Procédures modérées

Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.

Objectifs

La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.

Bénéfices attendus

Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.

Procédures

Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.

Réduction

A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.

Raffinement

Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.

Pour tester si des composés en développement réduisent une hyperactivité motrice provoquée par des agents perturbateurs, 900 souris et 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sur 24 semaines, chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre traitements par jour, subir des prélèvements sanguins quotidiens et passer jusqu'à 14 tests comportementaux de 90 minutes sur animal vigile. Le porteur annonce des convulsions ou des apathies possibles, une hyper-locomotion transitoire provoquée par les inducteurs, et un jeûne de moins de 16 heures avant le prélèvement terminal de sang. Il précise que si un composé induit des souffrances, la modification des doses ou l'arrêt du traitement sera envisagé "en accord avec notre sponsor", et qu'à défaut de solution l'animal sera tué.

Objectifs

L’hyperactivité ou l’hyper-locomotion est un symptôme présent dans plusieurs pathologies neurologiques, comme la schizophrénie, la maladie d’Alzheimer, le trouble déficitaire de l’attention (TDAH) ou le trouble bipolaire pour citer les plus connus. Cette composante des pathologies doit être prise en compte dans leur traitement global car l’impact sur la vie du patient est notable. Bien que ces troubles présentent des mécanismes physiopathologiques distincts, ils partagent une origine commune liée au déséquilibre des circuits neuronaux impliqués dans le contrôle moteur et l'attention. Pour simuler ces pathologies, différents agents perturbateurs sont utilisés qui impactent l'activité motrice. Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité des composés en cours de développement préclinique à réduire l’hyperactivité induite chez le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, quand nous testons des produits en cours de développement, nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’hyperactivité. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.

Procédures

Sur 24 semaines de la procédure, les animaux auront un maximum de 4 traitements par jour. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre les paramètres plasmatiques. En parallèle les animaux effectueront un maximum de 14 tests de comportement (90 min chacun) sur animaux vigiles. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement (douleur passagère, irritation, inflammation, induration mâchonnement et de fausse route pour la voie per os). Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. De plus les inducteurs utilisés provoquent une hyper-locomotion transitoire. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mortpour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse de l’hyperactivité nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. En effet, selon nos données antérieures un effectif de 10 par groupe permet d’obtenir une bonne puissance statistique. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 30 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les rats, nous proposons un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant de jouer et de grignoter. Pour les souris nous proposons un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher, et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les administrations et les prélèvements qui peuvent être réaliser sous anesthésie le seront. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre sponsor, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera mis à mort. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats ou des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 6 semaines et 200-250g pour le rat et 5 semaines et 25g chez la souris). Nous avons fixé cet âge car les mécanismes de l’hyperactivité que nous induisons ne sont pas dépendants de l’âge et d’après nos études antérieures les animaux de cet âge répondent de façon reproductible et robuste au protocole.

9 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir un cathéter jugulaire ou fémoral sous anesthésie, subir jusqu'à huit prélèvements sanguins en 24 heures, des gavages ou injections jusqu'à trois fois par jour, un hébergement individuel jusqu'à dix jours et jusqu'à 48 heures en cage à métabolisme sans enrichissement. La finalité est de mesurer la pharmacocinétique de candidats médicaments, l'effectif étant estimé d'après l'expérience du laboratoire et "le nombre de demandes de nos partenaires". Le porteur reconnaît que les tests in silico et in vitro suffisent à présélectionner les composés, puis conclut que seul un modèle animal permet de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o Par voie intraveineuse à la veine caudale ou via le cathéter sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Procédure chirurgicale de pose de cathéter jugulaire et/ou fémoral : o 1 anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum par animal sur la durée de la chirurgie. o Administration par voie sous-cutanée d’analgésique. Durée 30 secondes sur animaux vigiles ou anesthésié. Unique ou répétée max 2 fois. o Administration unique par voie sous-cutanée de NaCl pour l’hydratation des animaux. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière et matériaux de nidification) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 10 jours. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, - la chirurgie de pose de cathéter sous anesthésie/analgésie peut entrainer une nuisance, douleur et durée modérée - Les administrations et prélèvements sanguins vigiles peuvent entrainer une douleur légère de courte durée par acte, mais la nuisance peut être légère à modérée par la répétition des actes sur une étude, - L’hébergement individuel post-opératoire peut entrainer une nuisance légère de durée modérée ; - Sur certaines études, l’hébergement en cage à métabolisme peut entrainer une nuisance légère à modérée selon la durée. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les cathéters implantés ne sont pas perméables au-delà de 10 jours pour une implantation à la veine jugulaire et 14 jours pour la veine fémorale. De plus, les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Ces tests préliminaires ex vivo évitent le recours à l’animal. Pour la suite du développement des nouvelles entités thérapeutiques, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. L’estimation du nombre de rats utilisés est basée sur l’expérience acquise sur ce modèle et sur le nombre de demandes de nos partenaires. 9000 rats seront prévus sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - Techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental; - Scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.

24 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun opéré des deux yeux au cours de la même intervention, puis gardé vivant trois mois avant d'être tué pour l'analyse des greffons. Un chirurgien ophtalmologiste greffe dans chaque cornée un lenticule de stroma décellularisé et lyophilisé, dix minutes par œil. Le porteur affirme que l'intervention est "totalement indolore en post opératoire", tout en annonçant une vision floue pendant 72 heures, une douleur possible les 24 premières heures et un suivi des points limites fondé sur la Rabbit Grimace Scale et le resserrement des paupières. L'application chez l'être humain reste renvoyée à un objectif "à terme", quand la double greffe et la mise à mort à trois mois relèvent, elles, du protocole arrêté.

Objectifs

La cornée est la membrane transparente située en avant de l’oeil. Elle est constitué de plusieurs couches : - L’épithélium, qui constitue la couche la plus externe - La membrane de Bowman - Le stroma - La membrane de Descemet - L’endothélium, la couche la plus interne Les atteintes de la cornée peuvent toucher son épaisseur sur la totalité ou en partie (épithéliale, stromale ou endothéliale). Ces atteintes génèrent une opacité ou une déformation, dans ce cas l’individu devient non voyant et il est nécessaire de réaliser une greffe de cornée, soit sur toute l’épaisseur, soit sur une partie de son épaisseur. Cependant, le nombre de cornées disponibles pour les greffes, le mode de conservation et sa durée reste limités. Dans le but de surmonter les pénuries et les contraintes, d’autres alternatives sont mises en places. Dans le cas où il est nécessaire de réaliser une greffe lamellaire antérieure (stromale) de la cornée, la mise au point de stroma cornéen décellularisé et lyophilisé serait extrêmement intéressante. Cela permettrait de répondre plus aisément aux différents problèmes de conservation, transport, urgence de greffes et disponibilité. En France, le mode de conservation de la cornée d’origine humaine est l’organoculture à +31°C. Cette méthode nécessite des conditions de stockage volumineux et contraignant. Une alternative à l’organoculture est la lyophilisation de la cornée qui permettra une facilité de stockage ( à température ambiante). Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées. Les méthodes d’analyses permettent d’évaluer la conservation de l’intégrité structurale avant et après réhydratation ainsi que sa transparence. Cependant, il reste nécessaire de confirmer la bonne intégration de ces greffes in vivo (chez le lapin) avant une application chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer la compatibilité, l’intégration ainsi que la transparence au sein de la cornée du lapin du lenticule de stroma décellularisé lyophilisé. L’objectif est à terme une application pour la greffe chez l’humain. Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées.

Procédures

Chaque lapin suivra une procédure chirurgicale sur chaque œil d'une durée de 10 minutes soit un temps opératoire de 20 minutes maximum. Cette intervention consiste à greffer des lenticules lyophilisés au niveau de la cornée. Ce geste est réalisé par un chirurgien ophtalmologiste hautement qualifié.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de la greffe de corné chez le lapin sont les même que chez l'humain. Une vision légèrement floue durant les premiers 72h. Une légère douleur pourrait apparaitre durant les 24 premières heures due à l'inflammation engendrée par le geste opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés vivant pour une période de 3 mois à la fin de la procédure de greffe des lenticules, puis ils seront mise à mort pour l'evaluation des greffes.

Remplacement

Remplacement : la technique de lyophilisation de des cornées a été mise au point dans notre laboratoire et testée dans de nombreuse conditions in vitro. Aujourd’hui, nous devons confirmer la bonne intégration et la transparence des greffons stromaux lyophilisés sur la cornée animale avant de pouvoir l’utiliser chez l’homme. La dimension et la composition de la cornée du lapin est proche de celle de l'homme, cela permet une insertion plus facile par le chirurgien. De plus, le stroma cornéen sera préalablement décellularisé pour faciliter l’intégration dans la cornée du lapin.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3Rs : Réduction : Chaque lapin sera opéré des deux yeux. Cette intervention n’est pas cécitante, elle est régulièrement pratiquée en médecine humaine et totalement indolore en post opératoire ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés : - L’oeil droit recevra un lenticule dans l'épaisseur du stroma cornéen (INLAY) - L’oeil gauche recevra un lenticule à la surface du stroma cornéen (OVERLAY) Le nombre de lapins utilisé fait référence aux études antérieures et est nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Nous utiliserons un test de Wilcoxon ou un test Q de Cochran pour l'interprétation de statistique de nos résultats.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Les temps opératoires seront très courts maximum 10 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoire seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 5 à 7 jours. Chaque semaine, des photos seront réalisées sur les yeux afin de suivre la bonne intégration du greffon cornéen. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale et essentiellement sur l’Orbital tightening.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la dimension de la cornée est proche de celle de l’homme et permet à un chirurgien d’insérer les lenticules de 7-8mm de diamètre avec facilité. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. L’intervention réalisée chez l’homme sous forme de greffe de cornée n’est pas douloureuse et ne nécessite habituellement aucun antalgique. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg 24 lapins seront utilisés 12 pour une correction à 2 lenticules et 12 pour une correcrtion à 3 lenticules.

Choisies pour leur faible variabilité, de même fond génétique, même âge et même poids, 68 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de paclitaxel ou d'oxaliplatine, deux anticancéreux neurotoxiques, une partie subissant en plus un gavage quotidien pendant huit jours et trois prélèvements sanguins par voie intraveineuse sur animal vigile contentionné. Toutes passent trois tests comportementaux nommés, un de sensibilité tactile et deux de sensibilité thermique, tous les trois jours pendant environ quatorze jours. Elles sont ensuite toutes tuées pour prélever peau, nerf et ganglions spinaux, le porteur précisant que les animaux montrant fatigue, troubles moteurs ou signes de souffrance sont retirés du protocole avant l'analyse.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hématotoxicité. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlures, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces neuropathies induites par la chimiothérapie constitue un enjeu de santé publique. Au cours d’un projet précédent, il a été mis en évidence que le récepteur à la cholécystokinine de type 2 (CCK2R) était exprimé par le système nerveux sensitif périphérique et que son blocage par un antagoniste industriel spécifique de CCK2R, prévenait le dévelopment de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin. La vincristine est un agent anticancéreux indiqué notamment dans la prise en charge des cancers hématologiques. L’objectif de ce nouveau projet est d’évaluer l’influence d’un traitement par cette molécule sur la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez des souris. Le paclitaxel est un agent anticancéreux notamment indiqué dans la prise en charge des cancers du sein et des poumons, et l’oxaliplatine dans la prise en charge des cancers colorectaux. La vincristine, le paclitaxel et l’oxaliplatine sont trois agents anticancéreux représentatifs de trois classes de chimiothérapie particulièrement neurotoxiques. Chacune de ces molécules présente un mécanisme d’action cytotoxique différent contre les cellules cancéreuses, ainsi que des mécanismes de neurotoxicité spécifiques. Nous souhaitons vérifier si l’effet préventif de ce bloqueur de CCK2R observé dans le modèle de neuropathie induite par la vincristine, se produit également dans le cadre des neuropathies induites par le paclitaxel et l’oxaliplatine.

Bénéfices attendus

Particulièrement présent dans le système gastro-intestinal et dans le système nerveux central, le récepteur CCK2R est impliqué dans la satiété, l’anxiété et la douleur. Dans un modèle précédant, la vincristine induit une hypersensibilité tactile et une dégénérescence des nerfs sensitifs, deux phénomènes totalement prévenus par l’administration du bloqueur de CCK2R. Nous supposons que cette molécule pourrait également présenter des effets préventifs (analgésique et neuroprotecteur) sur deux autres modèles de neuropathies chimio-induite, le paclitaxel, et l’oxaliplatine. La molécule d'intérêt fait aujourd’hui l’objet de plusieurs essais cliniques et présente un bon profil de sécurité. Ainsi, la mise en évidence d’un effet neuroprotecteur dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur les neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra des injections intrapéritonéales répétées tous les deux jours ou tous les trois jours pendant une période de 6 jours. Une partie d'entre eux recevront également le traitement par voie orale tous les jours pendant 8 jours, par gavage. Une partie des animaux subiront en plus trois prélèvements sanguins en intraveineux chacun à 7 jours d’intervalle, sur animal vigile contentionné. L'ensemble des animaux sera soumis à trois tests comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours environ.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales tous les deux jours ou tous les trois jours pendant 6 jours (maximun 4 injections par animal) induiront une douleur légèreet un stress de courte durée . Au cours de l'administration du traitement par voie orale, les animaux pourront ressentir un stress lié à la préhension, le gavage peut être associé à un risque de fausse route. Les prélèvements sanguins peuvent être source de stress lié à la manipulation et la contention. Le prélèvement induira une douleur légère de courte durée. Le volume sanguin prélevé n'aura pas d'impact sur l'état général et le bien être de l'animal. Au cours des trois tests comportementaux, les animaux seront isolés de leurs congénères sur une période de courte durée ; ces tests produiront un stress le temps de la manipulation. Les tests comportementaux, évaluant la sensibilité tactile ou thermique, génèreront une gêne au moment du stimulus (de l'ordre d'une seconde). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi deux modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet du traitement sur des neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 56 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus nerveux (peau, nerf et ganglions spinaux) seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si des signes de souffrance et/ou de toxicité sont observés, alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés au traitement et/ou au paclitaxel ou à l’oxaliplatine doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Sept injections et neuf prélèvements sanguins sous anesthésie par animal, sur des souris chez qui une tumeur mammaire est déclenchée : 166 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La pousse tumorale peut provoquer une gêne ou une douleur locale, les injections intrapéritonéales, intraveineuses et sous-cutanées une douleur au point d'injection. L'objectif déclaré est d'identifier les cellules immunitaires qui éliminent les cellules en cours de transformation tumorale, que le porteur présente comme une piste de prévention des cancers et des rechutes. Parmi les animaux tués figurent les mâles reproducteurs et les souriceaux au "génotype non relevant car inutilisés", et le point limite est évoqué comme un "volume tumoral trop important" sans que le seuil soit donné.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer chez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité lié à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. Au cours des dernières années, certaines thérapies ciblant le système immunitaire ont déjà démontré des efficacités thérapeutiques sans précédent dans certains types de cancer (mélanome, cancer du poumon). Cependant, à l’heure actuelle, seulement un faible nombre de patients répondent à ces immunothérapies innovantes. Ainsi, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire des patientes atteintes de cancer du sein reste primordiale. Notre projet a pour objectif de déterminer, en utilisant un modèle de tumeur spontanée mammaire chez la souris, les acteurs du système immunitaire qui pourraient être impliqués dans l'élimination des cellules qui sont en train de se transformer en cellules tumorales.

Bénéfices attendus

La compréhens ion des mécanismes impliqués dans la détection précoce et l’élimination, par les cellules du système immunitaire, des cellules en transformation tumorale devrait permettre de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques représentant une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.

Procédures

- Pousse tumorale suite à l'induction du phénotype dommageable. - Injections (x7, 2min) ; -Prelèvements de sang, x9, 5min incluant l'anésthésie

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, et/ou une douleur locale. Les injections par voies IP, IV et SC peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer un stress causé par l’anesthésie générale et une douleur locale.

Devenir

A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort pour les raison suivantes : - Les mâles reproducteurs ainsi que les souriceaux issus des accouplements avec un génotype non relevant car inutilisés; - afin de réaliser des analyses de biologie ex vivo sur les tissus mammaires au cours de la progression tumorale, les animaux seront mis à mort avant prélèvement des tissus pour éviter toute souffrance. - atteinte d'un point limite (par exemple volume tumoral trop important...).

Remplacement

À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détections des cellules en transformation tumorale par le système immunitaire.

Réduction

Grâce à des données de la littérature, issues d'expériences pilotes sur un faible nombre d'animaux, ou de par notre exeprience, le nombre de souris a été déterminé au minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 166 souris sera utilisé dans ce projet.

Raffinement

Certaines procédures (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable,un anti-douleur sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser l’infiltrat immunitaire au cours du développement tumoral. De plus nous avons pour objectif d’effectuer une analyse détaillée du microenvironnement tumoral ; les outils que nous souhaitons utiliser ne sont disponible que chez la souris.

Des femelles gestantes sont opérées trente minutes pour injecter de l'ADN modifié dans leurs embryons, et une partie des souriceaux qui en naissent reçoit ensuite une injection intrapéritonéale. 834 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des cerveaux. Le projet exprime chez ces embryons des versions mutées de récepteurs NMDA identifiées chez des patients porteurs d'un syndrome de type autistique, afin d'en observer l'effet sur le développement cortical. Le RNT résume les nuisances à la chirurgie de la mère et à la douleur d'une piqûre, sans rien dire des effets attendus de ces mutations sur les souriceaux ni de la répartition des 834 animaux entre gestantes et petits.

Objectifs

Plus de 1 % des enfants naissent avec des troubles du développement du cerveau, comme l'autisme ou un retard de développement. Grâce au séquençage complet de l'ADN, on a fait d'importants progrès dans le diagnostic de ces troubles. Récemment, on a découvert que certains gènes liés aux récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le fonctionnement du cerveau, peuvent présenter des variations génétiques. Ces récepteurs, codés par les gènes appelés GRIN1, GRIN2A, et GRIN2B, sont importants pour la communication entre les cellules nerveuses. Des mutations dans ces gènes, notamment dans la partie des récepteurs qui organise leur position à la surface des neurones, peuvent entraîner un retard de développement. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment ces récepteurs NMDA fonctionnent dans le développement du cerveau et quelles sont les conséquences des mutations observées chez certains patients.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de caractériser des pathologies GRIN et de tester le potentiel thérapeutique de médicaments existants ou nouvelles molécules. Les pathologies GRIN sont un groupe de troubles neurologiques rares causés par des mutations dans les gènes GRIN (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, etc.). Ces gènes jouent un rôle crucial dans le fonctionnement des récepteurs NMDA, qui sont des protéines essentielles à la communication entre les cellules nerveuses du cerveau. Les mutations dans ces gènes peuvent perturber cette communication, entraînant des problèmes de développement et de fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes de pathologies GRIN peuvent présenter une variété de symptômes, tels que des retards de développement, des difficultés d'apprentissage, des problèmes moteurs, des crises d'épilepsie, et parfois des traits associés à l'autisme.

Procédures

Afin d’étudier le rôle de l’organisation des récepteurs NMDA dans le développement, nous mettrons en œuvre des approches chirurgicales pour injecter des préparations d'ADN modifiées dans les embryons (durée 30min) d'une femelle gestante permettant de visualiser les neurones et manipuler l’expression ou l’organisation des neurones corticaux afin de permettre une étude anatomique du développement cérébrale. Nous pourrons également caractériser l’impact de l’expression des sous unités du récepteur NMDA possédant une mutation identifiée chez un patient présentant un syndrome de type autistique sur le développement neuronal. Sur un nombre limité de souriceau, nous injecterons une molécule par voie intraperitonéale (durée 5min) pour induire des outils précedement electroporés. Pour cette étude, des souris gestantes et des souriceaux issus de ces souris gestantes mâles et femelles seront nécessaires. Nous analyserons les progénitures mâles et femelles en même temps pour exclure des effets sexes spécifiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances majeures que peuvent subir les souris sont liés principalement à la chirurgie de la femelle gestante et pour les souris une douleur correspondant à une injection intrapéritonéale, via une seringue.

Devenir

A l'issu de la procédure les animaux sont mise à mort pour réaliser une analyse des cerveaux.

Remplacement

La validation des outils utilisé pour l'expérimentation in vivo sera réalisé in vitro soit sur des cellules hétérogogues et des neurones en culture, ce qui nous permet de remplacer un nombre important d'animaux juste qui aurait dû être utilisé pour valider nos outils. Toutefois les modèles animaux sont essentiels pour comprendre le développement car ils permettent de reproduire de manière plus fidèle et complète les processus biologiques complexes qui se déroulent dans un organisme vivant. Contrairement aux modèles cellulaires, les modèles animaux permettent l'étude des interactions dynamiques entre différents systèmes et organes au sein d'un environnement biologique entier. Grâce aux modèles animaux, il est possible de suivre l'évolution des cellules dans un contexte global, d'étudier des fonctions physiologiques complexes, et de comprendre comment des gènes spécifiques influencent le développement global d'un organisme. Les modèles cellulaires, bien que très utiles pour des études ciblées et mécanistiques, présentent des limitations importantes. Ils ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment en ce qui concerne les interactions multicellulaires. Les cellules cultivées en laboratoire peuvent se comporter différemment de celles dans un organisme vivant, ce qui peut limiter la transposabilité des résultats. De plus, les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler le développement complet d'un organisme, rendant difficile l'étude des processus qui nécessitent l'intégration de multiples signaux provenant de différents tissus et systèmes.

Réduction

L'utilisation de neurones en culture nous permet de faire un pre-screening des mutations GRIN. En l'absence de conséquences fonctionnelles sur nos tests in vitro, nous ne procèderons pas à des tests in vivo. Les femelles gestantes seront fournis par Janvier. Si cela représente une surcharge financière, cela a l'avantage d'éviter d'avoir un pool de mâles et de femelles dédiés à la reproduction et d'éviter également de produire des souris surnuméraires. L'exportation de cette compétence à l'avantage de laisser à notre fournisseur Janvier d'optimiser cette production à l'échelle de plusieurs clients. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Les souris gestantes en provenance de chez notre fournisseur seront acclimatés au moins 24h avant la chirurgie. Les femelles gestantes issues de chez Janvier ainsi que les animaux qui naitront, vivront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, de ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les bébés resteront avec leurs mères pendant toute la phase expérimentale. Les solutions injectées chez les bébés seront maintenus à 37°C et la procédure d'injection sera la plus courte possible pour réduire l'éloignement de la mère.

Choix des espèces

La distribution cellulaire et la maturation du cerveau est similaire entre la souris et l'homme. De plus, les mécanismes qui contrôlent le développement cérébrale ont été largement étudiés chez la souris, ce qui permet de pouvoir comparer nos résultats à ceux déjà publiés dans la littérature scientifique et d'utiliser les résultats que nous avons d'ores et déjà obtenu lors de la caractérisation de ce modèle. Nous travaillerons donc sur plusieurs stades de développement : au stade embryonnaire, mais aussi le jour de la naissance et 7, 14 et 21 jours après la naissance.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de prostate humaine, passent au scanner puis sous radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant la croissance de la tumeur, avec des injections intrapéritonéales et rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le but est de mesurer la réponse des vaisseaux tumoraux et l'oxygénation du tissu, données recueillies post mortem. Le porteur justifie l'espèce en indiquant que la souris est "le plus petit animal répertorié" sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne tout en autorisant une greffe tumorale suivie deux semaines.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans différents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. En effet, lors de la radiothérapie conventionnelle, l'oxygénation tumorale augmente dans les premières semaines de traitement. L'oxygène présent facilite des réactions physicochimiques qui augmentent la destruction des cellules tumorales. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en termes d'oxygénation du tissu tumoral. Le nombre de vaisseaux, la fraction d'aire hypoxique (sans oxygène) et le pourcentage de vaisseaux perfusés seront déterminés post-mortem. La taille des tumeurs sera également suivie. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).