Procédures modérées

Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.

Objectifs

La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.

Procédures

Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.

Former le personnel aux gestes techniques de l'établissement passe par 5 000 souris sur cinq ans, soit environ quatre souris par mois et par technicien, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris peut recevoir jusqu'à douze administrations, douze prélèvements sanguins, douze recueils d'urine et douze examens d'imagerie, plus une intervention chirurgicale de cinq à trente minutes, sans qu'aucun produit de recherche ne soit testé sur elle. Passé six suites de gestes, elles sont mises à mort, les souris humanisées au-delà d'un an d'âge, certaines aussitôt après une chirurgie sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de conduire cette formation sur des souris, cette espèce étant la seule utilisée dans les procédures de l'établissement.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’assurer la formation du personnel aux procédures et gestes techniques appliqués dans les procédures expérimentales conduites au sein de l’établissement. Cette formation doit permettre de standardiser et de garantir la qualité des procédures / gestes techniques appliqués aux souris.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de standardiser et de garantir la qualité des procédures / gestes techniques appliqués aux souris afin de contribuer à la qualité / reproductibilité / répétabilité des résultats scientifiques, d’assurer la sécurité du personnel, de réduire au maximum l’impact des procédures expérimentales sur les souris.

Procédures

Dans ce projet, les procédures / gestes techniques suivants pourront être appliqués sur les souris : administration de composés par différentes voies = maximum 12 gestes par souris, durée de quelques secondes à moins de 5 minutes. Réalisation de prélèvements sanguins par différentes voies =maximum 12 gestes par souris, durée de moins de 5 minutes. Réalisation de prélèvements d’urine = maximum 12 gestes par souris, durée de moins de 5 minutes. Réalisation d’examens d’imagerie = maximum 12 gestes par souris, durée de 1h maximum minutes. Réalisation de procédures chirurgicales = maximum 1 procédure chirurgicale par souris, durée de 5 à 30 minutes. Mise à mort des souris : durée de quelques secondes à 7 minutes. Les souris ne recevront que du NaCl ou des capsules vides ; aucun composé de recherche / cellules / fragments de tumeurs ne seront utilisés.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’administration de composés, les prélèvements sanguins, les procédures chirurgicales, les anesthésies prolongées (chirurgies, examens d’imagerie). Les nuisances / effets indésirables peuvent être augmentés dans le cadre de l’apprentissage de nouvelles procédures / de nouveaux gestes techniques par les collaborateurs. La douleur ressentie par les souris peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, des difficultés à se déplacer, une prostration, une modification des expressions faciales.

Devenir

Pour les deux procédures, selon les cas, les souris pourront ou non être euthanasiées à l’issue de la procédure. Les souris humanisées seront généralement euthanasiées passé 1 an d’âge (adaptable en fonction de l’état de santé des souris). Les souris non humanisées pourront être gardées plus longtemps, sous réserve que leur état de santé le permette. Par ailleurs, toute souris ayant atteint la limite de 6 suites de gestes / procédures sera euthanasiée. Des souris issues ayant reçues des gestes sans intervention chirurgicale, pourront être utilisées dans le cadre de la procédure avec intervention chirurgicale, à condition qu’elles aient pleinement recouvré leur état de santé et en respectant la limite du nombre de procédures / gestes autorisés pour chaque souris. Dans certains cas, les souris pourront être euthanasiées immédiatement après la procédure chirurgicale (procédure terminale sans réveil) ou dans les heures / jours suivants le réveil.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de former le personnel aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris dans les procédures expérimentales conduites au sein de l’établissement. Pour répondre à cet objectif, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation de souris par des modèles ex vivo. Toutefois, avant l’application de procédures / gestes sur des animaux vivants, des enseignements théoriques pourront être dispensés et des sessions pratiques sur mannequins ou cadavres issus d’autres projets pourront être mises en œuvre.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet sera réduit au minimum, tout en permettant de répondre aux besoins en matière de formation et en limitant le nombre de procédures / gestes subis par chaque souris à un degré éthiquement acceptable. La majorité des souris utilisées dans le cadre de ce projet seront réutilisées à partir d’autres projets, afin de réduire au maximum le nombre de souris acquises spécifiquement pour la formation du personnel. Le personnel doit être formé à son arrivé mais doit également s’entrainer durant l’année si besoin pour le maintien des acquis. Sur base de 20 personnes amenées à réaliser les gestes, cela représente 1000 souris par an et donc 4 souris par mois par technicien utilisée pour la formation. De plus, ce chiffre permet également de subvenir à la formation de nouvelle procédure mise en place nécessitant un entrainement préalable. Tous les gestes seront effectués dans un premier temps sur cadavre lorsque cela est possible. Compte-tenu de ces paramètres et du nombre d’animaux utilisés en formation les années précédentes, 5000 souris seront utilisées sur 5 ans.

Raffinement

À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. À leur entrée dans le projet, tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus, dans des cages ventilées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (notamment après des procédures chirurgicales). La cage contiendra a minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, hutte en carton ou en plastique, kraft et/ou boules de cotons.

Choix des espèces

L’espèce Souris est la seule espèce utilisée dans les procédures expérimentales appliquées par l’établissement. Afin de garantir la qualité de la formation du personnel de l’établissement et de répondre aux objectifs du présent projet, il est donc indispensable que celui-ci soit conduit avec l’espèce Souris. Les animaux pourront entrer dans le projet à partir de l’âge minimum de 3 semaines. Pour les souris humanisées, les animaux seront gardés dans le projet jusqu’à environ un an d’âge (adaptable selon l’état de santé des souris).

Des rats sains, retenus comme le modèle rongeur "le plus prédictif" en toxicologie, sont les premiers à recevoir les candidats médicaments de ce laboratoire. 2 700 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 pouvant être réutilisés dans un autre projet, les autres tués pour le prélèvement du sang, du liquide céphalorachidien et des organes. Ils reçoivent le composé jusqu'à trois fois par jour pendant quatre semaines, par gavage ou par injection, subissent jusqu'à six prises de sang en 24 heures, un recueil urinaire de dix-sept heures en cage à métabolisme et des examens ophtalmologiques et cardiologiques. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études réglementaires ultérieures, en écartant plus tôt les candidats les moins prometteurs.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif de la recherche et du développement (R&D) de nouveaux candidats médicaments est de développer de nouvelles entités chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique in vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace (pharmacologie) et engendre le moins de toxicité possible (sécurité non clinique). Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans cette demande d’autorisation de projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place préalablement à tout essai clinique chez l’Homme. Lors du développement d’un médicament, il est nécessaire d’évaluer en parallèle : - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres projets) - et la sécurité : à l’aide d’études de toxicologie sur le rat sain (forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et modèle rongeur considéré comme le plus prédictif en toxicologie) (procédures encadrées par la présente DAP). Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître la fenêtre thérapeutique (gradient pour lequel des doses sont à la fois efficaces et non toxiques). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études in vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (tests de neurotoxicité ou d’hépatotoxicité sur des cellules) et in silico (analyse informatique de la toxicité d’un composé pour le génome). Elles sont réalisées chez le rat uniquement pour les candidats médicaments les plus prometteurs qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité, s’ils n’étaient pas encore établis.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisé pour un projet) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ains le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisé pour un projet.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Administration orale : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). • Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une intrapéritonéale unique ou modéré si l’administration intrapéritonéale est réitérée. Pour les autres types d’administration degré léger. • Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cages à métabolisme) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (inférieure à 17h) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). • Administration sous-cutanée (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger). Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet couvre l’ensemble des études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études. S’ajoutent à cela des informations des études de pharmacologie sur l’efficacité des candidats médicaments, permettant de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo

Réduction

Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro / silico avant la mise en œuvre de ce projet. Le nombre habituel d’animaux (4 à 8 animaux/dose avec une mixité conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives Elles sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et de recherche de mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Elles permettent aussi de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact sur le bien-être des animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, etc…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. En cas de protocole particulier (exemple : nouveau schéma d’administration ou suivi d’un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être impliqué pour définir un design expérimental optimal. Enfin, la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les volémies physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat mise en place avant l’apparition des points limites. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (exemple : contention pour administration par injection). L’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Les groupes peuvent être mixtes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire par exemple), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). La durée du recueil urinaire sera limitée à son strict minimum (maximum de 17h). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

1 995 souris vont être infectées par le nez avec un virus de la grippe H1N1, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection leur fait perdre en moyenne 20 % de leur poids entre le septième et le dixième jour, selon le porteur. 135 subissent une seconde infection par une autre souche, 1 755 une injection intraveineuse d'anticorps, 435 trois gavages, 1 575 deux prises de sang, et 180 des injections dans le tibia ou la trachée. Le porteur conclut que "les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux".

Objectifs

À travers l'histoire, l'humanité a été confrontée à plusieurs reprises à des épidémies de virus respiratoires qui se sont propagés rapidement dans le monde entier avant que nous ayons pu développer des vaccins efficaces. Par exemple, la grippe H1N1 a provoqué la mort de 50 millions de personnes lors de la pandémie de grippe espagnole en 1918, et le SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, a déjà causé au moins 7 millions de décès. Ces virus déclenchent des réponses immunitaires importantes dans notre corps, notamment la production d'anticorps comme les IgM, IgG et IgA. Ces derniers, en particulier, sont essentiels pour protéger nos voies respiratoires en neutralisant les virus et en les empêchant de s'attacher aux cellules pulmonaires. Cependant, malgré l'efficacité des vaccins actuels, ils ne parviennent pas à générer des niveaux suffisants d'IgA dans les voies respiratoires. Comprendre comment les cellules produisant des IgA agissent pendant une infection respiratoire est donc crucial. Ce projet se concentre sur cette question, en explorant comment les cellules B qui fabriquent des IgA sont recrutées et quel impact cela a sur notre réponse immunitaire. En utilisant le virus de la grippe H1N1 comme modèle d'infection, et en travaillant avec des souris génétiquement modifiées, les chercheurs cherchent à mieux comprendre comment les cellules IgA influencent notre immunité. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de vaccination contre les maladies respiratoires.

Bénéfices attendus

Même si les IgA sont super efficaces pour protéger nos poumons contre les virus, les vaccins contre la grippe et le SARS-CoV-2 ne stimulent pas assez la production d'IgA dans nos voies respiratoires. C'est pourquoi il est crucial de comprendre comment les cellules qui fabriquent ces IgA agissent pendant une infection respiratoire. Dans ce projet, nous allons nous appuyer sur des découvertes récentes de mon équipe qui montrent que ces cellules sont dirigées vers un type spécifique de cellules immunitaires quand il y a une infection. On va développer des techniques sophistiquées pour comprendre comment les IgA influencent le comportement des cellules immunitaires, comme s'ils leur donnaient des instructions spéciales pour mieux combattre les infections. En comprenant mieux cela, on pourrait améliorer nos stratégies pour développer des vaccins plus efficaces.

Procédures

1) Infection intranasale primaire avec le virus de la grippe souche H1N1 : 1995 souris (1 fois - 1 heure). 2) Infection intranasale secondaire avec le virus de la grippe souche H3N2 : 135 souris (1 fois - 1 heure). 3) Injection par voie intraveineuse d'anticorps avant la mise a mort: 1755 souris (1 fois - 5 minutes). 4) Gavage oral d'un produit chimique pour induire la suppression de gènes dans de l'huile de maïs : 435 souris (3 doses - 20 seconds/dose). 5) Marquage des oreilles: 750 souris (10 seconds). 6) Prelevement sanguin: 1575 souris (2 fois - 20 seconds/fois). 7) Injection intratibiale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 1 heure). 8) Injection intratracheale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 10 minutes). 9) Injection intratracheale des anticorps: 105 souris (1 fois - 10 minutes).

Impact sur les animaux

1) L'infection intranasale par le virus de la grippe induit une perte d'appétit transitoire et une perte de poids moyenne de 20 % entre les 7e et 10e jours de l'infection. 2) Le gavage des animaux s'il est mal fait peut provoquer de la souffrance de l’animal. 3) La petite perforation de l'oreille pour le génotypage peut stresser l'animal. 4) Le prélèvement sanguin chez les animaux, s'il est mal réalisé, peut entraîner des saignements excessifs. 5) Complications de l'injection dans la veine caudale et le dispositif de contention pour l'injection qui peut stresser les souris. 6) L'instillation intratrachéale, si mal réalisée, peut entraîner des problèmes respiratoires chez la souris. 7) L'injection intratibiale peut entraîner une réduction de la motilité chez la souris et causer une certaine douleur pendant la journée de l'injection.

Devenir

Les animaux seront mis a mort a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (poumons, rate et ganglions lymphatiques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse pulmonaire apres l'exposition au virus de la grippe. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B pulmonaires et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre le virus de la grippe. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour calculer la taille de l'échantillon requis, nous utilisons des logiciels, en tenant compte des considérations suivantes: a) puissance du test: 0,8; b) différence de rapport (taille de l'effet) à détecter / SD = 1; c) α = 0,05. d) test t bilatéral. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des T-tests non appariés et One-way anova. Nous allons utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux pour réduire le nombre de souris nécessaires au projet.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront misà disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous pourrons fournir également des aliments semi-solides aux animaux au cours de traitment si necessaire. Nous surveillons les souris après chaque intervention pour nous assurer qu'elles retrouvent leur comportement normal après chaque intervention. Après une infection intranasale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du poids (environ 14 jours). Après injection intra-tibiale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du mobilité. Après instillation intratrachéale : 30 minutes. Après gavage oral : 30 minutes. Après injection intraveineuse : 10 minutes. Après un perçage d'oreille : 1 minute. Nous avons mis en place de points limites pour chaque precedure.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies infectieuses pulmonaires car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 8 à 14 semaines seront utilisées.

Tester des molécules antiépileptiques pour le compte de clients suppose une lignée de rats sélectionnés de génération en génération pour faire des crises d'absence. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers d'entre eux subit une neurochirurgie d'une heure doublée d'une chirurgie abdominale pour la pose de capteurs, puis des enregistrements cérébraux de deux à quatre heures une à deux fois par semaine, des injections pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant 28 jours, et un hébergement en cage individuelle après l'implantation. Le porteur chiffre les effectifs d'après "l'activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années", l'utilisation réelle dépendant de "la demande".

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantesdans le monde. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, une forme généralisée d’épilepsie sera étudiée : l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requière tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes. Puis ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif ; Une étude pharmacologique sur ce modèle a montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients ainsi qu’une aggravation des crises chez le rat avec les mêmes antiépileptiques. Ce modèle, au cours des années, est devenu un modèle de référence pour évaluer les effets soignants et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Le but de se projet est d'identifier les nouvelles molécules pouvant soigner l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l'épilepsie et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Procédures

Environ 1/3 des animaux de ce projet vont subir : - une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. - une chirurgie abdominale (en simultané avec la neurochirugie) pour le placement de capteur - la pose de dispositif sous cutané sous anesthésie générale (1/4 heure) - des enregistrements une à deux fois par semaine pendant 2 à 4 heures. - Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. - des prélèvements sanguins pourront être faits.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Pour se faire la mise à mort des animaux en fin de chaque porcédure est nécessaire

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle vise à étudier des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, les animaux sont traités en plan d'étude croisé (tous les animaux reçoivent toutes les molécules avec à chaque fois une vérification de l’EEG avant une nouvelle administration - chaque animal est son propre contrôle). Chaque animal possède deux voies d’enregistrements permettant ainsi de réaliser les enregistrements même si un canal d’enregistrement devient inexploitable. Pour la procédure 1, nous pouvons l’estimer à 60 lots sur 5 ans (1 lot par mois). Un maximum de 14 rats par lot est prévu. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 120 lots (2x60) de 20 rats sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisé. Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’etude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 2400 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection d’analgésique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 heures après la première injection (0.05 mg/kg, i.p). Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements (= cours de récréation). Les animaux sont rassemblés dans une enceinte fermée avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. La lignée de rats utilisée a été développée en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et cérébrale que l’humain. Les activités neurologiques, visibles lors des enregistrements cérébraux ont des similitudes avec ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fasse sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises apparaissent à partir de l’âge de 30 jours post-natal et sont stables et bien établies à partir de 2 mois d’âge.

Une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, un jeûne de 24 heures, 48 heures d'hébergement individuel, puis deux séries de tests comportementaux sur deux semaines pour mesurer des troubles moteurs, cognitifs et anxieux. 318 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle porte une modification de la protéine Huntingtine, et le porteur annonce qu'il ne devrait provoquer ni point limite ni mort prématurée, tout en prévoyant la mise à mort de tout animal perdant plus de 20 % de son poids. Une chirurgie terminale clôt le parcours, le temps de prélever le cerveau et d'autres organes conservés pour des expériences ultérieures.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, un nouveau modèle a été développé afin de pouvoir étudier une modification de la protéine Huntingtine. Cette modification contribue au phénomène de neurodégénérescence et à la mortalité des neurones dans la maladie de Huntington. L'objectif de ce projet est de comprendre pourquoi et par quels moyens cette modification est toxique.

Bénéfices attendus

La technique utilisée dans ce nouveau modèle pour recréer cette modification de la protéine Huntingtine a déjà été validée sur des cellules en culture. Les résultats prometteurs obtenus sur des cellules en culture doivent désormais être testés et adaptés dans une étude animale. Ce projet a pour but de comprendre ce mécanisme de modification de la protéine Huntingtine et permettra à terme de développer des thérapies afin de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes chez les patients atteints par la maladie de Huntington.

Procédures

Au cours de leur vie, les animaux recevront une injection rétro-orbitale sous anesthésie (durée de l'injection = 30 secondes) puis effectueront au maximum deux séries de tests comportementaux pendant une durée maximale de deux semaines. L'objectif de ces tests comportementaux est de comprendre comment la modification de la protéine Huntingtine engendre des problèmes moteurs, cognitif et anxieux. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie sera pratiquée pour le prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Selon la littérature et des résultats préliminaires, la modification génétique du modèle murin utilisé dans ce projet ne devrait pas entraîner l'apparition de points limites ni de mort prématurée. Cependant, plusieurs effets indésirables peuvent être identifiés : 1) un stress léger lors de la manipulation des animaux afin de les anesthésier une seule fois pendant 5 minutes et de leur administrer un composé permettant de modifier la protéine Huntingtine (durée de l'administration = 30 secondes); 2) un stress modéré lors de la mise à jeun de 24h et 3) un stress modéré lors de l'hébergement individuel des animaux pendant une durée de 48h.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d'obtenir des résultats statistiquement analysables et interprétables. Des résultats sur cellules en culture ont déjà validé ce modèle ce qui a permis de réduire le nombre d'animaux testés dans ce projet. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de l'étude, plusieurs organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal et aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé conformément à la réglementation par l’apparition de stress/douleur selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, arrêt du toilettage). De plus, bien que la procédure soit peu invasive et très rapide (5min), des points limites suffisamment précoces et spécifiquement adaptés à ce projet tels qu'une perte de poids supérieure à 20%, un gonflement de l'oeil suite à l'injection ou tout autres signes de traumatisme seront mis en place. En présence de l'un de ces points limites, nous appliquerons une procédure d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Le modèle murin utilisé ici permet de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptômes neurodégénératifs se développant dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme, les tests comportementaux seront réalisés entre 4 et 7 mois une fois que le réseau neuronal des animaux est mature.

Jusqu'à dix prélèvements sanguins en 48 heures, une ponction de liquide céphalo-rachidien, trois heures d'imagerie et une chirurgie intracérébrale de deux à quatre heures : 100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent aussi jusqu'à six heures en chaise de contention pour la microdialyse et deux séances hebdomadaires de tests comportementaux qui ne sont pas nommés, avec un inconfort attribué à la captivité et au conditionnement, et l'atteinte de seuils douloureux tactiles ou thermiques. Le projet mesure la diffusion de candidats médicaments contre les maladies neurodégénératives et leurs effets sur la sensibilité. Le porteur justifie le recours au primate par sa proximité anatomique avec l'être humain, et présente ce passage avant l'essai clinique comme relevant d'un "principe éthique".

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), du toucher et de la température corporelle. Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.