Procédures modérées

2 464 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de 15 à 20 minutes applique du chlorure de fer ou d'aluminium sur l'artère cérébrale moyenne pour provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de la pose d'un cathéter dans la veine caudale et de cinq passages en IRM 7T sous anesthésie jusqu'à J14, avant une laparo-thoracotomie donnant accès au cœur pour une ponction cardiaque. Le porteur annonce une "batterie de test comportementaux indolores" répétée à huit reprises, trois tests par animal, sans préciser lesquels. Les molécules viennent de partenaires industriels et passeront en essais cliniques en cas de résultats encourageants, "avec pour objectif la mise sur le marché dans les années à venir", quand l'occlusion artérielle et la ponction cardiaque terminale sont programmées pour l'ensemble des souris.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 2464 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme, les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ce genre d’évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..). Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux expérimentations et validations réalisées in vitro par les partenaires industriels. Actuellement, il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : kraft, dôme en carton + brique aspen ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Ils seront systématiquement pesés le jour de la chirurgie et le lendemain.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

40 mini-porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour la seconde moitié d'un projet déclaré sur deux établissements. Après implantation de tumeurs cérébrales humaines, chaque animal enchaîne une chirurgie et une imagerie sous anesthésie de trois heures au plus, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, puis deux examens TEP sous anesthésie de quatre heures au plus, l'intubation et la pose d'un cathéter dans une veine de l'oreille venant après une injection intramusculaire de 10 mL décrite comme douloureuse. Le cerveau et les tumeurs sont prélevés après la mise à mort pour caractériser l'expression de l'enzyme ciblée. Sur le remplacement, le porteur écarte organoïdes et organ-on-chip au motif qu'ils modélisent incomplètement les interactions étudiées, et affirme que "L'utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats".

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Porteurs de greffes de tumeurs cérébrales issues de prélèvements de patients, 40 mini-porcs immunodéficients sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une chirurgie cérébrale et une imagerie sous anesthésie plafonnées à trois heures, quatre prises de sang sous anesthésie, puis deux examens d'imagerie nucléaire sous anesthésie plafonnés à quatre heures, avec un risque d'hémorragie et d'œdème cérébral pendant la chirurgie. L'objectif affiché est de valider un radiotraceur permettant de repérer sans biopsie une mutation présente dans certaines tumeurs cérébrales, et le porteur ajoute que les données acquises permettront d'"obtenir des financements" pour une étude chez l'humain. Il justifie le choix de l'espèce par la taille du cerveau, compatible avec la résolution de la caméra, et par une organisation neurochimique proche de celle de l'humain.

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Une chirurgie de 45 minutes implante des cellules tumorales dans le cerveau de souris, suivie de trois mois de traitement, avec jusqu'à trois administrations par jour, douze séances d'imagerie sous anesthésie et six prélèvements sanguins en 24 heures. 7 320 souris, immunocompétentes ou immunodéprimées, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le suivi par imagerie comme une méthode "non invasive pour l'animal et sans douleur", alors qu'il décrit par ailleurs l'injection du substrat bioluminescent et la contention comme pouvant "générer du stress et de la douleur légère". Toutes sont mises à mort en fin d'étude pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes, échantillons qui pourront servir à des études ultérieures.

Objectifs

Les glioblastomes sont des cancers du cerveau dont l’incidence augmente avec l’âge mais qui sont également décrits chez l’enfant et l’adolescent. Ces tumeurs se forment à partir des cellules gliales, des cellules qui soutiennent et protègent les neurones dans le cerveau. Il existe trois types de gliomes : l'astrocytome, l'épendymome et l'oligodendrogliome. Le glioblastome représente la forme la plus agressive ; il correspond à l'évolution d'un astrocytome vers un stade de malignité avancé. Le pronostic de ces cancers reste difficile, et leur localisation dans le cerveau rend l'accès à la tumeur particulièrement complexe pour les médecins. Le traitement actuel repose sur trois approches, chirurgicale pour retirer la plus grande partie possible de la tumeur, radiothérapie, et pour certaines tumeurs, chimiothérapie. L'opération seule guérit rarement le patient et d'autres traitements sont souvent nécessaires. Ces raisons nous poussent à nous consacrer au développement de solutions thérapeutiques innovantes. Notre projet vise à évaluer de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. Le cerveau est protégé par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un mécanisme physiologique qui restreint l'accès de nombreuses substances présentes dans le sang au tissu cérébral dans le but de le préserver. Afin de reproduire fidèlement cette contrainte, nous implantons les cellules tumorales dans le cerveau de souris, par voie chirurgicale. Cette approche permet de recréer la tumeur dans son environnement d'origine et d'en respecter les spécificités biologiques. L'efficacité des traitements à évaluer est mesurée par bioluminescence, une technique d'imagerie de haute précision permettant de détecter des tumeurs invisibles à l'œil nu. Un suivi hebdomadaire et un suivi clinique quotidien est instauré pour suivre l'évolution tumorale durant 3 mois. En parallèle, nous effectuons des analyses sanguines pour identifier des biomarqueurs et réalisons des prélèvements d'organes en fin d'étude afin de confirmer que les molécules modulent effectivement leurs cibles thérapeutiques. Nous testons ces médicaments en monothérapie ou en association avec les chimiothérapies, en optimisant les dosages et la fréquence d'administration. Notre objectif ultime est d'obtenir une régression tumorale partielle ou totale en développant de nouveaux médicaments efficaces, tout en améliorant significativement la qualité de vie des patients atteints de glioblastome.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau candidat médicament, ce type d’étude intervient après les phases de présélection in vitro sur des lignées cellulaires et de modélisation informatique in silico. Des études sont préalablement réalisées pour caractériser la croissance tumorale et définir les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, sélection de la souche de souris, etc.) dans un autre projet que celui-ci. Ces étapes permettent également de déterminer les fenêtres thérapeutiques optimales pour chacune des lignées tumorales constituant nos modèles de pharmacologie. Dans le cadre de ce projet des greffes de tumeurs humaines ou murines sont réalisées chez des souris immunodéprimées afin d’évaluer l’impact du système immunitaire sur nos candidats médicaments sans risque de rejet de greffe mais également immunocompétentes ce qui pourra nous permettre d’évaluer des candidats médicaments sur des tumeurs humaines. L’objectif à court terme est de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un contexte de passage de la barrière hématoencéphalique. Les bénéfices attendus sont : -A court terme évaluer chez la souris l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison pour à moyen terme justifier les choix de dose et de candidats chez l’homme -Etablir une relation entre la quantité de candidat médicaments détecté dans le sang ou la tumeur et l’efficacité observée et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées -Investiguer la persistance d’efficacité du traitement après observation d’une régression tumorale. A plus long terme l’objectif est de mettre à disposition des patients une nouvelle option thérapeutique et d’améliorer leur survie après diagnostic et leur qualité de vie.

Procédures

- Chirurgie : cette chirurgie durera 45 minutes maximum par animal et sera réalisée une seule fois avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, anesthésie, protocole analgésique pré et post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang : Faible volume, tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois pendant environ 20 secondes/souris. Réalisable plusieurs fois sur un même individu (jusqu’à 6 prélèvements maximum/24h). En fonction de l’intérêt, le prélèvement de sang ou la cinétique peuvent être réitérés à 2 semaines d’intervalle, en respectant les recommandations de la structure chargée du bien-être animal (SBEA). - Imagerie sous anesthésie : Une fois par semaine, 12 fois maximum au cours de l’étude. - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration, Exceptionnellement 4 administrations/jour avec dans ce cas un suivi par la structure de bien-être animal), durée de traitement de 3 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et la phase post-opératoire : Stress et douleur modérée durant les 24 premières heures -de la phase de pousse de la tumeur (évaluée durant 90 jours maximum). Stress et douleur légère. L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques (Stéréotypie , trouble locomoteur) liés à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée, ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress légers. - de l’évaluation hebdomadaire par imagerie réalisée après induction d’une anesthésie gazeuse et injection du substrat bioluminescent d’une durée de 20 min à chaque mesure (Stress léger). -des injections nécessaires à l’administration de substrat bioluminescent pour chaque mesure par imagerie et d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri-, post-opératoire, et également lors de la mise à mort : chaque contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent générer du stress et de la douleur légère − de l’administration répétée de candidats médicaments testés. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress et douleur modérée − des prélèvements de sang sur animal vigile. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et une douleur modérée − des signes cliniques observables associés à des effets des composés testés / candidats médicaments étudiés pendant une durée maximale de 3 mois (troubles du comportement, altération de l’état général) qui peuvent générer du stress et une douleur modérée

Devenir

A la fin de chaque étude, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes d’intérêt pour analyse selon la question scientifique posée. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacité et d’engagement de cible.

Remplacement

Ce projet a pour but l’évaluation de l’activité anti-tumorale de composés sur des tumeurs implantées par voie intracérébrale chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau présentant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l’évaluation de l'activité vivo, une sélection in vitro sur culture de cellule sera réalisée, qui a pour objectif de vérifier le passage de la BHE. Les produits capables de passer la barrière seront sélectionnés selon leur devenir dans l’organisme pour être testés in vivo sur des modèles greffés dans le cerveau, site d’origine de la tumeur afin de vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les paramètres pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux et notamment la relation entre le devenir du médicament dans l’organisme et son action biologique.

Réduction

Avant d’être évalués chez l’humain, ces candidats médicaments font l'objet d'une évaluation initiale in vitro en laboratoire, avant d'être testés sur des modèles murins (souris) porteurs de tumeurs. Ces phases de pré sélection in vitro vont permettre d’identifier au préalable les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une efficacité antitumorale in vitro importante afin de ne tester in vivo que les composés prometteurs qui ont les bonnes propriétés. • L’évaluation de la capacité du composé à passer la BHE est également un critère évalué afin de restreindre les composés investigués chez l’animal au strict composé remplissant les critères de passage de la BHE. La tolerabilité de ces composés sera également un critère pris en compte afin de réduire au maximum les composés évalués et donc le nombre d’animaux. • Les conditions et cinétique de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminées au préalable dans un projet dédié et permettent de définir les conditions optimales de greffe, la fenêtre de traitement et le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe après une modélisation statistique rigoureuse. • En fin d’étude, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Des prélèvements de fluides, organes et structures du cerveau seront réalisés également. Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • De plus, afin d’inclure dans les études toutes les souris greffées, nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence pour randomiser les animaux, au fur et à mesure du développement de la tumeur, sur la base d’une croissance tumorale similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Le design expérimental sera revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de souris dans chaque groupe et étude selon la lignée cancéreuse étudiée. L’objectif est d’obtenir des conclusions fiables en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

La procédure de greffe dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie après leur réveil. • Mise en place d’un gel alimentaire nutritif préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie pour habituation des animaux à cet aliment pour une meilleure prise en post chirurgie et tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude via l’utilisation d’une grille de scoring par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe d’altération de l’état général de l’animal, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la structure de bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement pourra permettre de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles et du bien-être des animaux mais également des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans avoir à euthanasier les animaux à chaque temps de mesure.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe dans le site initial de développement du cancer, donc ici dans le cerveau chez la souris, est couramment utilisée dans les études précliniques visant à étudier les cancers du cerveau. La souris constitue en effet un modèle de choix grâce à l’accessibilité pour l’implantation des tumeurs et la maturité précoce du cerveau murin. Les animaux utilisés seront des souris immunocompétentes ou immunodéprimées pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Le phénotype dommageable lié à l’absence génétique de système immunitaire de ces dernières est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie du fait de l’atteinte d’un poids corporel suffisant pour la récupération post opératoire et de la maturité cérébrale adaptée.

528 souris subissent l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie générale, 456 reçoivent trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs, et 120 une injection intracardiaque pour provoquer des métastases cérébrales. 648 souris en tout sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur attend chez les souris porteuses de glioblastome une perte de poids, de motricité et de sensibilité, qu'il annonce limitée à 24 heures par le respect des points limites. L'injection intracardiaque, elle, apparaît dans la liste des procédures sans durée ni mention d'anesthésie, et les séances d'IRM sans nombre ni durée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de vésicules extracellulaires (EV) sur les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. L’objectif dans la première procédure est de déterminer, dans un modèle de glioblastome murin, le mode d’administration le plus pertinent et la dose d’EV les plus efficaces. Puis dans les procédures suivantes, d’analyser l’efficacité des EV dans 3 autres modèles animaux de glioblastome murin ou humain ou métastatique, présentant des spécificités différentes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des EV qui ont montré, par des études précédentes dans d’autres pathologies, leur capacité à améliorer les thérapies actuelles. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces EV lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 528 animaux sont concernés. -Injection intracardiaque pour les 120 animaux des procédures concernées par les métastases cérébrales. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 456 animaux sont concernés. -Injection d’analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Les séances fractionnées de radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Le degré de sévérité de ces interventions est donc léger. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeurs cérébrales et la procédure d’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’utilisation d’un agent anesthésique et l’administration d’analgésiques et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc de sévérités modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée modérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures EV (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. De plus, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait un maximum de 12 animaux par groupe afin d’obtenir une différence significative . Ce nombre d’animaux pourra être revu à la baisse durant l’étude après une analyse statistique séquentielle.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissements des cages. Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 2 à 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Afin d’étudier l’effet des traitements sur les cellules tumorales au sein même de leur microenvironnement, il est nécessaire d’utiliser des modèles murins, les modèles in vitro ne répliquant pas toutes les composantes étudiées (hypoxie, inflammatoire et vasculaire). Les modèles animaux de tumeurs sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la croissance tumorale tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire. Les modèles de tumeur cérébrale murin utilisés repose sur l’implantation de cellules de gliome issues de ces souris immunocompétentes. De plus, l’efficacité du traitement sera évaluée sur des modèles de tumeurs cérébrales humaines et métastases qui seront alors implantés chez des souris immunodéficientes permettant ainsi le développement de la tumeur d’origine humaine. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire.

Jusqu'à dix séances de tests comportementaux, que le porteur qualifie de non invasifs, évaluent la sociabilité, l'anxiété et la mémoire de souris vigiles. 4 080 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 18 administrations de composés, une chirurgie intracérébrale de 45 minutes au plus pour certaines, et des prises de sang. Ces mêmes tests sont ensuite décrits comme une source de stress modéré, liée à "la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables". Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, y compris celles retirées de l'étude après trois jours de douleur manifeste, qui pourront servir à des mises au point de protocoles d'analyse.

Objectifs

Notre cerveau contient des cellules appelées microglies. On peut les comparer à des « gardiennes » du cerveau : elles aident les neurones (les cellules qui transmettent les informations dans le cerveau) à bien se connecter entre eux pendant la croissance, et elles interviennent aussi quand le cerveau doit se défendre, par exemple en cas d'inflammation. Ce projet a pour but de mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent, et quel rôle elles jouent dans le comportement. Des recherches, chez l'animal et chez l'humain, montrent que lorsque les microglies fonctionnent mal, cela pourrait favoriser l'apparition de certains troubles, comme la dépression, l'anxiété, ou l'autisme. Ces cellules semblent aussi jouer un rôle dans la mémoire et dans des maladies comme Alzheimer, ainsi que dans d'autres maladies du cerveau comme la sclérose en plaques. Il est donc important de comprendre comment ces cellules sont contrôlées, et quels sont les éléments, dans leur fonctionnement interne, qui influencent la façon dont le cerveau se construit et s'adapte. Ce projet comporte deux parties. La première partie cherche à comprendre comment la sérotonine, une substance produite par le cerveau qui sert à transmettre des messages entre les cellules, agit sur les microglies pendant les premières semaines de vie, et quelles conséquences cela peut avoir plus tard, à l'âge adulte. Nous regarderons l'effet sur le comportement habituel (par exemple la sociabilité, l'anxiété, la mémoire) et sur la réponse du cerveau face à une inflammation. Pour cela, nous utiliserons des médicaments qui agissent sur la sérotonine, comme certains antidépresseurs bien connus. La seconde partie cherche à comprendre le rôle de certains éléments internes aux microglies, déjà repérés lors d'études précédentes. Pour cela, nous modifierons leur fonctionnement uniquement dans ces cellules, chez des souris, puis nous observerons les conséquences, à la fois sur les microglies elles-mêmes et sur le comportement, en conditions normales et lors d'une inflammation. Ces expériences seront réalisées chez des animaux jeunes et chez des animaux adultes, afin de voir si les effets sont différents selon l'âge. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les microglies et la sérotonine agissent ensemble pour le bon fonctionnement du cerveau, afin, à terme, de mieux comprendre l'origine de certaines maladies psychiatriques humaines.

Bénéfices attendus

La microglie est un acteur essentiel du développement et du fonctionnement du système nerveux central, notamment par son implication dans la mise en place, la maturation et la plasticité des circuits neuronaux. Des altérations précoces de ses fonctions peuvent entraîner des perturbations durables de l’organisation de ces circuits, susceptibles de contribuer à l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Par ailleurs, plusieurs gènes associés à des pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, sont majoritairement exprimés dans la microglie et interviennent également au cours du développement cérébral, suggérant l’existence de liens entre altérations précoces et vulnérabilité ultérieure. Le présent projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la microglie, en particulier en lien avec la signalisation sérotoninergique. Les données obtenues permettront de préciser le rôle de cette interaction dans la formation et le fonctionnement des circuits neuronaux, ainsi que dans la réponse à des stimuli inflammatoires. À court terme, ce projet contribuera à l’acquisition de connaissances fondamentales sur les déterminants moléculaires et fonctionnels de l’activité microgliale au cours du développement et à l’âge adulte. À plus long terme, ces résultats pourraient favoriser l’identification de nouvelles cibles d’intérêt pour la compréhension, la prévention et la prise en charge de pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives. Enfin, le développement et l’utilisation d’approches innovantes, telles que les nanoparticules lipidiques pour la modulation ciblée de l’expression génique dans la microglie, pourraient à terme permettre de limiter le recours à des modèles génétiques complexes, contribuant ainsi à une réduction du nombre d’animaux utilisés en expérimentation.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des administrations de composés pharmaceutiques par différentes voies (injection ou administration orale), de manière ponctuelle ou répétée selon les groupes expérimentaux. Une injection par jour est réalisée sur des animaux vigiles. Le protocole peut comporter jusqu’à 18 administrations successives réparties sur plusieurs semaines. Chaque injection ne dure que quelques secondes. Certains animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs (10 au maximum) permettant d’évaluer leur sociabilité, leur anxiété, leur mémoire. Ces évaluations sont réalisées sur des animaux vigiles et chaque séance dure environ 15 minutes. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale afin d’administrer un composé dans une région précise du cerveau. Cette intervention, réalisée sous anesthésie générale et analgésie-anesthésie locale de la zone concernée par la chirurgie, dure au maximum 45 minutes. Une prise de sang pourra également être réalisée chez certains animaux, soit vigiles lorsqu’il s’agit d’étudier la réaction à un stimulus inflammatoire, soit anesthésiés profondément quand le prélèvement est réalisé en fin d’étude. Les prélèvements durent moins d’une minute. À l’issue des procédures expérimentales, des euthanasies par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale profonde et analgésie seront réalisées afin de permettre les analyses scientifiques nécessaires à l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont : lors des injections, une douleur de courte durée ; lors de l’administration du composé pharmacologique par voie orale, un stress lié à la contention de l’animal et un risque mineur de fausse route ; lors des prélèvements de sang, un risque d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation ; lors des anesthésie générales et analgésies, un risque de détresse respiratoire du fait de l’injection des anesthésiants et analgésiques ; pendant et après la chirurgie, un risque de douleur liée à l’acte d’incision et d’injection. Par ailleurs, les tâches comportementales génèrent un stress modéré, du fait d’un nouvel environnement et de la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables).

Devenir

À l'issue des différentes étapes du projet, l'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié. Cette étape est nécessaire pour permettre les analyses qui constituent le cœur de notre étude. En effet, pour comprendre comment la sérotonine agit sur la microglie, ou comment certains gènes influencent le fonctionnement de ces cellules, il est indispensable d'examiner directement le cerveau des animaux. Ces analyses portent notamment sur l'observation des cellules microgliales elles-mêmes (leur nombre, leur forme, leur état d'activation), sur l'expression de gènes spécifiques dans le tissu cérébral, ou encore sur la structure des connexions entre neurones. Ce type d'examen nécessite de prélever le cerveau, ce qui implique l'euthanasie préalable de l'animal. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative permettant d'obtenir ces informations chez l'animal vivant : les techniques d'imagerie actuelles ne permettent pas d'observer les microglies avec la précision cellulaire et moléculaire requise pour ce projet. Le prélèvement du tissu cérébral post-mortem reste donc l'unique moyen d'accéder à ces données. Par ailleurs, les animaux étant étudiés à différents âges (de la période néonatale à l'âge adulte) afin de distinguer les effets sur le développement du cerveau de ceux observés chez l'animal mature, chaque groupe d'animaux ne peut être analysé qu'à un stade donné : un même animal ne peut donc pas servir de son propre témoin à plusieurs âges, ce qui justifie également le nombre d'animaux prévus dans le projet. L'euthanasie sera pratiquée selon des méthodes conformes à la réglementation en vigueur, choisies pour limiter au maximum toute douleur ou détresse chez l'animal.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales induites par un apprentissage, une mémorisation (de l’association contexte ou stimulation). En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, de l’association contexte ou stimulation (et donc « peur »), comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation de cette association, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, dont on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux processus mnésiques. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées transgéniques permettent de modifier les cellules microgliales pour étudier leur rôle, en invalidant ou en exprimant des gènes spécifiquement dans ces cellules.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique utilisant des tests de puissance a été effectuée. D’une manière générale, nous estimons qu’avec notre type d’expériences où nous comparons différents génotypes, il faut au moins 12 animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par condition expérimentale et/ou génotype pour avoir une puissance statistique correcte. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent bien et soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 4080 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum et ils disposent dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la chirurgie sans réveil, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée, et apportés dans la salle juste pour la chirurgie, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant et après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, enrichissement, injection de solution saline et ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste (dégradation de l’état du pelage, manque d’intérêt pour la nourriture, posture anormale), ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales (optimisation des protocoles d’analyse des cerveaux).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle pour ce projet en raison des grandes similarités entre son cerveau et celui de l'humain, notamment dans le fonctionnement de la microglie et du système sérotoninergique. Les mécanismes que nous cherchons à comprendre – comment ces cellules et cette molécule influencent le développement du cerveau et le comportement – sont largement conservés entre la souris et l'humain, ce qui rend cette espèce particulièrement pertinente pour notre étude. Un autre atout majeur de la souris est la possibilité de modifier précisément son patrimoine génétique. Grâce à des techniques bien établies chez cette espèce, il est possible d'agir sur un gène donné uniquement dans certaines cellules – ici, la microglie – et à un moment précis du développement. Cette précision est essentielle pour notre projet : elle nous permet d'étudier le rôle d'un gène spécifiquement dans le cerveau, sans perturber son fonctionnement dans le reste de l'organisme, ce qui limiterait les effets indésirables et compliquerait l'interprétation des résultats. Aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd'hui d'étudier le cerveau avec un tel niveau de précision. Les interventions seront réalisées à différents âges, depuis les premières semaines de vie jusqu'à l'âge adulte. Ce choix est directement lié à notre objectif scientifique : la microglie et la sérotonine jouent des rôles différents selon le stade de développement du cerveau, et seule une comparaison entre plusieurs âges permet de distinguer les effets propres à la maturation cérébrale de ceux observés chez l'animal adulte déjà formé. Enfin, la souris est une espèce dont les besoins physiologiques et comportementaux sont bien connus, ce qui permet d'adapter au mieux les conditions d'élevage et d'expérimentation afin de limiter autant que possible toute douleur, souffrance ou inconfort durant les procédures.