Procédures modérées

Une injection dans le cerveau, à l'âge d'un jour, sur des souriceaux éveillés retirés de leur mère : 50 nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure quinze secondes, après application d'une crème anesthésiante sur la peau du crâne. Le projet porte sur l'apprentissage de ce geste par le praticien, avec une solution colorée, la thérapie génique du syndrome de Prader-Willi restant l'objet d'un projet ultérieur. Chaque souriceau est tué deux minutes après l'injection pour que son cerveau soit prélevé et la diffusion du colorant vérifiée.

Objectifs

Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier le rôle d’une famille de gènes dont l’absence est une cause principale du syndrome de Prader Willi. Il s'agit d'une maladie génétique rare sans traitement curatif qui réduit drastiquement l’espérance et la qualité de vie des patients - le syndrome de Prader Willi est suspecté après la naissance par des signes caractéristiques de faible tonicité, de difficulté de tétée puis des troubles de la croissance et comportementaux ; en cas de suspicion un test génétique permet de confimer ou infirmer la pathologie. Nos travaux sur cultures cellulaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique qui semble capable d’exécuter les rôles des gènes manquants. Avant d'envisager des tests chez l'humain, il convient maintenant de tester cette thérapie sur la souris chez qui une modification génétique reproduit le syndrome de Prader Willi. Ces études sont indispensables avant d’envisager des essais chez l’humain. Pour être efficace, le traitement par notre thérapie génique doit se faire rapidement après la naissance. Cependant, du fait qu'elle ne peut être injectée dans le système sanguin, elle doit être injectée directement dans le cerveau des souris nouveau-nées. Le présent pré-projet vise à acquérir et valider dans notre structure le geste technique d’injection de solution chez la souris nouveau-née de un jour.

Bénéfices attendus

Acquisition d’un geste expérimental permettant l’injection d'une thérapie génique chez la souris nouveau-née, ce qui représente un intérêt pour les projets qui visent à la compréhension/correction de mécanismes cérébraux normaux et pathologiques.

Procédures

Une intervention : les souris subiront une injection intracrânienne à l'âge de 1 jour. Cette injection s'effectuera sur une durée de 15 secondes.

Impact sur les animaux

- Stress lié au retrait transitoire des souriceaux nouveau-nés de la portée - Stress léger maternel - Stress lié à la contention et douleur lié à l'injection intracranienne chez souriceaux nouveau-né vigile

Devenir

Deux minutes après l'injection intracrânienne, chaque nouveau-né sera mis à mort pour prélèvement du cerveau et observation de la bonne diffusion de la molécule colorée dans le cerveau.

Remplacement

Des études préalables sur modèles cellulaires ont permis de développer une thérapie génique du syndrome de Prader Willi. Il convient maintenant de l’administrer sur le souriceau nouveau-né chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques et comportementaux, qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal. Ce pré-projet vise à acquérir et valider le geste expérimental d’administration intracranienne de cette thérapie génique chez le souriceau agé de un jour.

Réduction

Pour ce projet, il est prévu d’utiliser au maximum 50 nouveau-nés issus de 4 à 10 femelles souris. Nous estimons que deux vagues de dix nouveau-nés séparées d’au moins une journée seront nécessaires à la bonne acquisition du geste technique par le praticien. Si le rendement afin de valider le geste est de 90% dès la 2ième cohorte de 10 animaux (minimum 20 animaux en tout, vagues 1 et 2), le projet sera arrêté. Dans le cas contraire, une ou deux nouvelles vagues seront réalisées jusqu’à 50 animaux maximum avant de conclure au succès ou à l’échec de l’acquisition du geste.

Raffinement

Les mères seront hébergées avec des éléments d’enrichissement et de nidification (igloo en carton, bloc de coton) jusqu’à la mise bas, puis avec des éléments d'enrichissement classiques (buchettes; frisures de papier kraft) une fois le sevrage des nouveau-nés surnuméraires atteint. Pour les nouveau-nés utilisés, l’injection sera précédée d’une application sur la peau du crâne d'une crème anesthésiante. Dans le cas ou des juvéniles manifesteraient une agitation désordonnée continue considérée comme point limite, leur mise à mort sera réalisée sans attendre les 2 minutes de diffusion de la solution colorée.

Choix des espèces

La souris est l’animal pour lequel des modèles du syndrome de Prader Willi existent. Le développement pathologique chez la souris est proche de l’humain. Dans notre modèle animal, les animaux seront injectés dès le lendemain de leur naissance, afin de mimer le traitement précoce des patients SPW. En effet, le SPW implique des troubles neurodéveloppementaux dont les premières manifestations prennent place à la naissance.

840 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à 28 administrations en deux semaines. Ils subissent une chirurgie d'une vingtaine de minutes pour l'implantation de cathéters, puis une instillation de prostaglandine dans la vessie qui provoque l'hyperactivité vésicale recherchée, avec les mêmes symptômes que chez l'humain. Le porteur indique que cette chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires malgré les antalgiques, des saignements voire des hémorragies. Il précise tester des molécules clients dont il ne connaît ni la nature ni les effets secondaires possibles, et reconnaît ne pas pouvoir anticiper les nuisances qui en découleront.

Objectifs

Ce projet a déjà reçu une autorisation par le Ministère en 2018 qui nécessite une révision au bout des 5 ans de validité. L’hyperactivité vésicale est un trouble urologique chronique redéfinie par l’International Continence Society en 2002 comme un syndrome clinique nécessitant au moins l’existence d’une urgenturie mictionnelle (besoin soudain d'uriner qui est, incontrôlable et difficile à retarder) associée ou non à une incontinence et généralement associée à des contractions involontaires du muscle lisse de la vessie, le détrusor. Quand on souffre d’hyperactivité vésicale, le détrusor, se contracte de façon involontaire même lorsque la vessie n’est pas encore pleine, ce qui provoque une envie soudaine et parfois extrêmement pressante d’uriner. Les principaux symptômes de l’hyperactivité vésicale sont donc : une urgenturie mictionnelle, une fréquence mictionnelle augmentée (besoin d’uriner au moins huit fois pendant la journée), une nycturie (se réveiller plus de deux fois pendant la nuit pour uriner) et une incontinence urinaire (fuites urinaires involontaires). Le syndrome de la vessie hyperactive entraine au quotidien des problèmes : besoin d’avoir des toilettes à proximité en permanence pouvant conduire au refus de sortir, fuites urinaires… pouvant créer un handicap aussi bien au niveau personnel que professionnel. Ainsi, l’hyperactivité vésicale peut affecter sérieusement la qualité de vie de nombreux patients. En Europe comme aux Etats-Unis, on estime que l’hyperactivité vésicale affecte environ 16% de la population, dont un tiers (principalement des femmes) présentent également une incontinence urinaire. De plus, les traitements de première intention n’apportent pas toujours de résultats satisfaisants. C’est pourquoi différents modèles expérimentaux sont développés dont un modèle d’irritation vésicale obtenu par l’instillation intravésicale de prostaglandine chez le rongeur éveillé provoquant une hyperactivité vésicale. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle d’hyperactivité vésicale chez le rat éveillé.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’hyperactivité vésicale.

Procédures

Les animaux seront administrés avec des candidats médicaments (voies d’administration et durée dépendantes de chaque protocole expérimental mais 28 administrations maximales pendant 2 semaines). Tous ces gestes d’administration sont très rapides (1 minute) mais peuvent procurer un stress à l’animal du fait de la contention, de la douleur de l’aiguille. Les animaux subiront également une chirurgie pour l’implantation de cathéters extériorisés afin de réaliser une cystométrie. Cette chirurgie assez rapide (environ 20 minutes) peut induire des douleurs post-opératoires (même avec l’utilisation d’antalgiques), des saignements voire des hémorragies… Des prélèvements sanguins durant l’expérimentation (2 maximum avant la cystométrie) ou en terminal juste avant la mise à mort pourront être réalisés sur animal vigil (lors de traitements avant la cystométrie) ou anesthésié (geste rapide).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ce protocole mime une hyperactivité vésicale donc les animaux auront les mêmes symptômes que chez l’Homme à savoir augmentation du nombre des mictions pouvant occasionnée une gêne.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et des prélèvements de tissus pourront être réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’hyperactivité vésicale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Ce modèle est très bien établi dans notre laboratoire. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 14 animaux par groupe et 6 groupes expérimentaux est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures nécessitant une anesthésie générale seront réalisées en maintenant la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Les procédures chirurgicales (implantation de cathéters) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe avec utilisation d’analgésiques afin de limiter la douleur. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, morceau de bois à ronger) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes comme prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… pouvant amener à des points limite. Si un animal présentait des symptômes de douleur, prostration, plaies… il sera soigné (désinfection de la plaie par exemple), isolé si nécessaire, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, et qu’un des points limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle d’irritation vésicale induite par la perfusion intravésicale de prostaglandine PGE2 chez le rat éveillé est largement décrit dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Une humanisation du foie qui ne réussit qu'environ une fois sur deux, et un effectif calé sur le plan commercial d'une entreprise : 7850 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, un cancer ou une insuffisance du foie, elles reçoivent une ou deux injections d'un composé qui tue leurs propres cellules hépatiques et une greffe de cellules hépatiques humaines, avec, par la veine porte, une chirurgie qui déplace les viscères. Les candidats médicaments sont administrés par voie pulmonaire, tumorale, cutanée, digestive ou par injection. Les souris au foie humanisé peuvent être reprises dans d'autres projets ou dans une formation interne aux gestes techniques, 200 étant déclarées réutilisables, et le porteur indique que les autres sont tuées parce qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé. Il présente la souris comme une espèce "facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou 2 injections(s) de composé induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant la chirurgie via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le MESRI dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7850 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 80 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 50 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 45 souris pour l’évaluation de l’efficacité du patch. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe, autour de 50% via l’injection splénique d’hépatocytes et donc l’utilisation de moins d’animaux.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.

Remplacement

Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Choix des espèces

Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.

2 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie d'ischémie-reperfusion du rein gauche de quarante-cinq minutes à une heure, l'ablation complète du rein droit la veille de sa mise à mort, jusqu'à sept semaines d'administration quotidienne des composés testés, des micro-prélèvements de sang et des échographies. Le porteur décrit les suites possibles de l'opération, hémorragie lors de la pose du clamp, douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, sang dans les urines, perte de poids. Les molécules ainsi évaluées viennent de la recherche de ses clients et ont déjà montré leur efficacité sur des cellules rénales humaines en culture, un résultat que le projet propose de confirmer sur deux mille souris opérées.

Objectifs

La greffe de rein est un traitement de choix de certaines maladies rénales chroniques (MRCs) arrivées à un stade ultime. Toutefois, il s’accompagne d’un phénomène incontournable : le syndrome d’ischémie-reperfusion (IR) rénal. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un manque d’apport temporaire en nutriments et en oxygène. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit quant à elle par une reprise de la circulation sanguine. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale survenant post-transplantation, elle correspond à une insuffisance rénale aiguë (IRA). À plus long terme, l’IRA peut évoluer soit vers (1) une MRC dans laquelle on peut observer l’apparition progressive de lésions microvasculaires et d’une fibrose rénale, soit vers (2) une insuffisance rénale terminale qui mène au retour du patient sur liste d’attente pour une nouvelle greffe de rein exacerbant ainsi le besoin continu d’organes. Malgré les progrès réalisés dans la prise en charge de ces patients, l’IRA d'origine ischémique demeure une complication fréquente et grave, associée à un risque accru de morbidité et de mortalité. Actuellement, les traitements les plus courants reposent sur l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie. En revanche, ils n’ont que pour but principal une prévention du rejet de la greffe et un maintien de la volémie du patient, respectivement. D’autres stratégies sont en cours de développement et impliquent entre autres des molécules additives aux solutions de conservation, des modalités de perfusion du greffon ou encore des molécules administrées directement chez le receveur. Ces approches n’étant pas validées, il apparaît comme étant primordial de renforcer les recherches dans cette indication. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de la Recherche de nos clients dans un modèle d’IR rénale chez la souris afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’Homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels consistent en l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie, mais ne présentent pas d’activité majeure sur l’IR générée au cours de la transplantation rénale, ni même sur la transition d’une IRA vers une MRC qui en découle. De plus, les immunosuppresseurs sont associés à de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat(s) médicament(s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon permettra d’augmenter l’efficacité du traitement tout en diminuant les effets secondaires et participera activement à réduire le nombre de patients en attente d’une nouvelle de greffe de rein.

Procédures

1/ Chirurgie ischémie-reperfusion du rein gauche sous anesthésie gazeuse (environ 45 minutes-1 heure), une fois dans l’étude 2/ Chirurgie néphrectomie sous anesthésie gazeuse (ablation complète du rein droit, environ 20 minutes), une fois dans l’étude et la veille de la mise à mort de l’animal 3/ Injection sous-cutanée d’un analgésique sur animal vigile, deux fois le jour de la chirurgie (quatre fois au cours d’une étude) 4/ Administration des composés à tester ou de leur solvant soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux, une à deux fois/jour pour la voie orale ou sous-cutanée, une fois/jour pour la voie intrapéritonéale, trois fois/semaine à raison d’une fois/jour pour la voie intraveineuse pendant un maximum de 7 semaines 5/ Micro-prélèvements de sang réalisés en quelques secondes sur souris vigiles, une session d’1 à 3 ponction(s) sur 24 heures, une semaine minimum de récupération (trois sessions maximum) 6/ Échographies effectuées sous anesthésie gazeuse au maximum deux fois dans une étude (environ 20 minutes/examen) 7/ Anesthésie gazeuse pour les prélèvements sanguin et urinaire puis la mise à mort, une fois dans l’étude

Impact sur les animaux

Les effets indésirables associés à la chirurgie sont : - pendant la chirurgie : stress lié à l’anesthésie, risque d’hémorragie lié à la pose et/ou retrait du clamp sur les vaisseaux et également lors de la néphrectomie - post-chirurgie : douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, mobilité réduite, perte de poids dans les 24 à 48hrs post-chirurgie, sang dans les urines (non systématique) Les différents traitements administrés soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse sont susceptibles de créer de l’inconfort voire de la toxicité. Les différents prélèvements de sang réalisés au cours de l’étude peuvent également générer de l’inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale, des analyses sur les reins étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement l’ensemble des caractéristiques associées au syndrome d’ischémie-reperfusion, l’insuffisance rénale aiguë et sa transition vers une maladie rénale chronique qui en découlent, ni même la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend ainsi nécessaire le recours à des expériences in vivo pour comprendre ce phénomène pathologique et évaluer de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter le nombre d’animaux lors de la phase de mise au point. Le nombre de souris par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. L’imagerie par ultrasons (échographe), méthode non invasive, sera employée pour un suivi longitudinal des lésions microvasculaires et, par conséquent participera à diminuer le nombre d’animaux par groupe. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés au préalable sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant toute manipulation. Hébergement : Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (enrichissement : igloo, sizzle pad, aspen). Chirurgie (ischémie-reperfusion et néphrectomie) : Afin de palier l'inconfort lié aux gestes chirurgicaux, un programme d'anesthésie sera effectué. Un anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson pendant 48 heures. Un antiseptique puis un anesthésique local seront appliqués sur la peau au niveau de la zone d’incision. Pour éviter l’assèchement des yeux, une goutte de gel ophtalmique sera déposée sur chaque œil au début et en fin de procédure. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Une sonde rectale sera placée afin de mesurer la température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. En fin de procédure, les animaux seront replacés dans leur cage sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées dans la cage. Un enrichissement adapté (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter toute irritation de la cicatrice. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou à la mise à mort anticipée de l’animal. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse profonde.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature pour notre modèle de transition IRA-MRC. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.