Procédures modérées

390 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc, jusqu'à quarante gavages et six injections intraveineuses, et une immobilisation trois fois par semaine pendant huit semaines pour mesurer sa tumeur au pied à coulisse. Le porteur indique que le gavage peut provoquer une inflammation de l'œsophage et que la chimiothérapie entraîne une fatigue généralisée. L'objectif est de vérifier si le blocage d'une protéine restaure la sensibilité des tumeurs à la chimiothérapie, ce qui permettrait selon lui d'en abaisser les doses. Les souris qui ne développent pas de tumeur sont tuées elles aussi, le porteur écrivant qu'elles "ne peuvent pas être considérées comme naïves".

Objectifs

La protéine que nous étudions est impliquée dans la chimiorésistance. Quand nous retirons cette protéine des cellules cancéreuses, elles deviennent de nouveau sensibles aux chimiothérapies. Sachant que 90% des morts par cancers sont la conséquence de chimiorésistances, nous voulons voir dans des modèles de souris si quand on enlève notre protéine de la tumeur, nous sommes capables de contrer ce phénomène de chimiorésistance. Si c’est le cas, nous pourrons diminuer la dose de chimiothérapie et donc les effets secondaires et également proposer un nouveau traitement pour des patients qui ne répondent plus à la chimiothérapie et son donc dans une impasse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle de notre nouveau traitement en combinaison avec une chimiothérapie. Nous pouvons imaginer pouvoir baisser la dose des chimiothérapies car elles seraient plus efficaces en combinaison avec notre traitement, ce qui permettrait de diminuer les effets secondaires de ces chimiothérapies. Aussi, 90% des morts par cancer font suite à une chimiorésistance, il y a donc une urgence pour contrecarrer ce phénomène.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales dans le flanc (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine pendant 8 semaines, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement pendant 2 semaines, 1min dont 3sec d’injection) et par gavage (5x par semaine pendant 8 semaines, 1min dont 5sec de gavage) sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Les traitements avec chimiothérapie peuvent induire une fatigue généralisée. Le gavage peut provoquer une inflammation de l’œsophage.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour le prélèvement des tumeurs en vue d’analyses des tissus. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.

Remplacement

Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Le nombre de souris a été calculée en fonction de l’importance de l’effet attendu afin d’observer une différence entre les groupes à l'aide d'un test statistique.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. En cas de souffrance n’allant pas jusqu’à un point limite, l’injection d’analgésique pourra être envisagé pour réduire la douleur. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant. En revanche, les souris seront anesthésiées lors de l’injection sous-cutanée des cellules.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoral dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène.

Cent souris reçoivent des cellules cancéreuses implantées directement dans le cerveau, cinquante autres par voie intraveineuse, puis toutes passent sous radiothérapie ou restent sans traitement comme témoins. 150 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, transportées vers un second établissement pour le suivi par IRM, puis tuées en fin de projet pour confronter les images aux coupes histologiques. Le porteur décrit des titubations, une léthargie, des tremblements, des crises d'épilepsie et une perte de poids suivie jusqu'à 15 %, et affirme que la radionécrose de la tumeur ne devrait pas provoquer de douleur, celle du tissu cérébral sain pouvant en revanche devenir douloureuse. Le RNT laisse la radiothérapie en "session unique ou répétée" et ne précise ni le nombre de séances ni le nombre d'examens IRM par souris, alors que ces répétitions sont l'objet même du projet.

Objectifs

Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.

Bénéfices attendus

Ces modèles sont représentatifs de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement. L’IRM devrait permettre de détecter la radionécrose, et de la différencier de la pseudo-progression. Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies chirurgicales et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Ces informations sont cruciales pour mieux orienter le traitement du patient.

Procédures

Un premier groupe de 100 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse d'un agent de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d'au minimum 3 jours.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. Il n'existe pas de modélisation suffisamment aboutie pour reconstituer un micro-environnement tumoral, une immunité, et une vascularisation tumorale suffisamment intégrée pour reconstituer un modèle proche de l'homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies et les examens IRM, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).

Choix des espèces

Les souris sont des animaux permettant d'obtenir des modèles oncologiques, proches de ceux rencontrés chez l'homme. De plus, leur variabilité inter-individuelle est faible, permettant d'établir des protocoles IRM reproductibles, avant tout transfert à l'homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à cinq microcoupures de l'extrémité de la queue et cinq injections, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Les hormones administrées, glucocorticoïdes et hormones thyroïdiennes, peuvent selon le porteur induire une obésité, une résistance à l'insuline, une dyslipidémie, une myopathie, une ostéoporose et une hausse de la mortalité cardiovasculaire. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, trouver une molécule limitant les effets secondaires des traitements du syndrome de Cushing. Après avoir énuméré ces atteintes, le porteur écrit que la dose retenue se situe "dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé", et que l'injection et le prélèvement "n'entraînent pas de douleur".

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. Elle a un mode de sécrétion unique, conservé au cours de l’évolution des organismes, notamment les cellules de mammifères. Cette protéine joue un rôle crucial en aidant les cellules et les organismes à s'adapter au stress nutritionnel, par exemple dans le cas de jeûne, nous pouvons observer sa libération rapide dans le milieu extracellulaire, déclenchant ainsi des réponses adaptatives, telles qu'une modification du comportement alimentaire chez la souris. Nous pouvons aussi observer que cette augmentation de niveau est prolongée dans des conditions telles que le vieillissement, l'obésité, les syndromes métaboliques (dont le syndrome de Cushing), l'inflammation chronique et l'insuffisance rénale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact (patho)physiologique de ces dérégulations de la sécrétion de cette protéine. Nous avons mené des expériences préliminaires et avons découvert que l'activation de certains récepteurs stimule la libération de cette protéine à partir de cellules en culture et augmente sa concentration plasmatique chez la souris. De plus, la transcription des hormones thyroïdiennes régule à la baisse le niveau de la protéine. Le rôle des récepteurs des hormones thyroïdiennes doit donc être étudié dans le cadre de la thérapie métabolique. Ainsi, ces expériences nous permettront de clarifier les différents mécanismes d'action de deux hormones liées au métabolisme (thyroxine et glucocorticoïdes) avec notre protéine ainsi que de préciser si notre protéine d'intéret peut servir de pont pour participer aux effets synergiques et antagonistes entre ces hormones.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de trouver une molecule capable de limiter les effets secondaires (comme l'obésité) des traitements actuels pour soigner des syndromes métaboliques tel que le syndrome de Cushing

Procédures

Dans les deux premières procédures, les souris recevront une injection (durée moins d’une minute) et auront un prélèvement de sang (durée d’une minute). Dans les quatre autres procédures, les souris auront toutes 5 prélèvements de deux gouttes de sang après une microcoupure de l’extrémité de la queue (durée moins d’une minute) ainsi qu’un prélèvement de sang (durée d’une minute). Cinq injections (durée moins d’une minute), seront administrées en plus à certaines souris.

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Ils sont par ailleurs très petits, ce qui evite les risque d'infections. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les hormones peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie, l'ostéoporose et une augmentation de la morbidité et de la mortalité thrombotiques cardiovasculaires. La dose de médicament à tester que nous allons utiliser se situe dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’exclusivement in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs ( in silico, organoïdes, organes sur puce) permettant d’étudier dans son ensemble notre problématique. En effet, il nous faut mesurer la concentration d’une protéine dans le sang et, en même temps, la variation de prise de poids sur un organisme entier selon les effets métaboliques que peuvent avoir certains traitements.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Il existe des différences entre les sexes dans les réponses hormonales c’est pourquoi ces procédures seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne) et nous utiliserons des petites aiguilles stériles, ce qui évitera les risques d'infection. Le prélèvement sur la queue sera réalisé après une microcupure indolore qui se refermera très rapidement par coagulation. L'injection ou le prelevement n'entrainent pas de douleur mais nous mettrons en place une grille de suivi stricte des points limites qui permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués (l'atteinte d'un des critères entrainent l'euthanasie de l'animal). Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé

Un son intense de cinq secondes à une minute déclenche chez ces souris une crise d'épilepsie réflexe, souvent suivie de la mort. 1 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, testées deux fois, à un mois puis à trois mois d'âge, celles qui ne répondent pas aux critères de sélection et survivent au test étant tuées le jour même. Le projet consiste à dériver deux lignées d'une souche déjà construite, l'une dont 100 % des individus feraient une crise mortelle, l'autre dont 100 % survivraient à la crise, pour étudier la mort subite dans l'épilepsie. Le porteur résume les effets subis par les souris à "un stress induit par la stimulation auditive" et écrit que la convulsion, qui dure moins de huit secondes dans 99 % des cas, "n'engendre pas de souffrance intrinsèquement".

Objectifs

Le risque de mort subite chez un patient épileptique (SUDEP) est en moyenne trois fois plus élevé que dans la population saine. Aujourd'hui, on n'en connait pas la raison et beaucoup d'énergie est déployée pour mieux comprendre ce phénomène, chez l'Homme comme chez l'animal. Il existe un modèle de SUDEP chez la souris qui correspond à la présentation d'un son intense qui va déclencher une crise réflexe souvent suivie de la mort. Le bénéfice de ce modèle repose sur le fait qu'il n'est pas invasif et qu'il ne repose pas sur une stimulation électrique ou chimique. Seulement, il présente des inconvénients. Effectivement seules quelques lignées de souris y sont sensibles ; de plus, toutes les souris de ces lignées ne sont pas répondeuses. De surcroît, cette sensibilité s’estompe rapidement avec l’âge. C'est pour cette raison que nous avons développé une lignée de souris qui pallie ce problème. 100 % des souris de cette lignée présente une crise d'épilepsie suivies ou non de la mort. Nous souhaitons aller plus loin et, à partir de la lignée déjà construite, reprendre la sélection pour en dériver deux lignées. Une qui présenterait 100 % de crise létale suite à la stimulation sonore. Et l'autre qui présenterait 100 % de crise non létale suite à la stimulation sonore. C'est le sens de ce projet

Bénéfices attendus

Ce modèle de SUDEP permettra 1/ d'évaluer si les anti-épileptiques ont aussi une capacité à empêcher la létalité qui peut survenir après une crise d'épilepsie ; 2/ d'apporter un modèle de SUDEP utile à la recherche fondamentale.

Procédures

Chaque souris issue de la sélection sera soumise deux fois à un test de crise (à 1 mois et 3 mois d'âge) basé sur une stimulation sonore intense d’une durée de 5 sec à 1 minute, qui provoquera un stress.

Impact sur les animaux

Un stress induit par la stimulation auditif.

Devenir

Les animaux répondant aux critères de sélection seront conservés en vue d'une possible sélection en vue d'être croisées pour obtenir la génération suivante. A chaque génération, le nombre de couples formés sera décroissant de 9 à 1 couples. Ceux non sélectionnables et ayant survécu au test seront euthanasiés le jour même.

Remplacement

Les crises d’épilepsie impliquent un grand nombre de modifications biologiques intégrées. L’animal ne peut pas être remplacé pour la compréhension de ses mécanismes biologiques intégrés.

Réduction

Les souris utilisées classiquement ne répondent pas à 100 % au test de la crise audiogène. Ce qui fait qu’il faut tester 2 à 4 fois plus de souris pour la même fiabilité des résultats. Les souris ainsi créées permettront de réduire le nombre de souris testée. Nous souhaitons tester deux portées issues de chaque couple. Cette stratégie est classiquement utilisée dans les sélections directionnelles puisque cela permet de constituer un échantillon d'environ 15 animaux.

Raffinement

Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser toute souffrance des animaux. Ceci se traduit par une durée limitée du stress auditif (max 60 sec), une utilisation d'une cuve circulaire pour éviter les angles dans lesquels la souris pourrait se cogner. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle- même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas et qu'elle n'engendre pas de souffrance intrinsèquement.

Choix des espèces

Seule la souris présente des crises audiogènes létales ; le rat ne présentant que des crises audiogènes non létales. Les animaux seront testés deux fois, à 30 jours et 90 jours d'âge.

495 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées trois ou sept jours après l'intervention pour l'analyse de leurs tissus. Chacune subit une chirurgie d'une heure au plus sous anesthésie, au cours de laquelle la veine principale du foie est partiellement ligaturée pour provoquer un caillot, avec un risque de saignement, d'infection bactérienne et d'hypertension du foie. Une seconde opération, terminale, permet le prélèvement de sang avant la mise à mort. Le projet vise à mettre au point ce modèle de thrombose porte pour l'étude des syndromes myéloprolifératifs, et le porteur affirme que l'étude des types cellulaires en jeu ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant, ce qui rend selon lui l'utilisation des animaux non-humains "nécessaire".

Objectifs

Les syndromes myéloprolifératifs sont des maladies où la moelle osseuse produit trop de cellules sanguines. Cette surproduction est souvent causée par une mutation génétique. Environ 30 pourcent des personnes atteintes développent des caillots sanguins, qui peuvent être dangereux. Comprendre comment ces caillots se forment est important pour créer de meilleurs traitements. Une étude pense que certaines cellules, comme les plaquettes, jouent un rôle clé dans ce processus. L'objectif est de créer un modèle pour étudier ces caillots et trouver des traitements plus efficaces.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront de développer et de normaliser un modèle de formation d'un caillot sanguin de la veine principale du foie chez la souris et de mieux comprendre de quelle façon la mutation génétique identifiée agit sur le développement de la maladie. A plus long terme, cela permettra également de mettre au point des stratégies thérapeutiques plus efficaces que ceux proposées par la médecine actuelle. De plus, il s'agira d'un nouveau modèle expérimental qui pourra être repris par l'ensemble de la communauté scientifique au service de futurs projets.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie d’une durée d’1h maximum qui va permettre un rétrécissement de la veine du foie par le biais d'une ligature partielle (sténose). Les animaux subiront auparavant un prélèvement veineux de quelques secondes sur animal endormi et certains animaux auront un traitement pharmacologique pour diminuer l'apparition des caillots qui sera administré 24h avant la chirurgie par voie intraveineuse en moins de 10 min. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. A la fin de l'experience, le sang sera prélevé après une deuxième intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation post-opératoire au niveau de la cicatrice pourra également se faire ressentir. Un risque de saignement peut avoir lieu chez certaines souris. Cette procédure inclue également un prélèvement sanguin sous anesthésie et qui peut être associé à un risque exceptionnel de lésion occulaire. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. La formation d'un caillot peut entrainer une hypertension au niveau du foie.

Devenir

3, ou 7 jours après la sténose selon le groupe expérimental, les animaux seront systématiquement euthanasiés sous anesthésie, une fois le prélèvement de sang terminé pour pouvoir faire l’analyse des tissus et du plasma.

Remplacement

L'étude du rôle de différents types cellulaires dans l'apparition de maladie du sang associée à la formation d'un caillot ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant pour des raisons de complexité physiologique. L'utilisation des animaux est donc nécessaire dans la réalisation de ces travaux.

Réduction

Dans un premier temps, nous allons mettre au point la procédure uniquement sur des souris controles afin de déterminer les conditions optimales pour la formation d'un caillot sanguin tout en limitant les souffrances engendrées aux souris. Ces conditions seront alors appliquées sur les souris génétiquement modifiées. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour obtenir des résultats exploitables avec le minimum d'animaux.

Raffinement

Chaque étape de la procédure sera effectuée par du personnel qualifié. La douleur post-opératoire est traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur en plus de l'anesthésie gazeuse. Un tapis chauffant sera utilisé pendant les opérations, et les animaux seront réveillés sous lampe chauffante dans une cage de réveil avec du papier absorbant à la place de la sciure. Pour prévenir la souffrance, les animaux seront soumis à un suivi post-opératoire avec une grille de score, durant lequel ils seront observés et pesés quotidiennement. Si un point limite était atteint, l'animal serait endormi et euthanasié sans délai.

Choix des espèces

La souris possède de nombreuses similitude avec l'Homme, notamment son système vasculaire, immunologique et cellulaire. Ces similarités en font un bon modèle pour grand nombre de pathologies humaines. Les souris utilisées auront entre 8 et 12 semaines . C'est à cet âge que le modèle de souris mutées a été validé.

Caractériser un candidat médicament développé par une société privée, l'O2L-001, en vue d'un essai clinique annoncé dans deux ans: 160 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'histologie ou pour quantifier les traceurs injectés. Cinquante d'entre eux reçoivent une injection du produit directement dans le cerveau, cinquante autres dans les ventricules cérébraux, soixante subissent la pose d'un cathéter intraveineux et cent passent une IRM de quatre-vingt-dix minutes. Sur les effets subis par les rats, le RNT tient en une ligne, des douleurs, sans autre précision. Le projet relève à la fois de la recherche fondamentale, du contrôle qualité et des tests réglementaires d'efficacité et de tolérance, pour un produit dont l'entrée en clinique est déjà annoncée.

Objectifs

Cette étude cherche à examiner les caractéristiques d'un nouveau médicament appelé O2L-001, développé par la société Op2lysis pour traiter les hématomes qui se forment après des saignements cérébraux. Ce médicament contient un ingrédient actif nommé OptPA, qui est une version améliorée d'une substance utilisée pour dissoudre les caillots sanguins. L'OptPA a été modifié de manière à être moins toxique et à provoquer moins d'effets secondaires que les traitements actuels. Pour le rendre encore plus efficace, il est mélangé avec un matériau spécial appelé Poloxamère 407. Ce matériau se comporte comme un liquide lorsqu'il est injecté, mais se transforme en gel à la température du corps (37°C) pour libérer le médicament lentement dans l'hématome, aidant ainsi à dissoudre le caillot plus efficacement. L'objectif principal de cette recherche est d'en savoir plus sur les propriétés de l'OptPA et de comprendre comment O2L-001 fonctionne dans le corps.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'O2L-001 et sur son principe actif l'OptPA. L'O2L-001 est une nouvelle génération de thrombolytique qui vise à être testé en clinique d'ici 2 ans pour le traitement et l'évacuation des hématomes formés suite à un AVC hémorragique.

Procédures

1- Pose de cathéter intraveineux pour injection d’OptPA, tPA ou NaCl (30 minutes/animal, n=30 animaux) 2- Pose de cathéter intraveineux pour récupération de sang (30 minutes/animal, n=30 animaux) 3- Injection intracérébral d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux. 4- Injection intraventriculaire d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux) 5- IRM (90 minutes environ, n=100 animaux) 6- Imageur IVIS® (5 minutes environ, n=20 animaux)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux seraient des douleurs.

Devenir

Les animaux feront l'objet d'une mise à mort, soit, afin de générer des tissus permettant des observations histologiques, soit, pour quantifier les traceurs injectés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 160 rats seront nécessaires pour réaliser cette étude et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et d’étudier la distribution du produit permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux : 160 animaux) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces animales les plus utilisées pour les études de pharmacodynamique et de pharmacocinétique. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie du rat sont également documentés et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que le rat représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ce stade est adapté aux études de pharmacocinétique et pharmacodynamique.

Une chirurgie de trois à six heures pour implanter dans le crâne des dispositifs d'enregistrement et de stimulation, puis le port d'un implant de trois grammes: 250 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite manipulées chaque jour pendant dix à trente jours, environ trente minutes par jour, pour des tâches de mémoire et d'association. Le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable, ce qui selon lui "suggère qu'elles ne souffrent pas de la présence du transgène", et présente la complexité de ses chirurgies comme un raffinement puisqu'elle produit davantage de données par animal. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements. Les animaux font ensuite des tests comportementaux consistant en des apprentissages de mémoire et d'association stimulus-action nécessitant leur manipulation quotidienne pendant 10 à 30 jours à raison d'environ 30 minutes par jour.

Impact sur les animaux

Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.

Devenir

A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement de la souris pendant une tâche d’apprentissage mnésique et enregistrement de la synchronisation des aires corticales. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.

Raffinement

Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.

Les 420 souris subissent une chirurgie de 40 minutes pour implanter une fibre optique dans le cerveau, et la douleur chronique est provoquée sous anesthésie par une lésion de nerf (SNI) ou une injection de CFA, avec une douleur modérée et des troubles anxiodépressifs annoncés pendant environ six semaines ou une semaine selon la méthode. Élevées sur place, ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau et, selon le porteur, "afin de leur éviter toute souffrance inutile". Pendant 4 à 11 semaines, elles passent des séances de photométrie d'environ trois heures et des tests de comportement deux jours par semaine, pour repérer quelles régions du cerveau s'activent sous une stimulation mécanique ou thermique selon que la douleur vient d'un nerf lésé ou d'une inflammation. Le texte ne nomme pas ces tests de douleur, et annonce un prélèvement du cerveau pour analyser "l'expression virale" sans qu'aucune injection de virus figure parmi les procédures.

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux (n=420) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie SNI entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection de CFA entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h.

Devenir

Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature