Procédures modérées

Quarante souris atteintes d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth reçoivent une injection quotidienne pendant quatorze jours, puis passent chaque semaine un test de suspension à une grille inversée et un test de suspension par la queue, avant un déplacement sur tapis roulant à six semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que ces souris ne présentent aucun signe de douleur, et prévoit dans le même temps que tout animal qui aurait mal soit mis à mort par anticipation, les antidouleurs risquant de perturber les résultats des tests. Les 40 souris sont tuées à six semaines pour prélever les nerfs sciatiques et les muscles de leurs deux pattes.

Objectifs

Ce projet vise à développer une thérapie pour une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). La CMT se manifeste dès l’enfance par une faiblesse musculaire, une perte de sensation et des problèmes de coordination, évoluant vers une difficulté motrice chez les adultes. Notre objectif est d’injecter quotidiennement un composé pharmacologique aux souris modèles de la maladie pour atténuer ces symptômes. Nous souhaitons évaluer le potentiel du composé Bis-T-23, car il a montré, dans le contexte de maladies rénales, son efficacité à augmenter l'activité de la protéine qui est déficiente dans notre forme de CMT. Bien que Bis-T-23 soit encore expérimental, il a déjà été utilisé dans d'autres études, et ses conditions pharmacocinétiques chez les rongeurs sont bien documentées. Repositionner ce composé pourrait réduire les coûts et accélérer le développement d’un traitement pour cette maladie qui en est dépourvue.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Il s’agit ici de tester un composé médicamenteux, cette approche pharmacologique est plus facilement transposable à l’Homme en cas de succès de l’étude. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert.

Procédures

Les 40 animaux de l’étude seront injectés quotidiennement (durée d’injection de quelques secondes) pendant 14 jours consécutifs. Le lundi en semaine 3, 4, 5 et 6 les animaux seront pesés puis 2 tests comportementaux seront réalisés : -test de suspension à une grille inversée (durée 3x60secondes) pour évaluer la force musculaire – test de suspension par la queue (durée 5-10secondes) pour évaluer la neurodégénérescence. A 6 semaines, les animaux réaliseront également un déplacement sur tapis roulant (max 60secondes) pour évaluer leur coordination.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées. Le modèle utilisé dans cette étude présente une légère perte de poids, quelques tremblements et des défauts lors du test de hanging ainsi que des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice n’a été notée jusqu’à l’âge de 16 semaines. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 6 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible. De plus, nous ne pourrions pas étudier les bénéfices apportés par le médicament sur l’ensemble de l’organisme, notamment sur la force musculaire et la coordination motrice.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les 2 pattes seront utilisées (2 nerfs sciatiques et 2 muscles) afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage en zone élevage. Après sevrage ils seront hébergés à plusieurs par cage afin d'éviter l'isolement social. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage, avec un accès illimité à la nourriture/boisson. De la nourriture en gel et enrichie sera placée dans les cages afin de faciliter la nutrition des animaux. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Les souris sont pesées une fois par semaine afin de surveiller leur état de santé et de s'assurer qu'il n'y a pas de perte de poids significative, qui pourrait entraîner, le cas échéant, l'arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. La zone d’injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) afin de prévenir l’apparition d’une infection. En cas de douleur au cours de l’étude, les antidouleurs risquant de réagir de manière imprévisible avec le médicament et perturber les résultats aux tests, l’animal sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur la force générale et sur la coordination motrice seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et les bénéfices sur les paramètres décrits ci-dessus ne peuvent être mesurés. Pour augmenter l’activité de la protéine déficiente, nous administrerons un composé pharmacologique pendant 14 jours consécutifs aux souris modèles de la maladie. Nous étudierons les effets de ces injections à 6 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si le médicament est bénéfique.

Une hypercalcémie provoquée par administration d'hormone parathyroïdienne, une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour implanter un dispositif, un jeûne allant jusqu'à vingt heures la veille, un prélèvement de sang par jour pendant cinquante jours au maximum et jusqu'à cinq séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme : 16 macaques cynomolgus vont être soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'hypercalcémie peut entraîner fatigue, tremblements, faiblesse musculaire, vomissements, douleurs abdominales et troubles de la mémoire, et que les effets indésirables des candidats-médicaments ne sont pas prévisibles au démarrage. Il affirme que l'animal reste un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme, et que le macaque a remplacé le chien dans ces programmes. Les 16 macaques survivront au projet et seront réutilisés dans d'autres protocoles si le vétérinaire l'autorise, pour une gravité légère, modérée ou sans réveil.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicament sur la régulation de l’hypercalcémie liée à des troubles parathyroïdiens. En effet, l'hormone parathyroïdienne est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Chez l’homme ce trouble d’hypercalcémie hormono-dépendante peut avoir plusieurs origines : 1/un hyperparathyroïdisme primaire associé à une production excessive d’hormone parathyroïdienne (PTH) par les glandes parathyroïdes du fait de la présence d’un adénome ou de l’hypertrophie d’une glande, 2/une hypercalcémie humorale maligne, provoquée par la production par une tumeur d’un peptide mimant les effets biologiques de la PTH, la PTH-related protein (PTHrP). Les symptômes d’une hypercalcémie prolongée et sévère peuvent être entre autres une fatigue sévère, des douleurs et fragilisations osseuses ou des défaillances rénales. Chez l’homme, dans le cas d’un hyperparathyroidisme primaire, les traitements sont le plus souvent chirurgicaux mais tous les patients ne sont pas éligibles à la chirurgie, et dans le cas d’une hypercalcémie humorale maligne, les traitements sont généralement symptomatiques.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'hypercalcémie, une pathologie humaine touchant 2 millions de patients uniquement pour l'hyperparathyroidie primaire en Europe et aux Etats-Unis dont 20% des patients qui ne sont non éligibles à la chirurgie ou qui sont en récidive post chirurgie, soit près de 380 000-400 000 patients. Du fait de la cible thérapeutique, ces nouveaux médicaments pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental d'hypercalcémie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subiront une intervention chirurgicale (30 min) pour implanter un dispoditif médical, sous anesthésie générale, selon un protocole chirurgical et analgésique maitrisé accompagné d'un suivi postopératoire adapté. Les animaux seront mis à jeun la veille de la chirurgie (maximum 20h). Les différents candidats médicaments seront administrés par voie sous-cutanée (2 min) et différents prélèvements sanguins (2 min) seront réalisés (1 fois par jour pendant 50 jours maximum). Pour le recueil urinaire, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée maximale 24h (5 fois maximum sur 50 jours).

Impact sur les animaux

Une hypercalcémie légère à modérée telle qu'attendue dans ce projet peut entrainer des symptômes aspécifiques tels que la fatigue, tremblement, faiblesse musculaire, constipation, nausées, vomissements, douleurs abdominales, perte de l’appétit ou encore un dysfonctionnement cognitif (troubles de la mémoire par exemple). L'hypocalcémie susceptible d'être induite par le candidat médicament pourra entrainer les mêmes symptômes qu'une hypercalcémie légère. Dans tous les cas, les niveaux de calcémie seront régulés soit par la modulation des doses de PTH/PTHrP, soit par un supplément d'apport en calcium dans la nourriture. Les animaux de ce projet pourront subir une contrainte liée à la privation de nourriture avant la chirurgie, une contrainte liée à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et à l’hébergement individuel suite à la chirurgie pour la récupération post chirurgie, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration des candidats médicaments, de l'anesthésie et des prélèvements sanguins. Les effets indésirables potentiels du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Ils feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux le cas échéant et mettre en place les traitements nécessaires à leur prise en charge.

Devenir

Les animaux seront généralement réutilisés pour d'autres projets si l'état général des animaux (attesté par le vétérinaire) le permet. Le projet suivant sera de gravité sans réveil, léger ou modéré.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le Primate non humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces non rongeur adaptée à ce type de modèle d’étude et n'est utilisé que si les autres espèces non rongeurs ne sont pas appropriées, pour des différences de métabolisme par exemple.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 / par groupe. L’analyse statistique faite sera adpaté au modèle. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • La mise au point de procédures rigoureuses, • La formation du personnel, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages.

Choix des espèces

Le primate non humain a été démontré selon les critères de l’EMA (Europeen Medicines Agency) comme étant l'espèce animale non-rongeur la plus pertinente dans une approche translationnelle par rapport à l'homme pour le développement de traitement de régulation des troubles de la calcémie liés à une hypo ou hypersécrétion de PTH. Des tests ont été réalisés chez le chien et il a été démontré que chez cette espèce, l’effet de la PTH sur le calcium est différent de chez l'homme. En effet, il a été démontré que le singe est moins sensible aux variations de calcémie produites par la PTH, et donc moins sujet au phénomène de toxicité rénale qui est importante chez le chien. Le singe a donc remplacé le chien dans les programmes de développement de traitements visant à corriger les troubles de la calcémie liés à la parathormone. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

15 macaques cynomolgus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, ils reçoivent une injection de thérapie génique dans chaque œil, passent un examen oculaire de trente minutes par semaine pendant au moins trois semaines et subissent deux prélèvements de sang, avant que leurs yeux soient prélevés après leur mise à mort. Le porteur décrit une preuve de concept, dont les retombées annoncées pour les malades de la rétine restent renvoyées au long terme. Le choix du macaque tient à la fovéa, absente chez les rongeurs, les chiens et les porcs, et que le porteur dit ne trouver que chez les simiens.

Objectifs

L'utilisation de thérapies géniques dans le cadre de restauration de vision ont vu un essor depuis les 10 dernières années et est testé aujourd'hui dans plusieurs essais pré-cliniques et cliniques chez l'Homme. Une des causes de ce succès grandissant est l'utilisation de virus adénoassociés (AAV) comme vecteur de ces thérapies. En effet, les AAV permettent d'apporter précisément l'agent thérapeutique dans les cellules d'intérêt. En effet, l'enveloppe de ces petits virus, la capside est l'élément permettant de cibler spécifiquement les tissus à atteindre et plus précisément les cellules (ce qui est appelé le tropisme). Ainsi, en modifiant génétiquement les capsides d'AAV, méthodes actuellement à la pointe de la technologie, il est possible d'administrer des thérapies géniques dans des cellules très spécifiques comme les cellules photoréceptrices de la rétine. Toutefois, les capsides des AAV utilisées aujourd'hui pour des essais cliniques ne sont pas encore capable de migrer efficacement entre l'humeur vitrée de l'oeil et la rétine (membrane limitante interne ILM), ce qui limite les méthodes d'administration à des injections sous-rétiniennes, technique invasive et qui ne permet de limiter l'étendue de distribution de l'agent thérapeutique qu'à la région environnante du site d'injection, pouvant parfois représenter moins de 5 % de la rétine. Un moyen plus adapté pour l'administration d'AAV est l'injection intravitréenne (IVI). Cette méthode classiquement utilisée en médecine humaine et vétérinaire est non seulement moins invasive mais également préventive de toute altération anatomique des tissus rétiniens et environnants. Ainsi, l'objectif de ce projet est d'évaluer des outils de thérapie génique robustes, injectables par voie intravitréenne et migrant de manière efficace dans l'œil. L'objectif plus global quant à lui est d'identifier et de caractériser de nouveaux variants de capsides d'AAV, mieux adaptés aux thérapies géniques in vivo de la rétine humaine, qui seront utilisés dans de futurs essais cliniques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils de thérapie génique ciblant le traitement de maladies touchant le système visuel. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront de base à l'amélioration de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies de la vision.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation d'examens oculaires par: 1 examen réalisé pré-injection puis plusieurs examens d’environ 30 minutes par animal à raison d’un examen toutes les semaines pendant la phase d’incubation (minimum 3 semaines) ; (2) injections intraoculaires de la thérapie génique (une seule injection par oeil d’une durée d’environ 5 min) ; (3) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale ; (4) prélèvement des yeux réalisé sous couverture analgésique et anesthésie profonde suivi de la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, l’injection de l’anesthésique, les contentions répétées (pendant 5-7 jours post injection) pour d’éventuels soins consécutifs à l'injection. Les administrations, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un léger inconfort au niveau de la zone d’injection les jours suivant l'injection et provoquer une légère réaction inflammatoire de la sclère. Sur le plan expérimental, les AAV injectés peuvent engendrer dans de très rare cas une réaction inflammatoire non souhaitée dans l'humeur vitré.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant reçu les AAV seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus oculaires.

Remplacement

Les maladies rétiniennes héréditaires affectent les cellules photoréceptrices de la fovéa et les outils de thérapie génique ciblent ces cellules, c'est pourquoi l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa, structures oculaires cible dans cette étude. De plus, les vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validés in vitro sur des explants rétiniens humains et permettent de restaurer la sensibilité à la lumière. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à plus long terme une application pour des études cliniques chez l'Homme. Ce passage à la clinique nécessite donc cette phase sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. 15 macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans. Ce nombre d'animaux a été défini en fonction d'études similaires réalisées chez le PNH et montrant des résultats positifs quant à l'intégration d'AAV administrés par injection intravitréenne. Les vecteurs ont déjà été évalué sur des modèles rongeurs ainsi que sur des modèles organoïdes et seront injectés dans les deux yeux permettant de réduire ainsi le nombre d'animaux utilisé. Les analyses statistiques qui seront conduites afin de comparer les cellules ayant intégré ou non les AAV permettront de démontrer de manière fiable les résultats obtenus et l'efficacité de l'outil de thérapie génique.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L’ensemble des méthodes expérimentales a été pensé et choisi pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les maladies de la vision humaine pour lesquelles le bénéfice du développement de thérapie génique est le plus porteur concerne les maladies altérants les photorécepteurs de la fovea, partie centrale de la rétine. Cette région de l’oeil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain (PNH) a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de 3 à 5 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.

Les souris de ce projet subissent une biopsie du bout de la queue pour le génotypage, jusqu'à cinq ponctions de sang dans la joue sur animal vigile et, pour une partie d'entre elles, une injection de cellules leucémiques dans la veine caudale. 8 570 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles qui développent la leucémie montrant fatigue et perte de poids quand les cellules cancéreuses dépassent 80 % des cellules du sang. Le porteur écrit qu'une partie des souris issues des croisements sera replacée dans l'élevage pour réduire le nombre d'animaux utilisés, et écrit aussi que tout animal inclus dans l'étude sera mis à mort. Les souris immunodéprimées, précise-t-il, "ne pourraient être remises en liberté" à l'issue du projet.

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers du sang très agressifs qui affectent principalement les enfants et les jeunes adultes. Ces cancers ont souvent un mauvais pronostic. Une des causes fréquentes de cette maladie est l'expression anormale d'une protéine spécifique, trouvée dans 25 à 50 % des cas. Cette protéine collabore avec une autre pour contrôler de nombreux gènes, mais son rôle exact dans la leucémie reste inconnu. Pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouveaux traitements, des souris portant une combinaison de ces deux facteurs seront générées. De plus, le rôle d'un élément régulateur sera recherché grâce au croisement avec un autre modèle de souris transgénique. Dans ces deux modèles l'apparition de la leucémie sera suivie, les cellules et processus impliqués seront recherchés. Enfin, dans un troisième modèle, nous injecterons des cellules contrôles ou leucémiques chez des souris immunodéficientes pour étudier les mécanismes d'émergence de la leucémie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de recréer chez la souris un type de leucémie très fréquent chez les patients. Il nous aidera à mieux comprendre les mécanismes biologiques à l'origine de cette leucémie spécifique et à voir comment les changements moléculaires se développent dans cette maladie. En comprenant mieux ces processus, nous pourrons identifier les partenaires de la protéine clé impliquée et proposer des traitements ciblés pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.

Procédures

- Prélèvement caudal pour génotypage dans les dix jours suivant la naissance des animaux transgéniques : biopsie de la pointe extrême de la queue, 1 fois par animal, dure 2 à 3 secondes. - Prélèvements sanguins dans la veine de la joue sur souris vigile, uniquement pour une partie des animaux, de façon mensuel, hebdomadaire ou bi-hebdomadaire; maximum 5 fois/animaux; prélèvement dure moins d'une minute. - Injection de cellules dans la veine de la queue d'une partie des animaux, 1 fois/animal. L'injection dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

La biopsie caudale et l'injection de cellules dans la veine caudale peuvent entraîner un léger saignement et une douleur légère. Les animaux au phénotype dommageable peuvent développer des signes cliniques dus à la progression de la leucémie lorsque les cellules cancéreuses représentent plus de 80% des cellules sanguines, principalement fatigue et perte de poids. Les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. La contention afin de réaliser les prélèvements sanguins et injections caudales de cellules peut entrainer un stress momentané chez les animaux. Les souris immunodéficientes présentent des altérations génétiques les rendant particulièrement vulnérables aux infections microbiennes.

Devenir

Afin de récupérer les cellules leucémiques toute souris transgénique ou ayant été injectée avec des cellules leucémiques sera mise à mort. Par ailleurs, les souris présentant une immunodepression ne pourraient être remises en liberté à l'issue du projet. Par conséquent, tout animal inclu dans cette étude sera mis à mort l'issue de cette dernière.

Remplacement

Les cellules utilisées en laboratoire pour étudier les leucémies sont différentes de celles trouvées dans le corps humain. Reproduire exactement la manière dont la leucémie se développe en laboratoire est difficile. De plus, il est compliqué d'obtenir suffisamment de cellules leucémiques directement des patients pour les études. Elles sont fragiles et ne peuvent pas survivre très longtemps en dehors du corps. Notre projet vise à comprendre comment la leucémie progresse dans différents organes comme le thymus ou la rate. Puisque nous ne pouvons pas obtenir ces échantillons directement des patients, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour simuler la maladie. C'est la meilleure façon de comprendre les leucémies avant de tester des traitements chez les humains.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaires au projet a été fait en tenant compte des statistiques de transmission de chacun des transgènes. Une partie des animaux issus des croisements n'auront pas le génotype souhaité et seront utilisés comme contrôle ou replacés dans l'élevage dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les effectifs ont été determinés afin d'être analysés avec des tests statistiques adaptés et permettre d'obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis et seront attentivement suivis. Pour prendre soin des souris, elles auront du coton, des bâtonnets de bois et des tunnels rouges pour jouer et construire des nids. Elles vivront en petits groupes pour éviter les disputes et le stress. Quand nous ferons des biopsies pour vérifier leurs gènes, nous désinfecterons leur queue pour éviter les infections et surveillerons la guérison. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec des aiguilles très fines pour limiter la douleur. Les souris ayant un risque de développer une maladie seront suivies par ponction sanguine jugale afin d'anticiper et de prévenir l'apparition du phénotype dommageable induit par la leucémie. Si une souris perd trop de poids, nous lui donnerons de la nourriture spéciale. Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et au moins une fois par semaine par les responsables du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix validé scientifiquement par la littérature pour étudier la leucémie. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres espèces animales pour mimer la leucémie. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet.

Pour montrer qu'un implant posé sur les bulbes olfactifs peut restaurer des sensations d'odeur, 20 brebis vont être rendues anosmiques puis utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Dix subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt sessions d'apprentissage associant une odeur à une récompense sur quatre à huit semaines, avant une chirurgie de deux heures puis deux autres d'une heure. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif, annonce des douleurs post-opératoires, des saignements de nez et des fuites de liquide céphalo-rachidien possibles, et prévoit de tuer les brebis dont les complications seraient sévères.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4). 10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2).• 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection,. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Deux séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse de trente minutes par semaine pendant trois semaines, une injection hebdomadaire dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, neuf pesées et neuf mesures de tumeur au pied à coulisse : 248 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau du flanc gauche. Le projet met au point cinq modèles de cancer rendus luminescents, pour des études d'efficacité qui viendront ensuite. Le porteur explique avoir besoin d'animaux au système immunitaire fortement déprimé pour éviter le rejet des cellules humaines, et retient des souris de cinq à six semaines pour favoriser la prise tumorale.

Objectifs

La dissémination métastatique est une cause majeure de mortalité chez les sujets atteints de cancer. C’est un processus séquentiel dont les principales étapes comprennent le détachement de cellules cancéreuses de la tumeur primaire et l’invasion du tissu de l’hôte, leur pénétration et leur transport dans la circulation, puis leur adhérence à la paroi vasculaire de l’organe cible, leur extravasation et leur prolifération. Un cancer disséminé est le plus souvent résistant aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles car le processus métastatique est détecté tardivement et le microenvironnement des métastases renforce la résistance aux médicaments. Afin d’établir de nouveaux traitements efficaces chez les patients atteints de ces cancers,il est nécessaire de disposer de modèles animaux permettant de localiser précocement les métastases afin de pouvoir par la suite évaluer l’efficacité in vivo des différents traitements anti-cancéreux. L’imagerie du petit animal, désormais reconnue internationalement comme stratégique pour l’innovation comme pour le développement pharmaceutique, est une technologie en pleine expansion. Elle présente de nombreux intérêts, comme la détection précoce des tumeurs et des foyers métastatiques dans l’ensemble de l’animal, évitant le biais des mesures au pied à coulisse où il faut attendre que la tumeur fasse une certaine taille et qui ne permet pas le suivi des métastases.L’imagerie par bioluminescence est une approche basée sur la détection de lumière visible émise par des cellules ou des tissus exprimant la luciférase et peut être utilisée dans des études de croissance tumorale et d’études de la dissémination de métastases. Ce projet vise à développer et évaluer en suivi par imagerie par bioluminescence 5 modèles tumoraux d’indications différentes, métastatiques ou non, modifiés génétiquement afin d’exprimer le gène de la Luciférase puis injectés en sous-cutané dans des souris immunodéprimées. Les données issues de ce travail préliminaire offriront une plus grande précision sur leur localisation, la mesure uniquement des cellules tumorales vivantes (et non du tissu conjonctif) et l’identification des zones de nécrose au sein de la tumeur, procurant des informations précieuses sur la dynamique de progression de la tumeur,l'efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’œuvre dans chaque type tumoral

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de stratégie de développement préclinique. Ce projet permettra par la suite que de nombreux traitements soient testés en clinique.

Procédures

Une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 1 injection intraveineuse à raison d’une par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale à raison d’une par semaine, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale unique, 30 secondes. Au maximum 9 pesées et 9 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 30min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de la tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intrapéritonéal et en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les traitements de référence sont très bien connus dans notre laboratoire et aucun des traitements n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies. Les anesthésies liées à l'imagerie peuvent éventuellement entrainer une hypoventilation,une hypotension ou une baisse de température.

Devenir

L'ensemble des animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis de confirmer la bonne croissance des cellules et l’expression suffisante du gène permettant la bioluminescence des cellules tumorales, mais nous avons à présent besoin de tester notre suivi en imagerie sur un animal vivant et entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion de la luciférine dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et vivant. Pour cette raison nous devons effectuer ces études chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé de la façon suivante : il s'agit d'une étude préliminaire afin de déterminer la faisabilité et la pertinence du suivi ainsi que le nombre d’animaux minimum nécessaire à la réalisation de tests statistiques dans le cadre de nos futures études d’imagerie par bioluminescence. Nous estimons d’après notre connaissance des modèles et la littérature que nous aurons besoin de 8 souris par groupe pour la première procédure, et de 12 animaux par groupe pour la 2e procédure afin de pouvoir comparer l’efficacité du traitement de référence au groupe non traité et ainsi montrer que cette méthode est fiable pour un suivi d’efficacité. Nous utiliserons une analyse statistique afin de déterminer si une différence entre les deux groupes traité et non traité existe. Nous aurons donc besoin selon nos estimations de 248 animaux au total.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont été formés à l’utilisation de l’imager et possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi des modèles utilisés ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse et intrapéritonéale. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique ou anti-inflammatoire sera immédiatement mis en place . Il sera mis à la disposition des souris des cotons pour faire leur nid et des tunnels.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche que nous utiliserons est un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale. Nous priviligierons des souris femelles, mais dans un souci de comparaison de prise tumorale, nous souhaitons inclure, pour 3 lignées de tumeurs non spécifiques des femelles, et des mâles, ainsi nous pourrons complétement exclure ce sexe si pas de résultats comparables avec celui des femelles.

Une partie des souris viendra d'autres protocoles de l'animalerie, où elles étaient déjà vouées à la mise à mort. 336 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ trente minutes pendant laquelle des particules chargées de médicaments et libérables par la lumière sont injectées dans une zone précise du cerveau, puis elle est suivie jusqu'à 28 jours avant d'être tuée. Le porteur affirme que la biocompatibilité de ces particules "ne peut être vérifiée que chez l'animal entier", tout en indiquant n'avoir jamais observé d'effet indésirable sur le comportement ou le tissu cérébral en plusieurs années.

Objectifs

Le projet de recherche dans lequel s'insère le présent projet consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de molécules dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif à long terme de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour plusieurs maladies du cerveau. De nombreuses étapes du projet sont réalisées sans le recours à l'expérimentation animale, en vue de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cependant, la validation de la sécurité biologique de notre technologie nécessite l'utilisation de souris, d'où la présente demande.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, la mise au point de cette technologie permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales de type stéréotaxique (à l'aide d'un atlas anatomique), visant à injecter des médicaments encapsulés dans des zones précises du cerveau. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies à réaliser présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.

Devenir

Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier la biocompatibilité des médicaments encapsulés injectés dans le tissu nerveux, jusqu'à 28 jours après injection. L'issue de la procédure est la mise à mort de l'animal.

Remplacement

Le projet scientifique dans lequel s'insère ce projet prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences du projet ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser les propriétés des particules développées pour le projet, sans avoir recours à l'expérimentation animale. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. A chaque fois que ce sera possible, nous utiliserons pour nos expériences des animaux déjà présents à l'animalerie, issus d'un autre protocole, et qui ne peuvent plus être utilisés différemment (donc destinés à l'euthanasie). Par ailleurs, des expériences de biocompatiblité ont déjà été réalisées avec un suivi longitudinal, chez des animaux suivis pendant une longue période avec de l'imagerie in vivo. Même si cette approche apporte des réponses essentielles, elle n'est pas suffisante pour quantifier avec précision le devenir des particules dans le cerveau, d'où la nécessité du présent projet.

Raffinement

Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les animaux, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les souris seront hébergées par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage. Dans le cas d'un score préoccupant (>9), l'animal sera euthanasié dans les 48h au plus tard si son état ne s'améliore pas malgré les soins délivrés.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, elles peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les outils utilisés (anticorps, microscopes etc.) sont les plus développés (et donc les plus efficients) pour la souris. En outre, nous sommes dans une démarche de ré-utilisation d'animaux déjà présents à l'animalerie pour nos expériences, or l'animal le plus présent dans notre animalerie est de loin la souris (pas de rats ou d'autres animaux actuellement pour notre laboratoire). Nous utiliserons des animaux adultes, car les chirurgies stéréotaxiques sont plus faciles à réaliser chez des animaux déjà adultes. Ainsi, nous utiliserons les animaux entre 8 semaines et 8 mois d'âge.

Anesthésiés, entaillés au dos pour y créer une plaie en dix minutes environ, puis traités par injections intradermiques selon trois calendriers différents, 60 rats passent ensuite trois semaines seuls en cage pour éviter qu'ils ne s'arrachent les pansements. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le projet sert à choisir le rythme d'administration d'un traitement régénératif pour les études d'efficacité qui suivront, chez le rat sain puis chez le rat diabétique. À la fin des trois semaines, le sang est prélevé dans le cœur sous anesthésie profonde, puis les 60 rats sont tués pour prélever la peau et un ensemble d'organes.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de cette étude préliminaire est d’évaluer in vivo chez le rat le schéma de traitement optimal d’un nouveau traitement régénératif sur la cicatrisation de plaies cutanées. Des études in vitro sur des modèles cellulaires, cultures de fibroblastes et de kératinocytes, ont permis de démontrer une activité hyperproliférative cellulaire laissant envisager une régénération accélérée et donc une cicatrisation plus rapide de plaies cutanées, ainsi qu’une activité anti-inflammatoire associée. Ce projet constituera la toute première évaluation in vivo sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ce nouveau traitement régénératif, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués selon 3 schémas de traitement différents afin de déterminer le schéma de traitement optimal pour les études d’efficacité qui seront menées à la suite chez le rat sain puis chez le rat diabétique, avec différentes doses de ce nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif. A l’issue des 3 semaines de l’étude, des dosages hématologiques et biochimiques seront effectués sur un prélèvement de sang effectué en intracardiaque après placement des animaux sous anesthésie générale gazeuse, suivi après leur euthanasie du prélèvement de peau au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’organes pour la réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner le schéma de traitement du nouveau traitement régénératif montrant la meilleure efficacité sur la cicatrisation pour en poursuivre son développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. Les traitements par injections intradermiques, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, engendreront une douleur très localisée au niveau de chaque site d’injection. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 3 semaines, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Procédures

Les 60 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées suivant 3 schémas de traitement différents : 1 seule fois, 1 fois par semaine ou 2 fois par semaine après induction de la plaie cutanée, sous anesthésie générale, en 8 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements seront effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, et engendreront une douleur très localisée et transitoire. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes ouvertes, permettant à chaque rat de voir, sentir et entendre au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 60 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat mâle ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des briques en bois et un tunnel en carton de large diamètre seront placés dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité avec différentes doses du nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif, chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats mâles utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.