires d’administration.

Bénéfices attendus

La pyodermite canine est due à la prolifération opportuniste de bactéries. Les traitements classiques actuels reposent sur l'administration d'antibiotiques systémiques et l'utilisation de topiques antiseptiques. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. L’objectif de ce projet est de répondre à cette problématique d’antibiorésistance avec des solutions alternatives et/ou complémentaires aux traitements antibiotiques limitant ainsi leur utilisation tout en préservant l’environnement et la santé humaine. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de la pyodermite doit être évaluée sur l’espèce cible présentant les caractéristiques de la maladie. La mise en place et la maitrise d’un modèle de pyodermite superficielle induisant des signes cliniques similaires aux lésions cutanées observés chez les chiens souffrant de pyodermite spontanée, permettront d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions contrôlées, d’améliorer les phases de screening de nouvelles solutions alternatives aux antibiotiques et ainsi de sélectionner plus rapidement et de façon plus sûre, des solutions présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux. Ainsi, ces traitements permettront d’améliorer l’état et le bien-être du chien (plus de grattage, ni léchage) tout en préservant son microbiome cutané. Ces nouveaux traitements participeront à améliorer le confort d'application et d'utilisation par rapport à l'existant (spot on, durée de traitement réduit...).

Procédures

- Préparation des zones de peau à infecter, tonte et légère abrasion avec une bande adhésive (« tape stripping ») puis au dermaroller - 1x par procédure – quelques minutes - Administration du (des) traitements : • Par voie topique par spray, shampooing - 1 à plusieurs applications par semaines pendant 1 à 4 semaines selon le traitement – maximum 5 mn • Par voie générale - 1 administration unique – 1 mn - Prélèvements • Microbiologiques – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement. • Cytologiques, – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement.

Impact sur les animaux

1/L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique requièrent une contention légère et de très courte durée des animaux, pouvant induire un stress léger. 2/L’induction d’une pyodermite superficielle induira des lésions cutanées attendues au niveau des zones testées (ex: érythème, papules/pustules, croûtes). Ces lésions pourront entrainer du prurit et donc être source d'inconfort pour le chien. 3/Prélèvements cytologiques: certains prélèvements pourront se faire par aspiration, c'est-à-dire via l'introduction d'une aiguille dans la lésion cutanée observée, pouvant induire une légère douleur pour l'animal au moment de la ponction. 4/Mobilité réduite: pour éviter le léchage qui pourrait aggraver les symptômes infectieux, les chiens devront porter une collerette pouvant générer un léger stress et inconfort. 5/Afin d’éviter toute contamination croisée entre les chiens (contamination de la zone inoculée par la flore buccale et/ou par les germes de différentes souches qui pourront être appliqués sur les différents chiens), ils seront hébergés en box individuel au maximum 20 jours ce qui pourra induire du stress pour l'animal. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les études de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux pourront être réutilisés dans chaque étude du projet après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, des modèles non animaux (cultures cellulaires, peau reconstruite, systèmes ex vivo) ont été évalués. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la physiopathologie de la pyodermite superficielle canine, reposant sur l’altération de la barrière cutanée, sa colonisation par une bactérie et la réponse immunitaire cutanée de l’hôte. Seul un modèle in vivo permettra d’analyser simultanément et de façon standardisée, l’induction des lésions, la dynamique infectieuse, l’inflammation et la cicatrisation, ainsi que l’évaluation clinique des stratégies thérapeutiques. Des études in vitro pourront être réalisées en amont de chacune des études de cette procédure, comme : - Des études de microbiologie permettront de caractériser les agents infectieux utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées en évaluant leur pathogénicité et leur sensibilité aux solutions de traitement à évaluer. - Des études de toxicité des solutions de traitement à évaluer permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans la mesure du possible, des approches in vitro seront réalisées préalablement afin de sélectionner les meilleurs candidats de traitement pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans la procédure. Les études réalisées dans le cadre de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés et en préservant leur bien-être autant que possible. Dans chaque plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser leur utilisation et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre permettra d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettront de prendre une décision sur l’induction de la pyodermite et /ou le niveau d’efficacité de la/des solutions de traitement évaluées. Chaque animal sera son propre témoin. La littérature nous montre que pour ce modèle, un minimum de 6 chiens est nécessaire pour garantir des résultats exploitables. Les études de mise au point seront réalisées sur 6 à 8 chiens (dans le cas où différentes conditions devraient être étudiées, telles que l'application de germes différents). Lors des études d’évaluation de produits, 3 à 4 groupes de 6 à 8 chiens seront nécessaires (2 groupes contrôles, négatif et positif, 2 groupes traités). Les différentes études seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum.

Raffinement

L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique, requièrent une contention légère des animaux. Les animaux sont habitués à la contention et au contact des expérimentateurs en étant régulièrement manipulés. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, l’état de santé général des animaux sera observé a minima 2 fois par jour pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue est observée. Des observations locales seront également prévues a minima une fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à guérison du chien. Les examens cliniques locaux pourront cependant être plus fréquents si les besoins de l’étude le justifient, par exemple, réalisés quotidiennement tout au long de la phase expérimentale. Le personnel de l’EU en charge des observations est expérimenté et formé à reconnaitre un état de santé ou comportement anormal devant être signalé au vétérinaire de l'étude. Des points limites seront définis et précisés dans chaque plan d'étude. Si un des points limites est atteint, le chien sera immédiatement retiré de la phase expérimentale et traité. Les chiens devant être hébergés en box individuel durant la phase expérimentale (maximum 20 jours), un enrichissement compensatoire avec des jeux spécifiques (tapis de léchage) leur sera fourni. Deux à trois jours après l’induction du modèle, les chiens pourront sortir faire de l’exercice, 2 à 3 fois par semaine, en individuel et sous surveillance. Les interactions avec le personnel qualifié de l’EU seront plus fréquentes qu’en hébergement collectif. Le temps en box individuel sera ajusté à chaque étude de mise en place afin de le réduire au maximum. Il sera discuté pour chaque étude avec la SBEA. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra. Dès qu’un animal sera guéri, il pourra de nouveau être placé en box collectif.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. L’espèce de destination des traitements contre la pyodermite étant le chien et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des chiens dans ce projet. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens adultes sains avec un système immunitaire mature soit des animaux de plus de 10 mois.

Pour mesurer ce que deux versions mutées d'une protéine de la graisse brune changent au métabolisme, 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus. Elles sont soumises à des tests de 150 minutes avec administration de glucose ou d'insuline, à des mesures de composition corporelle en tube de contention, à un régime enrichi en lipides destiné à les rendre obèses, et à des séjours au froid, isolées jusqu'à cinq heures ou en groupe pendant sept jours. Le porteur reconnaît que l'isolement de 96 heures imposé par la mesure de dépense énergétique "va nuire au bien-être des animaux", que les mises au froid génèrent "sûrement le plus grand stress" et que le réveil après chirurgie "peut s'avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés". Face à ces atteintes, le bénéfice annoncé reste au conditionnel : ces souris "pourraient également servir à cribler des molécules d'intérêt" contre le diabète lié à l'obésité chez l'humain.

Objectifs

CCe projet a pour objectif de caractériser les effets potentiels de mutants d’une protéine dans la physiologie et la pathologie, notamment dans la prévention du diabète associé l’obésité, autrement appelé Diabésité. Cette protéine est la protéine majoritairement présente dans le tissu adipeux brun des rongeurs, tissu véritable régulateur du métabolisme énergétique, notamment grâce à la présence en abondance de mitochondries. Cette protéine est localisée dans la membrane interne de ces organites, véritable usine énergétique des cellules. Elle est également retrouvée dans des dépôts adipeux humains sous certaines conditions et notamment chez des volontaires sains plongés dans des eaux froides de manières aigue ou chronique (à 17°C durant 2h ou pendant 6 semaines par exemple). Elle intervient donc dans la chaîne de production de l’énergie. Récemment, des études ont mis en évidence l’importance de mutants de cette protéine, grâce à un modèle de sphéroplastes de levure. Ces premiers résultats in vitro ont permis de sélectionner des mutants de cette protéine qui seront créés par la technologie Crispr-Cas9 (plus communément connue sous le terme de ciseaux moléculaires) puis analysés dans des modèles cellulaires puis murins transgéniques. Ces analyses comprendront divers tests de tolérance à différentes molécules, des mesures de composition corporelle et de dépense énergétique, sur des animaux hébergés à plusieurs températures et dans des conditions nutritionnelles standard ou obésogènes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle in vivo d’une protéine thermogénique majeure du tissu adipeux brun dans la régulation du métabolisme énergétique à travers l’analyse de mutants. Ces modèles murins trangéniques pourraient également servir à cribler des molécules d’intérêt dans le traitement de la « Diabésité » chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux, quelles que soient les procédures réalisées dans l’EU-0549 subiront : 1. des tests in vivo d’une durée de 150 min chacun avec administration de glucose ou d’insuline par voie orale ou par voie intrapéritonéale; 2. des mesures de composition corporelle en début, moitié et fin de protocole, soit 3 x 2 min par animal. Des animaux seront isolés de leurs congénères pour mesure de leur dépense énergétique à trois températures différentes durant une période de 96h. D’autres animaux seront mis au froid isolés pendant une durée maximale de 5h (test aigu) ou gardés ensemble pendant 7 jours (test chronique). Enfin, il est possible que des animaux soient traités de manière aigue ou chronique, selon la nature de la molécule administrée, les traitements sont généralement réalisés de manière quotidienne. Si une chirurgie devait être pratiquée, elle serait unique et durerait environ 1h par animal, de l’administration d’un antalgique en pré-opératoire au réveil. Les tests de sensibilité à l'insuline et de transport du glucose réalisés le jour des nécropsies et nécessitant l'utilisation de molécules radiomarquées seront menés dans l'EU2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées aux expérimentations incluent : les effets liés au régime alimentaire enrichis en lipides, entraînant un risque d’inconfort de l’animal avec une prise de poids qui ne limitera cependant pas sa mobilité ; les prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale lors des tests in vivo provoquent un stress modéré chez les souris; les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant environ 2 minutes seulement ; les gavages peuvent également induire un inconfort voire un léger stress ; les mesures de dépense énergétique nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux ; les mises au froid lors des tests de tolérance ou lors des mesures de calorimétrie indirecte génère sûrement le plus grand stress, le réveil post-chirurgie peut s’avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés, enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre peut entraîner de l’inconfort même si la distance est restreinte et sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt.

Remplacement

Les approches de remplacement ont été soigneusement considérées dans le cadre de ce projet. Les résultats in silico de modélisation de nombreux mutants de notre protéine d’intérêt ont donné lieu à une parution abondante en 2023. Certains de ces mutants ont été testés in vitro dans des sphéroplastes de levure ou après reconstitution de liposomes. Nous allons ainsi nous focaliser sur deux d’entre eux. Comme ces modèles restent insuffisants pour analyser l’importance des mutants de notre protéine d’intérêt dans un contexte physiologique ou pathologique nous allons créer des animaux génétiquement modifiés par la technique « des ciseaux moléculaires » et déclencher par une mise en régime enrichi en lipides et/ou par un hébergement à thermoneutralité des conditions pathologiques.

Réduction

Le principe de réduction a été appliqué dans ce projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des résultats. Le nombre d’animaux par groupe a été basé sur des données existantes de la littérature et des études menées par l’équipe sur d’autres sujets. Une taille de groupe de 32 animaux (16 mâles et 16 femelles répartis dans les deux génotypes d’intérêt) a été retenue pour garantir une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires. Des approches complémentaires ont été mises en œuvre pour réduire encore davantage le recours aux animaux. Par exemple, des analyses bio-informatiques ont été utilisées en amont pour rationnaliser le choix des mutants et orienter les expérimentations in vivo. En cas d’effets imprévus ou de résultats statistiquement concluants obtenus avec un sous-groupe, les expériences seront immédiatement réévaluées pour affiner le nombre d’animaux encore à utiliser.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront regroupés au moment du sevrage de manière à éviter d’avoir un animal isolé durant la durée de la procédure. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements, dont le choix est fait en accord avec la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) des sites (feuille d’essuie-mains, coton, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest, igloo). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet ; ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les injections ou gavages seront réalisées par des personnes formées et compétentes. Enfin, le transport inter-sites n’excèdera pas 10 minutes, les deux sites étant distants d’environ 100 m et sera réalisé selon la charte de transport mise en place par les deux établissements utilisateurs et signée par les expérimentateurs. Les animaux seront transportés dans leur cage d’origine dans des sacs exclusivement prévus à cet effet afin de minimiser leur stress durant cette période.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte grâce à l’utilisation de divers régimes alimentaires, températures d’hébergement, âges et sexes. À travers l’utilisation du modèle Souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une ou des modifications pour le/les gène(s) d’intérêt et en analyser les conséquences phénotypiques. Les souris seront étudiées entres les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure. Les souris seront majoritairement étudiées entre les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure.

17 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une infection pulmonaire bactérienne, virale ou fongique leur est inoculée sous anesthésie par voie oropharyngée, intratrachéale ou intranasale, puis viennent les administrations répétées : jusqu'à quatre gavages par jour pendant quatorze jours, six injections sous-cutanées ou intraveineuses quotidiennes, une injection rétro-orbitaire que le porteur réserve au "dernier recours", et jusqu'à sept prises de sang par tranche de vingt-quatre heures, dont une coupe de l'extrémité de la queue. Une partie des souris est rendue neutropénique, privée d'une part de ses défenses immunitaires, pour mesurer l'action des molécules indépendamment de la réponse de l'organisme. Le porteur répartit ce total entre 1 170 souris pour la mise au point des protocoles et 16 710 pour l'évaluation de candidats médicaments, chiffre qu'il présente comme "une estimation haute".

Objectifs

Le projet a pour objectif principal d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-infectieuses dans des modèles murins d’infections pulmonaires d’origine bactérienne, fongique ou virale. Ces infections représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur fréquence, de leur sévérité et de l’émergence de résistances aux traitements existants. Dans ce contexte, le projet vise à développer et utiliser des modèles animaux pertinents permettant de reproduire les principales caractéristiques physiopathologiques des infections pulmonaires humaines. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, de caractériser leur profil pharmacocinétique et pharmacodynamique (PK/PD), et d’optimiser les schémas thérapeutiques. Plus précisément, les objectifs sont : - d’établir et de caractériser des modèles d’infection pulmonaire robustes et reproductibles, incluant la détermination de l’inoculum, de la cinétique d’infection et des paramètres cliniques associés ; - d’évaluer l’activité anti-infectieuse de candidats thérapeutiques dans ces modèles, en conditions contrôlées, en comparant différentes doses, voies et modalités d’administration ; - de caractériser les relations PK/PD afin d’identifier les paramètres d’exposition associés à l’efficacité ; - d’étudier, lorsque nécessaire, l’influence du statut immunitaire de l’hôte (modèles immunocompétents ou immunodéprimés) sur la réponse au traitement ; - de compléter ces approches par des études d’exposition contrôlée en perfusion, permettant d’atteindre des profils pharmacocinétiques stables et d’affiner la compréhension des relations exposition–effet. Les données générées contribueront à la sélection et à l’optimisation de candidats médicaments, ainsi qu’à la définition de schémas posologiques pertinents en vue des études précliniques réglementaires et du développement clinique. Ainsi, ce projet s’inscrit dans une démarche translationnelle visant à améliorer la prise en charge thérapeutique des infections pulmonaires tout en appliquant les principes de remplacement, réduction et raffinement.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à évaluer de futurs traitements contre les infections pulmonaire d’origine bactérienne, virale ou fongique afin de vérifier leur efficacité. Pour cela, nous utiliseront différents modèles de souris spécialement conçus pour reproduire les principales caractéristiques de l’infection humaine. A long terme, ce travail permettra d’accélérer l’arrivée de nouveaux traitements contre les pneumonies. Les données obtenues aideront à comprendre comment éliminer le plus efficacement l’infection. L’objectif est de développer des thérapies et d’identifier les schémas thérapeutiques plus efficaces, au bénéfice de la santé publique. L’objectif est de développer des thérapies plus performantes que celles actuellement disponibles, répondant notamment aux enjeux liés à l’émergence de résistances antimicrobiennes, et d’améliorer la prise en charge des patients. Ce projet s’inscrit ainsi dans une démarche visant à apporter un bénéfice significatif pour la santé publique.

Procédures

1) Gestes réalisés sur tous les animaux : Pesée (≤2 fois/jour, 30 sec) sur animal vigile. Injection sous-cutanée ou orale (1 fois, 30 sec) sur animal vigile. Inoculation de l’agent infectieux (1 fois, 30 sec) par voie oropharyngée, intratrachéale ou intranasale sur animal anesthésié. Mise à mort par surdose d'anesthésique injectable. 2) Gestes réalisés selon les études : Écouvillonnage buccal (1 fois, 30 sec), vigile ou anesthésié. Prélèvements sanguins (30 sec) : fréquence variable selon l’étude. Sites : veine submandibulaire (anesthésié), veine caudale ou coupe terminale de l’extrémité de la queue (≤7 fois/24h, ≤20 µL/prélèvement). Administration de composés thérapeutiques (fréquence adaptée aux propriétés du composé, conforme à la réglementation) : Sur animal vigile : gavage (≤4/j jusqu’à 14 jours puis ≤2/j), intrapéritonéal (≤2/j jusqu’à 7 jours), sous-cutané (≤6/j), intraveineux caudal (≤6/j sur 24h puis ≤4/j). Sur animal anesthésié : intradermique (≤2/j), rétro-orbitaire (1/j, en dernier recours), intranasal (≤6/j), intratrachéal (≤2/j), oropharyngé (≤3/j), intramusculaire (≤2/j). Aérosolisation par nébulisation (≤1h, ≤2/j, max 3 jours consécutifs) sur animal vigile afin de limiter le stress lié à la contention répétée.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des souris seront utilisées pour étudier l’infection pulmonaire bactérienne, virale ou fongique et tester de futurs traitements anti-infectieux. Les infections induites peuvent entraîner une altération de l’état de santé des animaux, qui se manifeste le plus souvent par des signes cliniques légers à modérés. Ces signes évoluent généralement progressivement avec le développement de l’infection. Les effets les plus fréquemment observés incluent : - une perte de poids modérée ; - une diminution de l’activité ou de la mobilité ; - un aspect du pelage altéré (poil ébouriffé) ; - une posture légèrement voûtée ; - une diminution de la prise alimentaire ou hydrique, pouvant s’accompagner d’une déshydratation modérée ; - une augmentation de la fréquence respiratoire ou des signes respiratoires légers tels que des sifflements. Les gestes expérimentaux nécessaires (administration de substances, prélèvements ou contention) peuvent également entraîner un stress transitoire, une gêne légère au niveau des sites d’injection ou des irritations locales, notamment lors des administrations par voie respiratoire (intranasale, oropharyngée, intratrachéale ou aérosol). Aucun effet grave n’est attendu avec les candidats médicaments testés sur la base des données préalables disponibles. Toutefois, comme il s’agit de phases précoces de recherche, des effets imprévisibles peuvent survenir occasionnellement, tels qu’une perte de poids plus marquée, des variations de température ou des modifications du comportement. L’ensemble de ces effets reste en majorité de sévérité légère à modérée, et leur durée est limitée dans le temps grâce à une surveillance clinique rapprochée et à la mise en place de mesures adaptées permettant de prévenir toute aggravation de l’état des animaux (cf Annexe 2).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques, quantification de la charge bactérienne/virale/fongique). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux infectés.

Remplacement

Avant d’avoir recours aux animaux, toutes les solutions permettant de les remplacer seront examinées. Des tests in vitro permettront d’évaluer d’abord si les traitements envisagés sont efficaces contre le pathogène ciblé. Ces approches permettent d’identifier les candidats les plus prometteurs et d’éliminer rapidement les molécules inefficaces, évitant ainsi l’utilisation inutile d’animaux. Une analyse des données déjà disponibles dans la littérature scientifique ainsi que des bases de données spécialisées est également réalisée afin d’éviter la duplication d’expériences déjà menées. Des approches complémentaires, telles que la modélisation ou l’utilisation de données pharmacologiques existantes, sont prises en compte lorsque cela est possible. Cependant, certaines questions ne peuvent pas être résolues sans recourir à un modèle animal, notamment celles impliquant les interactions complexes entre un agent infectieux et l’organisme dans son ensemble, ou l’évaluation de l’efficacité d’un traitement dans un contexte physiologique complet. Dans ces situations, l’expérimentation animale reste nécessaire pour obtenir des résultats pertinents et transposables à l’Homme. Lorsque des tests sur animaux sont indispensables, des modèles de souris spécialement développés pour reproduire l’infection seront utilisés, car ils offrent des résultats plus fiables tout en limitant le recours à d’autres espèces. L’ensemble de ces démarches assure que les animaux ne soient utilisés que lorsque cela est réellement nécessaire pour faire progresser les connaissances et le développement de nouveaux traitements.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum grâce à une démarche rigoureuse dès la conception des études. Chaque protocole expérimental est soigneusement défini afin répondre à la question scientifique posée, en utilisant le modèle le plus adapté. Cela permet d’éviter la répétition d’expériences inutiles et de limiter le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’informations sont recueillis chez un même animal, par exemple le suivi de l’évolution de l’infection, l’analyse de biomarqueurs ou la mesure de concentrations de traitement dans le sang ou les tissus. Cette approche permet d’obtenir un maximum de données à partir d’un nombre limité d’animaux. En amont, les traitements potentiels sont systématiquement évalués par des méthodes in vitro (sans animaux), afin de sélectionner uniquement les candidats les plus prometteurs. Cette étape permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés en éliminant les molécules inefficaces avant toute étude in vivo. Les résultats obtenus lors des premières étapes du projet (développement et caractérisation des modèles) sont également utilisés pour optimiser les études suivantes. Cela permet d’ajuster précisément les doses, les durées et les effectifs nécessaires, et ainsi d’éviter l’utilisation d’animaux en nombre excessif. Sur l’ensemble des cinq années du projet, le nombre total maximal d’animaux est estimé à 17 880 souris, réparties entre environ 1 170 souris pour le développement des modèles et 16 710 souris pour l’évaluation des traitements. Ce nombre correspond à une estimation haute intégrant les besoins du projet, et sera ajusté si les données obtenues permettent de réduire les effectifs. L’ensemble de ces mesures garantit une utilisation raisonnée et limitée des animaux, en conformité avec le principe de réduction.

Raffinement

Dans ce projet, des mesures de raffinement sont mises en place à chaque étape afin de réduire au maximum la douleur, la détresse et les contraintes subies par les animaux. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation, en groupes sociaux (3 à 5 souris par cage) avec un environnement enrichi comprenant des abris, des matériaux de nidification et des objets à manipuler. Une période d’acclimatation adaptée est respectée avant toute expérimentation afin de limiter le stress. Le nombre de manipulations est réduit au strict nécessaire et les procédures sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Les interventions potentiellement inconfortables (infection, certaines administrations, prélèvements) sont réalisées sous anesthésie appropriée afin de limiter la douleur. Une surveillance clinique rapprochée est mise en place tout au long des études, avec plusieurs observations par jour. L’état de chaque animal est évalué à l’aide d’une grille de score standardisée (poids, mobilité, posture, respiration, alimentation), permettant de détecter précocement toute dégradation de l’état de santé. Des mesures de soutien sont mises en place dès l’apparition de signes cliniques (alimentation facilitée, hydratation, environnement chauffé). Des critères d’arrêt précoces sont définis afin d’éviter toute évolution vers un état sévère, avec mise à mort si nécessaire. Dans la procédure 3, des mesures spécifiques sont appliquées en lien avec l’utilisation de cathéters implantés et l’administration en perfusion. Les animaux sont fournis déjà cathétérisés. Une surveillance spécifique du site du cathéter est réalisée afin de détecter toute complication locale. En cas de dysfonctionnement ou d’inflammation importante, l’animal est retiré de l’étude. Lorsque la présence du dispositif le nécessite, un hébergement individuel temporaire est mis en place afin de protéger le cathéter, compensé par un enrichissement adapté et une surveillance renforcée. Les études de perfusion étant de courte durée (environ 26 heures), l’exposition aux contraintes est limitée. L’ensemble de ces mesures permet de garantir une amélioration continue des conditions expérimentales et de limiter au maximum l’impact des procédures sur le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche. De nombreux modèles bien établis permettent de reproduire les différentes étapes des infections pulmonaires humaines et d’évaluer à la fois l’action du traitement sur le pathogène et la réponse de l’organisme. Certains modèles utilisent des souris immunocompétentes, permettant d’étudier l’efficacité des traitements dans un contexte proche de la situation clinique. D’autres modèles dits « neutropéniques », dans lesquels le système immunitaire est temporairement affaibli, sont également utilisés. Ces modèles sont considérés comme une référence dans la recherche sur les anti-infectieux, car ils permettent d’évaluer directement l’activité propre des traitements indépendamment de la réponse immunitaire de l’animal. Ils sont particulièrement utiles pour comparer l’efficacité des molécules et mieux comprendre leur mécanisme d’action. Sur le plan pratique et éthique, la souris est un petit animal facile à héberger et à suivre, ce qui réduit le stress et les souffrances. Son utilisation respecte les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) : elle évite de recourir à des espèces plus sensibles, limite le nombre d’animaux nécessaires et permet d’adapter les protocoles pour améliorer leur bien-être. Enfin, la souris est déjà largement utilisée dans la recherche sur les maladies infectieuses, et de nombreux outils et marqueurs sont en place pour étudier la réponse de l’organisme ce qui garantit des résultats fiables et comparables pour la suite du développement de nouveaux traitements. Les souris sont âgées au moins de 6-8 semaines afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Il s’agit donc de rongeurs matures au niveau du système immunitaires.

Infectées par le méningocoque, bactérie que le résumé décrit comme capable de se multiplier dans le sang, 810 souris sont suivies à 5 minutes, 30 minutes et 2 heures après l'inoculation, le prélèvement des organes intervenant à 19 h. Elles subissent au total six injections et deux prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des effets néfastes, le porteur ne retient que le stress et la douleur légère liés aux injections, aux prises de sang et à la contention, sans un mot sur ce que produit l'infection, alors que le projet porte précisément sur les atteintes du cerveau et du cœur qu'elle provoque. Les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever le cœur et par exsanguination pour prélever le cerveau.

Objectifs

La méningite peut survenir suite à une infection bacrtérienne à méningocoques . En France, le taux de mortalité reste élevé à 8% des cas malgré l'existence de traitements. De plus, même en cas d'évolution non fatale, les séquelles sont fréquentes et graves (amputations et atteinte neurologique). Cette bacterié a le pouvoir de se multiplier dans le sang. Le but de ce projet est de comprendre les atteintes de la infection systemique de cette bacterié dans le corps. Les souris seront infectées avec des bactéries, et nous observerons l’évolution de l’infection à 5 , 30 minutes et 2 heures post-infection, après quoi à 19h les organes seront prélevés. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour prélever le coeur et par exsanguination pour le prélèvement du cerveau. Les lésions tissulaires et les infiltrations de cellules immunitaires pourront ainsi être analysées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'étudier les atteintes au cerveau et au coeur lors de l’infection par le méningocoque permettant à terme le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques

Procédures

La souris recevra un total de 6 injections. Deux prélèvements sanguins seront effectués chez la souris.

Impact sur les animaux

Les différentes injections peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées . Le prélèvement de sang peut induire aussi un stress de courte durée. La contention peut induire un stress de courte durée.

Devenir

À l'issue de chaque procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements terminaux indispensables aux analyses histologiques, moléculaires et biologiques des tissus d'intérêt (cœur et/ou cerveau). Ces prélèvements nécessitent le recueil d'organes entiers et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. En conséquence, aucune réutilisation, remise en liberté ou placement des animaux n'est envisageable. Par ailleurs, tout animal atteignant un point limite prédéfini au cours de la procédure sera mis à mort de manière anticipée.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment une infection à méningocoque affecte l’organisme et provoque la maladie. À ce jour, aucun modèle alternatif validé n’est décrit dans la littérature pour étudier ces mécanismes en remplacement de l’animal. Ainsi, afin de mesurer les paramètres métaboliques, le recours à des modèles animaux est nécessaire.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris males et femelles 7-10 semaines sur 5 ans. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faibles possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques et de biologie cellulaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Afin de limiter la douleur de l’animal, une grille de score pour la détermination de points limites a été définie.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d’infection à méningocoque, largement décrit dans la littérature. Des souris âgées de 7 à 10 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est mature et fonctionnel. Cela permettra de mieux comprendre les atteintes lors de l’infection sanguine et pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.