Procédures modérées
PRP-Dissect Study : L’effet du plasma enrichi en plaquettes sur les sténoses post-dissection sous-muqueuse oesophagienne extensive sur modèle animal
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une dissection sous-muqueuse étendue de l'œsophage, d'une à deux heures sous anesthésie générale, provoque chez chaque animal le rétrécissement que l'étude veut ensuite prévenir. 12 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des points limites destinés à "éviter toute douleur", tout en décrivant des perforations et des hémorragies possibles jusqu'à trois jours après l'intervention, des douleurs, des saignements digestifs, de l'apathie et de la fièvre, puis entre le dixième et le vingtième jour une sténose entraînant vomissements et réduction de l'ingestion. Avant la mise à mort, justifiée par le prélèvement de l'œsophage et par le soulagement des souffrances liées à la sténose, l'animal encore anesthésié pourra servir à la formation d'internes en chirurgie dans le cadre d'un autre projet.
Objectifs
La dissection sous-muqueuse endoscopique (DSM) est une technique largement utilisée pour le traitement des lésions précancéreuses et des cancers superficiels de l'œsophage. Grâce à cette technique, il est possible de traiter ces lésions de manière peu invasive, ce qui permet de préserver l'organe. Ces dernières années, des lésions de plus en plus étendues, , peuvent être enlevées de manière curative par DSM. Cependant, après la DSM, le rétrécissement de l'œsophage (sténose) est une complication majeure (jusqu’à 90 % des cas). Les sténoses post-DSM sont connues pour être complexes et sont plus difficiles à traiter. Cela entraîne une diminution de la qualité de vie pour les patients. Compte tenu de l'utilisation croissante de la DSM, y compris pour les grandes lésions complexes de l'œsophage, la sténose après la DSM est un problème de plus en plus important, avec un impact social et sociétal significatif. Ces dernières années, de nombreuses techniques de prévention et de traitement ont été étudiées, allant de la dilatation répétée à l'utilisation d'endoprothèses métalliques auto-expansives, en passant par l'injection locale de diverses substances médicamenteuses. À ce jour, aucun traitement efficace et durable n'a été identifié pour ce problème important. Nous pensons que l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) après une DSM œsophagienne extensive peut prévenir la sténose. Le plasma riche en plaquettes est préparé à partir d’un prélèvement sanguin du patient, centrifugé, ce qui permet d’augmenter sa concentration en plaquettes. Le PRP est connu pour son effet de stimulation tissulaire et peuvent permettre une cicatrisation plus efficace et plus rapide de la muqueuse, tout en réduisant l'inflammation, empêchant le développement de la fibrose et donc de la sténose. Cette étude préliminaire de faisabilité sera faite sur 12 animaux, qui seront tirés au sort avec un groupe qui sera traité préventivement avec du PRP et un groupe de contrôle.
Bénéfices attendus
Avec cette étude de preuve de concept, nous souhaitons démontrer l'efficacité de l'utilisation du PRP dans la prévention primaire de la formation de sténoses iatrogènes après une DSM oesophagienne extensive. En outre, nous voulons étudier la sécurité associée à l'utilisation du PRP. Nous utilisons également cette étude pour étudier l'application de la PRP dans le traitement secondaire de la sténose de l'oesophage après une DSM extensive. Enfin, cette étude nous permet de mieux comprendre le processus cellulaire/biologique de la cicatrisation et l'effet du PRP sur celui-ci grâce à l'évaluation histopathologique, afin d'identifier éventuellement d'autres objectifs de traitement. L'application ultérieure de ces connaissances à l'homme aura un impact considérable sur l'amélioration du traitement des patients souffrant de maladies de l'oesophage (sténoses peptiques, sténoses anastomotiques).
Procédures
1 dissection sous muqueuse sous anesthésie générale : 1 à 2 h + Deux contrôles par gastroscopie et radiographie : 30 à 60 min
Impact sur les animaux
Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront nourris avec un régime liquide dès le début de l'étude (nuisance légère) avec une habituation préalable 3 jours avant. Les jours -1, +13 et +27 (24 heures avant la procédure endoscopique), ils seront maintenus à jeûn pour la nourriture, ayant uniquement de l'eau enrichie de miel (nuisance modérée). Les animaux peuvent être stressés (nuisance légère) pendant l’induction d’anesthésie liée à chaque phase opératoire. Après la dissection de l'œsophage, le cochon peut ressentir un frottement ou une légère sensation de brûlure dans l'œsophage lorsqu'il mange (nuisance modérée). Une complication inattendue telle qu'une perforation (tardive) ou une hémorragie tardive peut survenir jusqu'à trois jours après l'intervention. L'animal peut présenter des douleurs, des saignements digestifs, une apathie et de la fièvre (nuisance modérée-sévère en fonction de la gravité de la complication). Entre le 10e et le 20e jour, il est possible qu'un animal développe une sténose de l'œsophage. Cela peut entraîner une réduction de l'ingestion et des vomissements (nuisance modérée pouvant devenir sévère sans prise en charge/action). Les complications possibles du traitement par dilatation et injection du PRP sont une perforation/inflammation locale ; ce risque est estimé faible (nuisance modérée). L'animal pourra alors montrer de l'apathie, de la douleur et de la fièvre.
Devenir
À la fin de la période d'étude, tous les cochons seront euthanasiés. Premièrement, pour les soulager des éventuelles souffrances dues au développement de la sténose ; deuxièmement, pour pouvoir prélever l'oesophage en vue d'un examen histopathologique. Néanmoins, avant l'euthanasie, et si cela est possible, l'animal toujours sous analgésie et anesthésie générale, pourra être utilisé à des fins de formation des internes de chirurgie dans le cadre d'un autre projet autorisé. L'animal est ensuite euthanasié.
Remplacement
L'effet du PRP est médié par la libération de multiples facteurs de croissance anabolisants, de protéines bioactives et de molécules d'adhésion cellulaire, qui sont libérées dans la circulation sanguine. L'effet de ce processus après une DSM extensive ne peut être reproduit et étudié dans des modèles ex vivo ou des invertébrés. Le porc étant le plus semblable à l'homme, il constitue le modèle approprié pour ce type d'étude.
Réduction
Sur la base d'un calcul de puissance statistique, un minimum de 10 animaux testés est nécessaire pour évaluer le résultat avec une certitude statistique. Si un animal d'étude est exclu de l'étude en raison d'une circonstance imprévue, il sera remplacé par un autre animal d'étude afin de garantir la puissance du résultat de l'étude. Pour cette raison, nous fournirons 2 cochons supplémentaires qui pourront servir de remplaçants. L'étude était puissante sur le critère d'évaluation principal, à savoir la prévention des sténoses. Étant donné que nous croyons fermement au pouvoir du PRP, les animaux qui développent une sténose au cours de l'étude sont également traités secondairement avec du PRP, ce que nous décrirons comme un résultat secondaire. De cette manière, cette étude nous permet d'explorer deux indications et de maximiser l'utilisation des animaux de laboratoire.
Raffinement
Les cochons sont gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum. De l’enrichissement est mis à leur disposition dans leur enclos afin qu'ils puissent s'exprimer et se comporter normalement. Les cochons ne restent pas seuls dans leur enclos, ce qui permet de ne pas les isoler et d'avoir des interactions normales avec les autres animaux. Au cours de notre étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress des animaux et veiller à ce que leur bien-être soit préservé autant que possible. Toutes les interventions seront effectuées sous anesthésie générale, leur apport nutritionnel sera contrôlé et les animaux seront suivis de près du début à la fin par le personnel soignant, le vétérinaire et l'équipe de recherche. Pour anticiper les nuisances liées à une éventuelle sténose, et assurer une bonne ingestion le plus longtemps possible, une attention particulière sera portée au niveau de la nourriture : les animaux seront nourris avec un régime liquide dès le début de l'étude et pendant toute sa durée. Pour éviter le stress lié à cette alimentation liquide, trois jours sont prévus pour établir une transition progressive vers l'alimentation liquide, de J-4 à J-2. Si nécessaire, un plan d'analgésie est mis en place. Après l'intervention, les cochons se réveilleront dans un environnement calme pour éviter toute agitation. Un traitement par inhibiteur de la pompe à protons sera mis en place comme chez l'homme pour limiter la gêne éventuelle liée à l'intervention. Au vu de la surveillance pluriquotidienne, le développement d'une sténose sera remarqué à un stade précoce et nous nous attendons à une présentation avec des symptômes modérés. Si une sténose est présente, elle sera traitée comme décrit dans le protocole. Un protocole de suivi et de prise en charge de la douleur par un système de scoring et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques sera mis en place. Des points limites avec évaluation des paramètres de suivi seront utilisés afin d’éviter toute douleur.
Choix des espèces
Les porcs sont considérés comme le meilleur modèle d'étude car ils sont connus pour avoir des dimensions similaires à celles des humains. De plus, nous pouvons nous appuyer sur des recherches antérieures menées sur le développement de la formation de sténoses après la DSM dans l'oesophage chez le porc. Un poids d’au moins 45 kg est nécessaire pour avoir un diamètre oesophagien suffisant pour pouvoir réaliser la procédure de DSM qui aboutira au processus de sténose. À l'âge de 4 à 6 mois, ils devraient peser entre 40 et 50 kg. À ce stade de développement le diamètre oesophagien est suffisant pour pouvoir réaliser la procédure de DSM qui aboutira au processus de sténose.
Utilisation de vecteurs dérivés de phages pour modifier génétiquement des bactéries toxigéniques responsables d’infections intestinales sévères
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue parce qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie pour raisons de sécurité biologique, 3 697 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 455 d'entre elles en gravité sévère. Leur microbiote est d'abord détruit par cinq jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson et une injection intrapéritonéale, avant le gavage de bactéries toxinogènes puis des candidats médicaments, avec jusqu'à six prélèvements de fèces par jour pendant deux jours. Les diarrhées décrites, la déshydratation et les douleurs intestinales peuvent durer plusieurs jours, jusqu'à guérison ou atteinte d'un point limite. Le hamster, modèle historique de cette infection, a été écarté parce qu'il est "extrêmement sensible" et présente une forte mortalité, la souris offrant une colonisation intestinale stable et des données déjà accumulées au laboratoire.
Objectifs
Certains agents pathogènes bactériens ont la capacité de coloniser l’intestin humain et de s’y reproduire très efficacement, entraînant des symptômes sévères (diarrhées violentes, perforation de la paroi intestinale…) pouvant engager le pronostic vital du patient. La sévérité de ces infections tient à la production par ces bactéries pathogènes de toxines qui ciblent et détruisent les cellules de la paroi intestinale et du côlon. Pathogènes opportunistes, ces bactéries intestinales entraînent rarement des infections chez les personnes en bonne santé car leur développement est inhibé par les nombreuses bactéries qui colonisent naturellement l’intestin et constituent le microbiote (encore appelé flore intestinale). En revanche, ces pathogènes prospèrent dans l’intestin de personnes affaiblies et/ou dont le microbiote a été perturbé par un traitement antibiotique, les rendant ainsi particulièrement sensibles à l’infection. Malgré la pression considérable que ces bactéries pathogènes exercent sur les systèmes de santé, avec des coûts globaux annuels estimés à plusieurs milliards de dollars, il n’existe à ce jour aucune approche pleinement satisfaisante pour les traiter. En effet, les antibiotiques restent le standard thérapeutique contre ces infections, or ils participent à la perturbation du microbiote intestinal favorisant le développement même de ces pathogènes et sont responsables de l’augmentation continue de l'antibiorésistance, deux facteurs clés favorisant le risque de récurrence des infections. Dans ce contexte, nous développons 2 approches thérapeutiques inédites permettant, après administration par voie orale, de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de les éliminer de manière spécifique sur la base de leur séquence génétique, ou bien de les modifier génétiquement afin d’abolir leur production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont l'avantage unique d’être extrêmement spécifiques : contrairement aux antibiotiques elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et préservent ainsi le reste du microbiote, limitant ainsi le risque de récurrence des infections. L'objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de ces deux approches thérapeutiques dans des modèles murins d’infection par ces pathogènes bactériens intestinaux afin de sélectionner la plus prometteuse en vue d’en faire un médicament et d’organiser des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour aucune approche thérapeutique pleinement satisfaisante pour soigner les infections causées par les bactéries pathogènes intestinales productrices de toxines. En effet, si les antibiotiques demeurent le standard thérapeutique contre ces infections, ils perturbent grandement le microbiote intestinal, un point clé favorisant le développement de ces pathogènes intestinaux. De plus, ils sont responsables de l’augmentation continue du phénomène d’antibiorésistance. De ce fait, les antibiotiques peuvent paradoxalement être contre productifs et favoriser le risque de récurrence des infections chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à tester l'efficacité de 2 modalités thérapeutiques inédites et permettant de combler les lacunes des antibiotiques. La première modalité consiste en un antimicrobien extrêmement spécifique capable de reconnaître et d’éliminer les bactéries pathogènes dans l’intestin sur la base de leur séquence génétique. La seconde fonctionne à la manière d’un produit de thérapie génique et permet de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de le modifier génétiquement afin d’inactiver les gènes responsables de la production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont en commun leur spécificité sans précédent: elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et n’engendrent aucune perturbation du microbiote intestinal. Elles se démarquent donc très nettement des antibiotiques et réduisent le risque de récurrence des infections à ces pathogènes intestinaux. En utilisant des modèles murins de colonisation et d’infection intestinale, ce projet vise à démontrer la capacité de ces 2 approches à éliminer les bactéries pathogènes ou à les rendre inoffensives tout en préservant le reste du microbiote intestinal. Le principal bénéfice en découlant sera le développement d’une stratégie thérapeutique alternative plus performante, plus sûre et plus adaptée au traitement clinique des infections intestinales aux bactéries productrices de toxines que les antibiotiques.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : - Une administration d’antibiotiques via l’eau de boisson (biberon) pendant 5 jours - Une administration d’antibiotique par injection intrapéritonéale (quelques secondes par animal) - Une administration orale par gavage de bactéries puis des candidats médicaments que nous testons (quelques secondes par animal) - Prélèvements de fèces: ils seront effectués au maximum une fois par jour (sauf procédure spécifique: 6 fois par jour pendant 2 jours), en récoltant les fèces excrétées naturellement par les animaux, en les plaçant dans une boite pendant quelques minutes. Il est également attendu que certains animaux infectés présentent une diarrhée et une perte de poids associées à la maladie que nous étudions.
Impact sur les animaux
La piqûre d’aiguille pour l’injection d’un antibiotique entraîne une douleur légère de courte durée. Le gavage oral avec les bactéries ou avec le traitement à tester entraîne une gêne et un stress légers et de courte durée. Les prélèvements de fèces entraînent un stress physique léger et un isolement de courte durée (5 minutes maximum). La maladie étudiée entraîne des symptômes tels que de la diarrhée, et donc une déshydratation légère à modérée, ainsi que des douleurs intestinales légères à modérées pouvant durer plusieurs jours (jusqu’à guérison ou atteinte d’un point limite, tel que décrit dans la section dédiée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, la quasi-totalité de ces animaux seront infectés par des bactéries pathogènes, empêchant toute sortie de l’animalerie pour des raisons de sécurité biologique. Les quelques animaux qui ne seront pas infectés seront tout de même hébergés dans l’enceinte de la même animalerie, et doivent donc aussi être considérés comme potentiellement contaminés.
Remplacement
Les bactéries cibles colonisent l’intestin, où elles produisent des toxines qui entraînent notamment des diarrhées. Un traitement efficace doit donc être capable d’atteindre l’intestin afin d’agir sur ces bactéries. Bien que des modèles in vitro permettent de simuler les conditions gastrique et intestinale et seront utilisés en première intention au laboratoire, seule l’utilisation d’animaux permet de récapituler à la fois les obstacles physico-chimique qui seront rencontrés par notre traitement chez l’homme, mais aussi les conditions physiologiques dans lesquelles ces bactéries cibles seront retrouvées chez l’homme. De plus, bien que la réduction/abrogation de la production des toxines sera montrée préalablement in vitro au laboratoire, un modèle récapitulant les symptômes causées par l’infection avec ces bactéries est nécessaire pour évaluer l'efficacité de notre traitement dans la réduction/abrogation de ces symptômes chez l’homme.
Réduction
Nous effectuerons un grand nombre de tests préliminaires in vitro au laboratoire avant de passer chez l’animal. Ainsi, la diminution et l’abrogation de la production de toxines par les bactéries confrontées à notre traitement seront mesurées in vitro; la stabilité de notre traitement en conditions physico-chimiques physiologiques (acidité de l’estomac, présence d’enzymes digestives) sera mesurée in vitro; la capacité de notre traitement à tuer les bactéries ciblées sera évaluée par culture microbienne au laboratoire. Ces tests préliminaires permettront de réduire au strict minimum les tests devant absolument être effectués sur animaux en les effectuant que sur les candidats médicaments les plus prometteurs. De plus, toutes nos procédures sont construites autour de calculs de puissance statistique, afin de garantir au maximum que les résultats produits puissent répondre aux questions scientifiques, tout en utilisant le juste nombre d’animaux. Nous allons vérifier la colonisation bactérienne (un des indicateurs principaux) dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; cette stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place précédemment, nous permettra de procéder ) des études longitudinales sur un même individu, réduisant ainsi le nombre d’animaux à euthanasier sans perdre des informations essentielles pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront celles classiquement admises, notamment en termes de socialisation (jamais moins de 3 animaux par cage) et d’enrichissement (stick de coton pour nidification); la nourriture et l’eau seront fournies ad libitum (sauf exception la veille au soir d’une administration de traitement oral). Il n’est pas prévu d’isoler des animaux ou de restreindre leur environnement au cours du projet. L’infection par nos bactéries toxinogènes cibles entraînera sous quelques jours des diarrhées dont la sévérité peut évoluer rapidement. C’est pourquoi dans toutes les procédures impliquant des animaux infectés par des bactéries produisant des toxines, nous prévoyons une surveillance accrue des animaux (au minimum 1 fois par jour; voire 2 fois par jour dans les cas des animaux ayant perdu du poids ou peu mobiles), afin d’anticiper l’aggravation des symptômes et le cas échéant de procéder à la mise à mort des animaux pour éviter toute souffrance inutile. Des blocs d’hydrogel et des morceaux de nourriture pourront être fournis au fond de la cage pour les souris pouvant présenter des symptômes les empêchant d’accéder aussi librement que possible à l’eau et la nourriture présents dans le capot de la cage. Un autre moyen de limiter la souffrance animale est d’effectuer les tests de notre traitement en 2 jours maximum (sauf exception). Ainsi, l’expérimentation pourra être terminée avant que les symptômes n’atteignent des niveaux trop élevés. Enfin, nous avons prévu d’utiliser pour la plupart de nos procédures une souche ne produisant pas la toxine majeure de cette bactérie cible; des telles bactéries possèdent encore une toxine mineure avec le même mécanisme d’action, mais dont la dose toxique est 1000 fois moindre que la première. La majorité de nos procédures utiliserons cette souche comme alternative, moyennant certains changements dans la nature de notre traitement, à l’exception des procédures évaluant l’effet du traitement sur les symptômes eux-mêmes, par définition, où l'efficacité devra être démontrée contre les souches sauvages impliquées dans la maladie chez l’homme.
Choix des espèces
De nombreux animaux ont été infectés expérimentalement par la bactérie pathogène que nous étudions tels que hamsters, souris, rats, lapin et cailles, mais aussi des cochons et des singes. Le modèle historiquement utilisé pour étudier la pathologie est le hamster, cependant ce modèle est extrêmement sensible et présente une forte mortalité. Dans ce projet, nous limitons au maximum les souffrances éprouvées par les animaux, en travaillant majoritairement avec des versions fortement atténuées de ces bactéries. Ainsi, la souris devient le modèle le plus simple pour lequel il existe des données de littérature confirmant une colonisation intestinale stable. Nous disposons également de nombreuses données antérieures générées dans notre laboratoire chez la souris sur des candidats médicaments similaires, ce qui bénéficiera au projet. Le modèle souris récapitule également certains des symptômes clés de ces infections bactériennes chez l'Homme; cela nous permettra d'évaluer l'impact de notre traitement sur l'évolution de la maladie. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, typiquement âgés de 6 à 9 semaines en début d’expérimentation. L’âge des animaux en fin d’expérimentation ne dépassera pas 12 semaines, du fait de la durée maximum des expériences prévues dans les différentes procédures. Il faut noter que cet âge maximum n’est pas une limite scientifique, mais simplement un fait lié à la durée de nos expériences. Les individus plus jeunes ou beaucoup plus âgés pourraient être plus sensibles aux toxines produites par nos bactéries cibles, et ainsi développer des symptômes plus sévères, ce qui n’est pas nécessaire pour notre projet, et serait même contre-productif en termes d’obtention de colonisation intestinale stable avec ces bactéries.
Etude du rôle de d’une protéine d’intérêt dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, entrecoupés d'une semaine de repos, 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi une biopsie pour le génotypage et développent, à partir de quatre mois, les troubles cognitifs de leur lignée. Les tests censés mesurer leurs capacités mémorielles ne sont pas nommés, et l'objet du projet se limite à une "protéine d'intérêt" qui n'est pas davantage identifiée, dans un modèle de la maladie d'Alzheimer réparti sur deux établissements. Les souris qui ne portent pas le génotype recherché sont tuées faute d'usage, les autres avant huit mois, pour éviter les souffrances liées à un phénotype dommageable qui apparaît à douze mois et que la lignée a été construite pour porter.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.
Études thérapeutiques contre l’infection par Aspergillus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
9 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales et deux instillations intranasales sous anesthésie, par lesquelles Aspergillus fumigatus leur est inoculé après un traitement qui affaiblit leurs défenses immunitaires, l'infection provoquant poil hérissé, mobilité réduite et perte de poids. Dans la majorité des expériences, les souris sont tuées avant l'apparition des signes d'infection, et celles qui atteignent le score limite sont mises à mort. Le porteur justifie ce recours par le fait que l'effet des molécules à l'étude reste inconnu "à l'intérieur, dans la vie réelle", et qualifie l'expérimentation animale d'"indispensable".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d'identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Il a été démontré que les facteurs humoraux de l'immunité innée sont importants dans l’élimination d'Aspergillus dans les poumons, et certains de ces facteurs disparaissent des poumons chez les patients infectés. L’un de ces facteurs, la protéine surfactante SP-D, a montré un potentiel thérapeutique dans le modèle pré-clinique d’aspergillose invasive pulmonaire (IPA) chez la souris, améliorant l’issue fatale sans toutefois offrir une protection totale. Dans ce projet nous allons combiner différentes approches incluant des molécules ayant un effet antifongique direct et des molécules importantes pour la réponse immunitaire mais qui sont absentes chez les patients immunodéprimés infectés, afin d’obtenir un maximum de protection. Le premier objectif de ce projet est de déterminer si les traitements à effet immunodépresseur pris par les personnes à risque d’Aspergillose affectent les molécules de l'hôte essentielles au contrôle des premiers stades de l'infection. En l’absence d’infection, nous comparerons donc les facteurs présents dans les poumons de souris recevant le traitement à effet immunodépresseurs à ceux de souris recevant la solution véhicule. Le deuxième objectif est d'évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d'infection d'aspergillose invasive. La résistance à l’infection sera surveillée, et les marqueurs de résistance à l’infection (charge fongique, dommage des tissus, marqueurs immunologiques) seront mesurés dans les poumons. Toutes ces études ne peuvent être remplacées par des techniques in vitro et sont essentielles pour le développement de toute nouvelle thérapie ou application médicale.
Bénéfices attendus
Le projet identifiera les facteurs humoraux de l'immunité de l'hôte susceptibles d'être régulés différemment sous traitement à effet immunodépresseur, ce qui pourrait fournir des informations cruciales sur la reconstitution possible de ces facteurs humoraux en tant que stratégies thérapeutiques pour l'aspergillose pulmonaire. Le projet fournira également des résultats pré-cliniques de molécules antifongiques dans l'aspergillose pulmonaire.
Procédures
Certains animaux auront, selon les procédures : 2 injections intrapéritonéales par animal (moins de 10 secondes) 2 instillations intranasales par animal sous anesthésie (de 20 à 30 secondes)
Impact sur les animaux
Une nuisance légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux sera associée aux injections intrapéritonéales. Les dommages escomptés dans ces expériences sont liés à l’objectif visant à identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Aspergillus fumigatus sera inoculé aux souris et induira des signes cliniques d’infections (poil hérissé, mobilité réduite, perte de poids). Dans la majorité des expériences, les animaux seront mis à mort avant que les signes d’infections apparaissent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable, car bien que nous ayons étudié in vitro l’effet des molécules à potentiel thérapeutique chez l’homme, nous ne connaissons toujours pas comment elles fonctionnent « à l’intérieur », dans la vie réelle, ce qui est essentiel pour envisager des traitements thérapeutiques contre l’infection d’aspergillose invasive du poumon (IPA). De plus, comprendre les mécanismes « in vivo » nécessite l’utilisation de mammifères possédant un système immunitaire, une anatomie et une pathogenèse similaire à l’homme, excluant l’utilisation des invertébrés. En effet, ces derniers peuvent être utilisés dans certaines études d’infections systémiques, mais notre étude nécessite la présence de poumons et d’un système respiratoire, couplé au système vasculaire circulatoire, ainsi qu’un système immunitaire complexe. Enfin, le modèle mammifère pré-clinique d’IPA développé par la communauté scientifique mime l’IPA humaine, n’affectant les souris qu’après traitement à effet immunodépresseur . D’importance, les défenses immunitaires de la souris lors de l’Aspergillose sont proches de celles de l’homme et la maladie est très similaire à l’aspergillose invasive humaine. Ce modèle a d’ailleurs été utilisé pour les études de traitement contre l’IPA et nos résultats seront donc conformes et comparables aux autres études.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 9680 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le strict nécessaire d’individus tout en récupérant le maximum d’information par animal. Lorsque la technique d’analyse des tissus le permet, nous combinons un même animal pour plusieurs analyses inflammatoires et infectieuses (l’analyse protéomique des réponses inflammatoires et de la charge fongique peuvent être effectue sur les mêmes poumons).
Raffinement
Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques, permettra d’attribuer un score quantitatif du bien-être des animaux tel que décrit par la structure du bien-être animal. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.
Choix des espèces
L’aspergillose expérimentale chez la souris reproduit la pathologie observée chez l’homme, avec un développement pulmonaire qui se produit exclusivement lorsque l’animal est immunodéprimé, comme c’est le cas après un traitement par un immunodépresseur transitoire. Ce modèle développé par la communauté scientifique et clinique étudiant A. fumigatus permets l’étude de traitement thérapeutique en phase pré-clinique. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 7 à 11 semaines. Le choix de ce stade de développement permet d'avoir des souris dont le système immunitaire est complètement développé et dont les poumons ont atteint leur taille définitive.
Etude de l’effet de l’hypoxie intermittente sur un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
3 360 souris vont être utilisées, chacune passant cinq jours en hyperoxie puis quatre à dix jours en hypoxie intermittente, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certains souriceaux reçoivent dès huit jours de vie une injection dans l'œil sous anesthésie, et subissent jusqu'à cinq examens d'imagerie rétinienne également sous anesthésie, un régime alimentaire particulier pouvant durer quatre mois. Les bénéfices annoncés se limitent à mettre en évidence de "potentielles" cibles thérapeutiques contre la rétinopathie du prématuré, quand le porteur reconnaît que le retour à l'air ambiant est mal supporté et peut provoquer une détresse respiratoire. Les mères sont tuées dès la sortie du caisson pour cette raison, les souriceaux étant confiés à des femelles Swiss présentées comme de bonnes mères adoptantes avant d'être tués à leur tour pour les prélèvements.
Objectifs
La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9 pourcent. La rétinopathie désigne toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.
Bénéfices attendus
La rétinopathie du premature (ROP) est un trouble de la rétine qui peut entraîner une perte de vision importante chez les prématurés. La rétinopathie du prématuré est le résultat de perturbations du développement déclenchées par plusieurs facteurs, dont le niveau d'oxygénation. En France et en Europe, environ 30 pourcent des prématurés de moins de 31 semaines d'âge gestationnel développent une ROP. Le projet permettra de mieux comprendre pourquoi le risque de maladies rétiniennes sévères chez les individus prématurés est augmenté lorsqu’ils souffrent d'apnée du sommeil. Elle permettra de définir les mécanismes et les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Certains recevront des injections intraoculaires (qui durent entre 2 et 3 minutes), une fois, sous anesthésie. Des tests d'imagerie rétinienne et fonctionnelle (5-10 min par test) seront réalisés sous anesthésie (2 ou 5 fois par animal, selon le groupe, avec un intervalle minimum d’une semaine). Certains animaux recevront un régime particulier pendant maximum 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement modifié (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les adultes une difficulté de réadaptation en conditions standard, ce qui peut provoquer une détresse respiratoire. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation localisée de l’œil. L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra péritonéales et les examens de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intrapéritonéales entrainent également une douleur légère de courte durée liée à la piqure de l’aiguille. Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme, changement de régime alimentaire) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères, ne pouvant être replacées, seront également euthanasiées.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons un total de 3360 souris. Nous devons répéter les expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées ou caissons d’expérimentation. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant l’anesthésie pour prévenir le risque d’hypothermie.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier les pathologies de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux. Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une néovascularisation pathologique.
Etude des voies nerveuses impliquées dans le contrôle de la transmission sensorielle chez la souris : modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisies parce que seules leurs lignées transgéniques permettent de cibler les populations de neurones visées, 5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 2 520 d'entre elles en gravité sévère. Chaque animal reçoit deux chirurgies sous anesthésie, une heure trente sur le cerveau et quarante-cinq minutes sur la moelle épinière, puis trois injections intrathécales et cinq heures d'électrophysiologie, 4 320 subissant en plus une perfusion intracardiaque. Les sept tests comportementaux annoncés, répétés trois fois par animal, ne sont pas nommés, et le porteur signale des saignements, une douleur postchirurgicale, des infections de suture et une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l'application répétée des stimuli. La mise à mort sert à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Objectifs
La maladie de parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la lésion des neurones à dopamine, neurotransmetteur jouant un rôle clé dans la communication entre les neurones et plus spécifiquement dans la MP. La région précise du cerveau concernée est appelée la substance noire compacte (SNc). Ceci provoque la dégénérescence des voies de communication entre des structures impliquées dans la motricité avec l’apparition des symptômes moteurs handicapants. En plus des symptômes moteurs, la MP est caractérisée par des symptômes non-moteurs qui affectent la qualité de vie des patients y compris les sensations douloureuses. Il est donc important d’identifier et de comprendre le fonctionnement les circuits neuronaux au sein du cerveau, mais aussi ceux impliqués dans les échanges entre le cerveau et la moelle épinière afin d’apporter un éclairage sur le dysfonctionnement du système nerveux dans la maladie. Ce projet vise donc à étudier dans le contexte de la MP le fonctionnement des neurones de la moelle épinière lombaire en lien avec des structures du cerveau produisant des neurotransmetteurs spécifiques (dopamine, sérotonine, noradrénaline et glutamate) et qui jouent un rôle clé dans cette maladie et les symptômes douloureux associés. Cette étude sera conduite sur un modèle expérimental de la MP chez la souris sauvage et transgénique. Nous pourrons ainsi apporter une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de la connexion entre le cerveau et la moelle épinière et son implication dans un modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Il apportera une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la pathologie.
Procédures
Chirurgie : 5040 animaux recevront 2 chirurgies sous anesthésie au niveau du cerveau et dans la moelle épinière : durée moyenne 1h30 pour le cerveau et 45min pour la moelle Tests comportementaux : 5040 animaux recevront 7 tests comportementaux sans anesthésies 3 fois d'une durée moyenne de 30min par test Injections intrathécales : 5040 animaux recevront 3 injections intrathécales sous anesthésies durée moyenne de 2 min Electrophysiologie : 5040 animaux seront soumis à cette approche sous anesthésie d'une durée moyenne de 5h Perfusions intracardiaques : 4320 animaux subieront une perfusion intracardiaque sous anesthésie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson qui induit un déficit moteur (réduction d'activité locomotrice, perte de poids). Les effets sont liés aux différentes chirurgies d’injection de virus dans le cerveau et/ou la moelle épinière. Ils comprennent : le saignement, la douleur postchirurgicale, l’infection de la suture et la perte de l’implant. Le saignement peut aussi apparaître suite à l'injection intrathécale répétée. Certains effets indésirables pourraient également survenir à la suite du comportement sensoriel tels qu’une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l’application répétée des différents stimuli.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de procéder à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques dans un organisme intégré. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions.
Réduction
La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expériences, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle ainsi le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe expérimentaux.
Raffinement
Tous les protocoles seront réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cages collectives avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après les chirurgies jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance et détecter d’éventuels signes cliniques (poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration, état de la suture).
Choix des espèces
La souris est un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. De plus, c’est un mammifère présentant une relation de parenté biologique avec l’espèce humaine. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.
Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une tumeur implantée, deux administrations orales de matières fécales murines, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et des prises de sang hebdomadaires: 1 508 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles subit en plus une intervention chirurgicale de cinq minutes sous anesthésie générale pour l'injection d'un traceur. Le porteur ramène les contraintes à une douleur et une gêne modérées liées à l'implantation de la tumeur, à un inconfort lors du gavage fécal et à une perte de poids possible. Il ne précise ni la nature du traceur, ni les immunothérapies employées, ni le calcul qui aboutit à cet effectif, dont il indique seulement qu'il découle d'un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe".
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Projet de recherche préclinique de traitements de cellules cancéreuses de cancer du sein injectées en orthotopique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester des candidats médicaments anticancéreux avant leur passage en clinique: 7 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales de cancer du sein leur sont injectées dans le coussinet adipeux mammaire, par inoculation ou par chirurgie, puis la tumeur est suivie une fois par semaine en imagerie sous anesthésie après injection d'une sonde bioluminescente, les composés à tester étant administrés une à deux fois par jour pendant toute l'étude. Le porteur précise que la formation du personnel aux gestes techniques se fera sur des souris mortes issues d'autres projets. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule la complexité de la progression tumorale dans l'organe et conclut que cette complexité rend "nécessaire" le recours aux études in vivo.
Objectifs
Les cancers du sein font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitements à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutiques mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.
Bénéfices attendus
L’inoculation de cellules directement dans l’organe permet dans un premier temps de limiter la diffusion de cellules cancéreuses dans d’autres organes et de pouvoir cibler l’organe d’intérêt avec nos traitements ; L’évaluation de l’efficacité des composés sur le développement de la tumeur dans l’organe nous permettra d’orienter le traitement en clinique vers les tissus cancéreux les plus sensibles à notre composé.
Procédures
1) Injection de cellules tumorales dans l’organe d’intérêt avec acte chirurgical ou par inoculation, sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) L'imagerie de la tumeur une fois par semaine se fera sous anesthésie pendant 5 min après une injection de sonde bioluminescente (100µl en sous cutanée), 3) 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés une fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant la durée de l’étude.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps lié à l’injection sous analgésique dans le coussinet adipeux mammaire ou suite à la chirurgie (suivant la méthode utilisée) et donc de la cicatrisation qui en découle. Ensuite, on peut observer les effets issus directement du développement d’une tumeur au sein de son organe cible qui peut s’accompagner d’une perte de poids. On pourrait également observer les effets des composés médicaments administrés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur dans l’organe. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne soient testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective après 5 études permettra le cas échéant de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisés dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de limiter le nombre d’animaux, la formation et la qualification du personnel réalisant ces procédures sera effectuée sur des souris mortes issues d’autres projets.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu et relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. Les animaux immunodéficient présentant un phénotype dommageable seront hébergé en portoir ventilé et manipulé sur PSM afin de limité au maximum les risques d’infection. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d’anesthésie gazeuse (isoflurane) et d'analgésie (buprénorphine) ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et de critère d'arrêt de souffrance sont mis en place.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Évaluation de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1750
Pesées jusqu'à cinquante-deux fois, colite déclenchée par une administration intrarectale sous anesthésie, puis gavage jusqu'à trois fois par jour pendant cinquante-deux jours: 8 750 souris et 1 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 3 150 d'entre eux en gravité sévère. S'y ajoutent une coloscopie hebdomadaire jusqu'à huit fois par animal avec prélèvement de micro-biopsies, des prises de sang rétro-orbitales et des mises à jeun de douze à vingt-quatre heures. Les modèles de colite provoquent perte de poids, diarrhées et présence de sang dans les fèces, une perte de poids supérieure à 20 % en 24 heures justifiant selon le porteur une mise à mort immédiate. Tous ces animaux sont tués à l'issue, le prélèvement de tissus et l'examen de leur système immunitaire servant à fixer les doses qui seront ensuite administrées à des patients en essai clinique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles d’inflammation chronique de l’intestin chez le rongeur. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Son origine semble résulter de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, associés à une susceptibilité génétique du patient et à la réactivité particulière de son système immunitaire, et au microbiote. Les traitements actuels sont peu nombreux et sont dans 70% des cas inefficaces. Les cycles récurrents d’inflammation peuvent conduire à des complications : sténose, fistules, perforations entrainant une urgence chirurgicale. Les MICIs sont également associés à un risque accru de cancer colorectal. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La colite ulcérative et la maladie de Crohn sont contrôlées à l’aide de médicaments immunosuppresseurs et antiinflammatoires (acide 5-aminosalicylique) qui atténuent l’inflammation intestinale. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Les traitements biologiques prescrits en deuxième intention sont très coûteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. De nombreux patients sont également réfractaires à ces traitements. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes dont des thérapies cellulaires et des fécalothérapies. A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les MICIs. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients dans les essais cliniques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. - Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour soit jusqu’à 52 fois par animal. - Administration d’agent inducteur d’une inflammation intestinale, 3 possibilités : par voie intrarectale : 30 secondes sous anesthésie gazeuse, une fois par animal. Avec ou sans présensibilisation par voie cutanée : 15 secondes sur animal vigile, une fois par animal. par voie intraveineuse : 30 secondes sous anesthésie, une fois par animal. par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile. - Prélèvement de sang par voie retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale , 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire. Prélèvements de sang via la veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : 30 secondes, sous anesthésie générale profonde. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique: voie selon le composé : o Par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique : 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, max 52 jours. o Par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 7 jours, 7 fois max par animal. o Sous-cutanée : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, 52 jours max. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale, Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié, Une fois par semaine pendant 8 semaines. Pour certaines procédures seulement :•Coloscopie (proc.1): 15 minutes sur animal anesthésié, une fois par semaine soit jusqu’à 8 fois par animal. Prélèvement de 2 micro-biopsies 2 fois par animal max.• Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 4 fois par animal; •Mise à jeun pour l’induction de l’inflammation intestinale (proc.2). Durée 12 à 24 heures, une fois par animal. •Mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale (proc. 1). Durée 4 heures, une fois toutes les 2 semaines soit 4 fois par animal.
Impact sur les animaux
Ces procédures induiront chez l’animal des nuisances modérées à sévères : pesée quotidienne (30s), injection de cellules (30s), administration de traitement par gavage ou injection (i.p., i.v., s.c.) (15 à 30s) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations (1 min). De plus, les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances (30 à 60s). Des microéchantillons de sang pourront également être prélevés sur animaux vigiles (30s). Une mise à jeun de 4h, pendant le cycle diurne, pourrait être réalisée pour une étude perméabilité intestinale (4h par étude). Une mise à jeun de 12 à 24 heures, pourrait être réalisée pour induire le modèle TNBS selon la procédure numéro 2. Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 30% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire
Remplacement
Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profiles pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin favoriser un comportement naturel (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture...). Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de MICIs chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des MICIs car ils disposent d'un système immunitaire mature
Utilisation d’un modèle de prurit chez le chien pour des études précliniques d’efficacité (screening et développement)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Provoquer des démangeaisons chez des chiens en bonne santé pour trier des molécules candidates à la mise sur le marché : c'est l'objet de ce projet, qui concerne 200 chiens dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à cinq injections intraveineuses d'une solution prurigineuse, espacées d'une semaine, chaque crise durant environ deux heures pendant lesquelles il se gratte, se lèche et se mordille. S'y ajoutent des prises de sang sur animal éveillé et, à l'occasion, des raclages ou des biopsies de peau, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit un comportement de prurit et que cette étape reste "indispensable". Aucun chien n'est tué : 180 seront réutilisés dans d'autres projets, 20 proposés à l'adoption.
Objectifs
L’objectif du projet est d’utiliser un modèle validé de prurit transitoire et modéré, provoqué par une administration intra-veineuse dune solution prurigineuse chez le chien, pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter entre autres, la dermatite atopique canine (DAC) ou d’autres pathologies entraînant des comportements de prurit chez le chien. L’utilisation a de ce modèle maitrisé permettrait d’évaluer, premièrement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation dans notre modèle avec et sans traitement.
Bénéfices attendus
La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien avec environ 10% de la population canine mondiale touchée. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse liée à une prédisposition génétique associée au développement d’allergie à des allergènes variés entrainant des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du chien et de son propriétaire. Tout ceci pouvant, à terme, être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce de destination lors d’un épisode clinique. La maitrise et le maintien d’un modèle induisant des signes cliniques similaires aux crises de prurit observées chez les chiens souffrant de DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de prurit présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’un comportement de prurit expérimental, les caractéristiques du prurit sont suivies en temps réel et en continu pendant toute la période d’expression, standardisée lors de la validation du modèle. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation de l’efficacité. Ce modèle permet aussi une évaluation de la tolérance, du profil pharmacocinétique des molécules testées et offre la possibilité de rechercher et/ou de suivre l’évolution des bio-marqueurs d’intérêt. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce de destination par procédure expérimentale dans un modèle transitoire, représentatif d’un comportement observé dans la DAC spontanée.
Procédures
Au cours de ces études, les animaux pourront recevoir, par voie intraveineuse, une solution entrainant des démangeaisons raisonnables et contrôlées. Ses administrations pourront être répétées au cours d'une étude, sans toutefois dépasser les 5 fois avec au minimum 1 semaine de récupération entre les administrations. Des voies d'administration telles que la voie intramusculaire, la voie sous-cutanée, la voie transcutanée ou la voie orale pourront être utilisée pour l'administration du produit a tester. Les volumes administrés seront en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Selon l’objectif de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés. Ces derniers sont réalisés sur animaux vigiles. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal. Exceptionnellement, selon l’objectif de l’étude, des prélèvements de cutanés par raclage ou biopsie pourraient être réalisés. Selon les prélèvements à réaliser, une anesthésie associée à une analgésie adaptées seront mises en place selon les procédures en vigueur de l'établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les chiens recevant une injection d’une solution prurigineuse développent des signes modérés et transitoires de prurit, pouvant provoquer de l’inconfort : grattage, léchage, mordillements ou frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et tous les signes de prurit disparaissent spontanément quelques heures après cette injection (le plus généralement dans les 2 heures suivant l’injection). Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées peuvent également générer un inconfort et/ou une douleur légère à modérée. Avant de conduire des études d’efficacité en utilisant ce modèle, des informations de tolérance chez le chien sont disponibles pour les produits à tester (dose maximale tolérée chez le chien et/ou une autre espèce pertinente, effets secondaires potentiels). Des réactions d’intolérance sévère liées aux produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvements sur un animal vigile peuvent occasionner un(e) léger(e) stress/gêne/contrainte en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil des échantillons le cas échéant.
Devenir
Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire un comportement clinique de prurit chez le chien et d’évaluer l’impact de nouvelles molécules sur l’intensité de l’expression clinique de la crise de prurit. L’utilisation de techniques in vitro préalables à l’utilisation de ce modèle in vivo permet de sélectionner en amont des molécules avec un fort potentiel d’activité sur le processus d’apparition du prurit impliquant certaines interleukines et ainsi de minimiser le recours au modèle in vivo. Cependant, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant pas être reproduite in vitro, cette étape demeure indispensable avant de prendre une décision sur la potentielle efficacité clinique d’une molécule chez le chien et l’éventuelle poursuite de son développement à des fins thérapeutiques.
Réduction
Les comportements de prurit présentent une variabilité entre individus. L'expérience avec ce type de modèle nous montre qu'il faut déterminer le nombre minimal d'animaux par groupe permettant d’obtenir des résultats exploitables et répétables. Ce sont le plus souvent, des études de preuve de concept/pilotes, étapes précoces de l'évaluation d'un nouveau produit/composé actif utilisant 3 à 6 animaux par groupe, qui permettront de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour des études ultérieures réglementaires. L'évaluation et l'interprétation des résultats sont faites avec une échelle de score adaptée pour ce modèle. Il est possible de réduire le nombre d'animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d'étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d'étude, le nombre d'animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié sur la base des informations déjà disponibles, de manière à optimiser l'utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s'assurant que ce nombre d'animaux permette d'atteindre l'objectif de l'étude, c'est-à-dire que les résultats de l'étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l'efficacité du produit/des produits évalués. En plus d'étudier le contrôle du prurit (effet pharmacodynamique), l'utilisation d'un modèle permet d’obtenir éventuellement un profil pharmacocinétique en parallèle. Ces paramètres pourront être combinés et permettre par modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) d’établir une relation entre l’effet et la dose et ainsi proposer une dose thérapeutique adaptée. Lors de ce modèle pourra aussi être réalisée une évaluation de la tolérance générale de la molécule. Toutes les informations obtenues lors d’une seule étude sur ce modèle permettent de diminuer le nombre d’études à réaliser pour statuer sur l’intérêt d’une nouvelle molécule ou de contribuer au développement d’une molécule à des fins thérapeutiques, et de ce fait, de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont observés et manipulés quotidiennement depuis leur arrivée sur le site afin de les habituer à la contention et au contact du personnel formé et impliqué dans les études. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons, et elle n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau ), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Dans le cadre de ce Projet, les animaux sont préalablement testés pour leur capacité à exprimer un comportement de prurit modéré, reproductible, contrôlable et de durée limitée (environ 2h). Depuis leur inclusion dans une étude du projet jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes (toutes les 15 minutes) sont prévues après l’injection de la solution prurigineuse et l’administration des produits testés, pendant au moins 2h30, pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques attendus (prurit) n’entraine pas de dégradation importante de l’état général et du bien-être de l’animal ainsi qu'une bonne tolérance au traitement. Le comportement général, la respiration, le grattage et l’aspect de la peau sont évalués avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront un examen vétérinaire et éventuellement l’administration d’un traitement adapté à sa condition clinique. La réaction aigue induite et l’inconfort que l’injection de prurigineux engendre, peuvent être contrôlés avec des molécules anti-prurigineux. La grille d’évaluation des observations et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés après analyse rétrospective par la SBEA, des résultats obtenus pendant chaque étude.
Choix des espèces
Les produits vétérinaires doivent réglementairement être testés dans l’espèce pour laquelle le produit est développé (animal de « destination »), dans ce cas, le chien. Les modèles seront réalisés chez des chiens jeunes adultes sains, c’est à dire des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.
Impact de la charge hypoxique induite par l’hypoxie intermittente sur la taille de l’infarctus du myocarde chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Placés en hypoxie huit heures par jour pendant trois semaines, au moment où ils dorment, 490 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont tous tués par prélèvement du cœur. Le porteur décrit une gêne respiratoire, une perte de poids, un stress et une baisse d'activité les trois premiers jours, puis une adaptation. Chaque semaine, les rats portent une à trois heures un collier ou un gilet de télémétrie, subissent une mesure de pression à la queue et, pour une partie, un test de tolérance au glucose avec six gouttes de sang prélevées après six heures de jeûne. L'effectif annoncé repose sur douze animaux par groupe, le porteur ajoutant que cinq mâles et cinq femelles par groupe suffiraient si les résultats se recoupent, sans que le passage à 490 rats soit expliqué.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. La sévérité des apnées modifie la quantité d’hypoxie qui a pour conséquence une grande valabilité de réponse entre les patients. Dans l’objectif de mieux comprendre la variabilité de réponse chez le patient et améliorer la prise en charge. L’objectif de cette étude et d’évaluer l’impact de différentes quantités d’hypoxie sur l’aggravation de la taille de l’infarctus du myocarde chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. La prise en charge des apnées du sommeil est complexe et le profil des patients hétérogène. L’étude de la charge hypoxique (quantité d’hypoxie) chez le rongeur permettra de mieux comprendre les mécanismes qui aggravent les pathologies cardiaques et mieux phénotyper les patients afin proposer des thérapies alternatives ou complémentaires aux traitements actuels.
Procédures
Tous les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie (contrôle) pendant 3 semaines en modulant la quantité d’hypoxie. Chaque semaine, pendant 1 à 3 h les animaux seront équipés vigile d’équipement de télémétrie (colliers/gilets) afin d’évaluer les paramètres cardiorespiratoires et soumis à une mesure de la pression artérielle à la queue. A la fin de cette procédure, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, une mesure de pression artérielle sera réalisée et les rats seront mis à mort par prélèvement cardiaque afin d’évaluer ex-vivo la taille de l’infarctus du myocarde. Dans la deuxième partie du projet, les rats subiront un test de tolérance à l’insuline ou au glucose. Ce test consiste à injecter de l’insuline ou de glucose chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injection ou prélèvement). A la fin de cette procédure, les rats seront anesthésiés et analgésiés, et mis à mort par prélèvement cardiaque puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.
Impact sur les animaux
L’hébergement des rats dans l’animalerie conventionnelle entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement du dispositif d’exposition à l’hypoxie. L’exposition à l’hypoxie induit une dyspnée, une perte de poids, un stress et une diminution de l’activité chez le rat, qui interviennent exclusivement pendant la phase d’hypoxie (8h/j), qui correspond à la phase de sommeil des animaux. Ces atteintes sont transitoires, la perte de poids et la dyspnée sont observées au cours des 3 premiers jours d’exposition, puis les animaux s’adaptent et les courbes de prise de poids sont ensuite parallèles à celles des animaux contrôles exposés aux mêmes flux d’air sans l’hypoxie (normoxie). Le test de tolérance à l’insuline et au glucose chez l’animal éveillé nécessite une mise à jeun de 6 heures et une injection intrapéritonéale d’insuline ou de glucose, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort. En effet, l’objectif de ce projet impliquant la réalisation d’une ischémie reperfusion ex-vivo le prélèvement du cœur est indispensable.
Remplacement
Le présent projet ne peut pas être réalisé en remplaçant l’animal par des méthodes alternatives puisqu’il s’agit ici d’une étude systémique. En effet, un des objectifs de cette étude est de corréler des marqueurs cliniques de dysautonomie (ECG, pression artérielle…) à la quantité d’hypoxie et à la taille de l’infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin que l’effectif par groupe permette d’observer d’éventuelles différences significatives mais en tenant compte d’éventuels problèmes au moment de la cannulation du cœur et de l’absence de réponse de certains animaux lors de la réalisation des tests métaboliques (+20 % => n=12 par groupe). Les gilets de télémétrie nous permettent d'effectuer des mesures longitudinales de la fonction cardiorespiratoire, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous réaliserons ce projet sur des animaux mâles et femelles, si les résultats observés entre les mâles et les femelles n’est pas différents les résultats seront groupés et il ne sera pas nécessaire d’effectuer la totalité des animaux 5 mâles et 5 femelles par groupes seront suffisant.
Raffinement
Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages, même pendant l’HI et la N (enrichissement adapté ne modifiant pas les flux d’air et ne permettant pas aux animaux de se cacher). Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de stabulation dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. L’utilisation de gilets de télémétrie permettent le suivi cardiorespiratoire des animaux sans nécessiter une quelconque chirurgie ou une anesthésie pour acquérir un ECG, ce qui participe au raffinement, de plus, il est très bien toléré par les rats. Compte tenu des multiples conditions de charge hypoxique, nous avons choisi de réaliser l’épisode d’ischémie-reperfusion ex-vivo plutôt qu’in-vivo, ce qui permet de réduire la contrainte et la souffrance potentielle pour les animaux. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront des antalgiques pré et post-opératoires selon nos protocoles normalisés Une fois endormis, les rats seront transférés sur tapis chauffants pour maintenir leur température corporelle leur température sera également contrôlée par un thermomètre rectal raccordé à une plaque chauffante pour ajuster les variations de température. L’anesthésie sera vérifiée tout au long de la chirurgie (pincement de la patte postérieure ou de la queue). Tous les gestes et soins effectués sur les animaux seront réalisés par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiopathologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est un modèle de référence dans les publications. Les animaux seront commandés à l’âge adultes 5-10 semaines (≈ 200 g et 300 g pour les femelles et mâles respectivement) et utilisés après 1 semaine de stabulation.
Evaluation des effets de l’argon dans le modèle d’ischémie thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui dépassent les points limites fixés après l'opération sont tuées par dislocation cervicale. 62 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie crânienne de vingt minutes pour recevoir une injection de thrombine qui bouche l'artère cérébrale moyenne, puis quatre heures seule en cage sous argon ou sous air, puis deux passages en IRM à un et cinq jours. Le porteur écrit qu'"aucune douleur n'est à prévoir" pendant ces examens et juge "indispensable" de trouver de nouvelles stratégies, moins d'un patient sur dix pouvant aujourd'hui recevoir le traitement existant.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester les effets d’un gaz, l’argon sur les volumes lésionnels post AVC. L’argon est susceptible d’agir sur la diminution de l’activation des macrophages et donc d’induire une neuro protection. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thromboembolique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Les effets seront observés par IRM à J1 et J5 post AVC.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. Les animaux traités à l'argon seront placé en cage individuelle afin de recevoir de l'argon pendant 4 heures post AVC. A J+1 et +5, la moitié de ces animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes. La seconde moitié seront aussi passés à l’IRM dans les mêmes condtions pour une durée totale de 26 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme. Les animaux seront sous anesthésie générale pour les examens IRM, aucune douleur n’est à prévoir.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 26 souris par groupe (+ 20%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle pendant 4 heures sous 100% Air ou 70% argon / 30% O2 ; avant d’être remis dans leur cage. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil (4 heures). Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.