Procédures modérées

348 rats et rates vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de pose de cathéter intraveineux à demeure puis une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour l'implantation de fibres de photométrie ou l'injection de vecteurs viraux, avant d'être entraînés à s'auto-administrer de la nicotine jusqu'au développement d'une addiction. Le porteur table sur une attrition de 20 % au bout de trois mois d'expérience et fixe pour cela les groupes comportementaux à quatorze individus. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, "ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires" et qu'aucun modèle in silico valide n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle des différents sous-types neuronaux du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal chez le rat - une région du cerveau jouant un rôle clé dans le contrôle du comportement de recherche et de prise de drogue. Cependant, les mécanismes neuronaux locaux sous-tendant ces modifications d'activité du cortex préfrontal sont actuellement inconnus. Les réseaux corticaux du cortex préfrontal sont composés de neurones excitateurs mais aussi d'interneurones inhibiteurs locaux qui exercent un puissant contrôle sur l'activité du circuit du cortex préfrontal. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à étudier le rôle respectifs des neurones excitateurs et des interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Pour cela, les animaux seront tout d’abord entrainés à acquérir l’auto-administration intraveineuse de nicotine et à développer une addiction à la nicotine. Puis, nous mesurerons l’activité des différentes populations de neurones lors du développement de l’addiction à la nicotine. Enfin, nous chercherons à modifier l'activité de ces populations neuronales et à en évaluer les effets sur la consommation de nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de révéler les effets spécifiques de la nicotine sur les interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal qui pourraient expliquer le développement de l’addiction à la nicotine, et constituerait donc une percée dans le domaine de la dépendance. Le développement de stratégies visant à inverser ou à prévenir ces changements d'activité neuronale pourrait éventuellement conduire à la découverte d'un traitement efficace contre la prise de tabac et conduire à l’arrêt du tabagisme. Enfin, comme nous proposons d’examiner l'activité neuronale du cortex préfrontal avant, pendant et après l'escalade de la consommation de nicotine, nous serons dans une position idéale pour identifier les dysfonctionnements neuronaux préexistants. Ainsi, notre projet devrait également fournir des informations sur les marqueurs neurobiologiques de la susceptibilité à l’addiction à la nicotine.

Procédures

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...). Tous les animaux seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d’un cathéter intraveineux à demeure, puis à une chirurgie stéréotaxique pour la pose de fibres de photométrie ou pour l’injection de vecteurs viraux chémosensibles (45 min en moyenne). Toutes ces chirurgies sont effectuées sur une couverture chauffante en conditions aseptiques, sous anesthésie et analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin soit de prélever leurs cerveaux pour des expériences ex vivo d’électrophysiologie sur tranche ou de transcriptomiques, soit d’effectuer des contrôles histologiques pour vérifier l’emplacement des fibres de photométrie et l’expression des virus.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; et 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales du projet et les différents objectifs à remplir. Les expériences seront réalisées chez des rats males et des rats femelles répartis dans 3 groupes (1 groupe qui ne développe pas d’addiction, 1 groupe qui développe une addiction à la nicotine, et un groupe témoin non exposé à la nicotine), soit 6 groupes expérimentaux au total. Pour les expériences comportementales, en tenant compte du taux attrition estimé à 20% au bout de 3 mois d’expérience, il faudra démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Pour les expériences d’enregistrement de photométrie et de mesures ex vivo, l’effectif sera plus petit (n = 10) mais sera compensé par un grand nombre de mesures enregistrées par animal. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera de 348 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de NaCl pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Lorsque l’un des critères ou point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.

Des composants de paroi bactérienne administrés dans les voies aériennes provoquent chez les souris un bronchospasme et une chute de température pendant cinq à huit heures. 880 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par exsanguination intracardiaque sous anesthésie, plus de 60 % du volume sanguin étant prélevé. Elles reçoivent les candidats médicaments une à deux fois par jour pendant un à trois jours et subissent jusqu'à cinq prélèvements de sang à la queue. Le chiffre de 880 correspond à 20 candidats médicaments évalués sur cinq ans "selon l'hypothèse la plus défavorable", sans que le RNT précise de quelles molécules ni de quel commanditaire il s'agit.

Objectifs

Les lésions pulmonaires aigues surviennent chez les patients atteint d’une pneumonie et est l’une des causes de décès les plus fréquentes au monde. Une inflammation excessive en réponse à l’infection provoque une atteinte sévère des poumons (lésions vasculaires et bronchiques), qui peut se manifester sous forme d’un syndrome de détresse respiratoire identifié comme une dyspnée, habituellement accompagnée d’une respiration accélérée et superficielle. Des traitements préventifs et curatifs contre les origines des pneumonies (bactérienne, virale, fongiques…) sont disponibles, de même que des soins palliatifs (ventilation mécanique, oxygène) mais il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de promouvoir une résolution efficace et rapide de l’inflammation dans le but de limiter les atteintes et le remodelage du tissu pulmonaire. Les anti-inflammatoires disponibles actuellement ont pour la plupart des effets immunosuppresseurs qui présentent un danger pour le traitement de l’infection. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point des traitements capables de maintenir une immunité spécifique active tout en favorisant un contrôle local et une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires. Notre objectif est d’évaluer l’activité de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par l’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (lipopolysaccharides) chez la souris.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité de composé pharmacologique dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë (ALI) permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de pneumonie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour d'administrer les candidat-médicaments étudiés. Ces composés pourront être administrées sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 3 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres inflammatoires (cellules, cytokines…) au cours du temps, un maximum de 5 micro-prélèvements de sang (35µl, sur animaux vigiles et non contraints), sur une durée minimum de 48h, seront réalisés à l’extrémité de la queue. A la fin de l’expérience, lorsque des prélèvements doivent être effectués, les animaux seront mis à mort par exsanguination par le prélèvement du sang par voie intracardiaque transthoracique (>60% du volume circulant) sous anesthésie. La combinaison entre la forte surdose d’anesthésique et la chute de la pression sanguine et l'hypovolémie extrême résultant du prélèvement précipite la mort de l'animal dans les secondes qui suivent le prélèvement.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. L’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (LPS, lipopolysaccharides) induit une baisse de l’activité de l’animal au réveil de l’anesthésie et est accompagnée d’un bronchospasme (ayant pour effet une baisse visible de la fréquence respiratoire) et une baisse de la température dans les 5 à 8 premières heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament. Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur activité.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 6 animaux par groupe. Ce nombre d'animaux permet une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire ≥30% avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure du bronchospasme et/ou le suivi des populations leucocytaires dans le sang, 6 à 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. D’après notre expérience, nous estimons que 20 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 880 souris selon l’hypothèse la plus défavorable.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les animaux seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur a compter de la récéption des animaux puis plusieurs fois par jour après le début de la procédure expérimentale. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intranasales et intratrachéales. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont des expérimentations et la séléction des candidats-médicaments ayant le meilleur rapport benefice/risque, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue. Tout signes de douleur ne pourra être suivi de mesure corrective et les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de l’un des points limites. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude des réactions inflammatoires, avec de multiple modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires et respiratoires sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines afin que le système immunitaire des animaux soit mature.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit 70 minutes de chirurgie sous anesthésie pour la pose d'un cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie, avec dissociation du muscle masséter, puis deux passages en IRM de 34 minutes au total. L'objectif est de mesurer l'effet de traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale après un AVC provoqué, les tissus étant récupérés après la mise à mort pour analyse immunohistochimique. Le porteur indique avoir retenu "le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce", la souris étant selon lui l'espèce la plus étudiée dans ce domaine.

Objectifs

Cette étude vise à comprendre l'implication de traitements thrombolytiques dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral ainsi que sur l’apparition des transformations hémorragiques. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse), le traitement actuel de la phase aigue des AVC ischémiques, pour permettre la lyse du caillot sanguin et induire une reperfusion du tissu cérébral peut également moduler l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébral ainsi qu’une augmentation des transformations hémorragiques. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. Dans ce projet, nous allons également nous intéresser à l’impact d'autres traitements thrombolytiques. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et les transformations hémorragiques à la suite des AVC ischémiques. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de ces traitements thrombolytiques sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromboembolique où l'injection i.v. de traitements thrombolytiques permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de traitements thrombolytiques est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de ces traitements sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précoce et tardive afin de mimer les différents contextes possibles en clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'impact des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en pour améliorer la thrombolyse lors des AVC ischémiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h et à 5 jours après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC. Des déficits fonctionnels pourraient également survenir suite à l’AVC.

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (480 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 480 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total :480) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le reveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.

Séparées de leur mère pendant vingt-quatre heures au neuvième jour de vie, en hypoglycémie, en hypothermie et en état de stress, les souris de ce projet reçoivent ensuite, à partir du soixante-troisième jour, une injection quotidienne de psychotrope pendant deux semaines. 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent les traitements, dans l'eau de boisson pendant trente jours ou par injection abdominale pendant quatorze, puis une roue d'activité pendant quatre semaines, puis les tests comportementaux, activité locomotrice, labyrinthe d'anxiété, mémoire de travail, réflexe de sursaut, reconnaissance d'objet, interactions sociales. 500 souris sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, les 146 autres partent vers d'autres projets, dont 86 femelles gestantes et 60 utilisées comme stimulus social.

Objectifs

Affectant près de 1% de la population, la schizophrénie est une maladie psychiatrique fréquente hautement handicapante du fait de la triade de symptômes qu’elle engendre : symptômes positifs (hallucinations, idées délirantes), négatifs (repli social, émoussement affectif) et cognitifs (déficits de mémoire, d’attention). La prise en charge thérapeutique des patients schizophrènes est incomplète car les déficits cognitifs et les symptômes négatifs sont encore mal pris en charge par les antipsychotiques actuels. Par ailleurs, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. La mise au point d’approches thérapeutiques innovantes est donc un enjeu majeur de santé publique. L’étiologie de la schizophrénie reste inconnue, cependant, l’hypothèse majoritaire est qu’elle serait d’origine multifactorielle, impliquant une interaction entre facteurs génétiques et environnementaux. Ce projet se positionne dans le développement d’un nouveau modèle murin associant trois facteurs (vulnérabilité génétique, stress précoce et consommation de psychotrope) qui sera tout d’abord caratérisé d’un point de vue comportemental. Dans la deuxième partie du projet, des traitements d’intérêt (molécules et activité physique et leur combinaison) seront évalués.

Bénéfices attendus

L’un des objectifs de cette étude est d'examiner, d’une part, la validité d’un nouveau modèle animal d’un point de vue comportemental (caractérisation de déficits dans des tests modélisant les différents symptômes de la pathologie) puis post-mortem (modifications cérébrales qui seront corrélées aux modifications comportementales) puis de tester les effets de différentes stratégies thérapeutiques médicamenteuses ou non et leur combinaison. Ce projet a pour ambition de proposer des améliorations dans la prise en charge des patients souffrant de schizophrénie : non seulement des traitements pharmacologiques adjuvants aux traitement actuels et qui ne recouvrent pas l’ensemble des symptômes, mais aussi des traitements non-pharmacologiques basés sur l’activité physique spontanée. En effet, l’activité physique pourrait constituer un moyen efficace pour lutter contre la sédentarité de ces patients et les problèmes de santé associés, mais aussi pour lutter contre les effets secondaires des traitements chroniques et améliorer le fonctionnement cérébral en stimulant les phénomènes de plasticité. Il trouve donc une application certaine santé humaine.

Procédures

Dans un premier temps, les souris seront séparées de leur mère durant 24h à l’âge de 9 jours. Puis, à l’âge de 63 jours, les mêmes animaux recevront une administration quotidienne durant 14 jours d’un psychotrope par voie sous-cutanée. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours, ou non-pharmacologiques (mise à disposition d’une roue d’activité accessible par un petit tunnel à partir de la cage d’hébergement pendant 4 semaines). Les animaux vont ensuite réaliser plusieurs tests comportementaux afin, tout d’abord, de mesurer leur activité locomotrice/exploratrice (1fois, 30 minutes), leur niveau d’anxiété (1 fois 5 minutes dans un labyrinthe), les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes). D’autres tests seront également réalisés afin d’évaluer le réflexe de sursaut (1 session de 25 min), les performances de mémoire de reconnaissance d’objet et enfin de mesurer les interactions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes. A l’issue de l’expérimentation comportementale, la moitié des animaux seront exposés à une procédure de mise à mort menée sous analgésie et anesthésie profondes d’une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de la séparation maternelle de 24h, les animaux sont en état d’hypoglycémie, d’hypothermie et de stress psychologique (nuisance modérée). Une légère perte de poids transitoire peut être observée suite à la séparation et une augmentation de l’anxiété à l’âge adulte peut être observée, il s’agit d’un état prévu à la suite de cette manipulation qui fait partie de la modélisation. Les animaux recevront des injections quotidiennes (durée d’injection : environ 1 minute, durant 14 jours d'une molécule qui induit des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie (nuisance modérée). Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours (nuisance légère) et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours (nuisance modérée). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement ressenti aux tests comportementaux qui seront réalisés (nuisance légère).

Devenir

Une partie des animaux des procédures (500 souris) seront mis à mort après les études comportementales. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour des exploitations scientifiques (analyses électrophysiologiques ex vivo, quantification de différents marqueurs associés à la schizophrénie) Les souris restantes seront réutilisées dans d’autres projets (86 souris gestantes + 60 souris stimulus).

Remplacement

Ce projet se positionne sur le développement d’un nouveau modèle de schizophrénie pour tester par la suite une approche thérapeutique innovante pour traiter les symptômes non pris en charge par les traitements actuels. S’agissant d’études comportementales faisant appel à des fonctions cérébrales très intégrées, aucun modèle in vitro ne peut remplacer, à l’heure actuelle, l’utilisation des animaux vivants dans notre projet. De plus, il n’existe aujourd’hui qu’une seule espèce où le génome a été modifié pour porter la délétion du gène de la sérine racémase, la souris.

Réduction

Toutes les procédures incluront des mâles et des femelles. En effet, les recommandations récentes concernant la recherche sur la schizophrénie ont souligné l’importance d’évaluer les deux sexes dans la mise au point de modèles précliniques. En effet, la schizophrénie touche aussi bien les hommes que les femmes avec des différences en termes d’intensité des symptômes et d’âge d’apparition. De plus, nous souhaitons tester un potentiel nouveau traitement, qui a pour but final d’être efficace aussi bien chez les femmes que chez les hommes, donc nous souhaitons d’emblée tester des femelles et des mâles. Nous nous attendons à observer des différences entre les deux sous-populations. Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu a priori pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Une analyse statistique sera réalisée a posteriori via l’utilisation de tests statistiques adaptés afin de comparer les données obtenues.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés et pesés durant 1 semaine avant de débuter les expérimentations et régulièrement durant la durée totale de chaque expérimentation afin de les habituer au contact humain. De plus, au moins 30 min avant le début de chaque test, les animaux seront placés dans la pièce d’expérimentation pour leur permettre de s’habituer à l’environnement. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en leur permettant de faire de l’activité physique volontairement. Un traitement pharmacologique sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage ou par injection. Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces et la mise à mort. Par ailleurs des points limites précis seront mis en place afin de déceler le plus précocement possible un état de souffrance ou de détresse des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. Son comportement est bien connu et décrit dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, notre modèle comprend une composante génétique (mimant la prédisposition génétique, bien démontrée chez l’homme), or, il n’existe à l’heure actuelle aucune autre espèce animale disponible qui porte la délétion du gène codant pour la sérine racémase. Les animaux seront testés une fois devenus adultes entre 84ème et le 114ème jour post-natal, correspondant chez l’Homme à la période symptomatiques. Avant ces tests, des étapes sont nécessaires : - Séparation maternelle au 9ème jour de vie post-natale, mimant un stress environnemental précoce, facteur de risque de la pathologie - Exposition subchronique à une drogue durant l’âge jeune adulte (du 63ème au 76ème jour), période caractérisée par une exposition accrue aux substances psychotropes chez les patients Les études en électrophysiologie et immunohistochimie seront réalisées post-mortem.

Une injection sous la peau de la patte ou de la face suffit à provoquer chez eux une inflammation, puis une hypersensibilité douloureuse au toucher. 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie profonde pour prélever les tissus nerveux. L'objectif est de comprendre comment cette inflammation dérègle un canal des astrocytes, un travail qui prolonge des résultats déjà obtenus au niveau trigéminal. Le porteur programme sept séances de tests comportementaux de trente-cinq minutes chacune, sans dire lesquels, et qualifie ces mesures de peu douloureuses puisque l'animal peut retirer sa patte.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la genèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Les objectifs de ce projet est d'étudier si il y aussi une dérégulation en condition inflammatoire au niveau de la patte et de la face.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 1 : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face ou de la patte selon le modèle). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après les données antérieures le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés de façon à avoir un enrichissement social. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à partir de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale d'anestésique sous sédation profonde. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Enfin, comme énoncé précédemment, ce projet fait suite à d'autres études et doit donc être réalisé sur la même souche de rat. Pour les expériences comportementales et l'étude protéique, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaine, comme dans les projets précédents (125g à 250g).

Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.

Objectifs

L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.

Bénéfices attendus

La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Procédures

Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau du flanc droit une injection de cellules cancéreuses puis, dans l'abdomen, une injection d'immunothérapies, et développe une tumeur qui peut gêner ses mouvements. Le porteur écrit que les effets secondaires sont rares et que le suivi est assuré au minimum trois fois par semaine, quotidiennement si l'état se dégrade. Il annonce un "réel espoir" contre le cancer en précisant que le traitement testé sert déjà chez l'humain contre le rejet de greffe du rein et a déjà fait l'objet d'un essai clinique en cancérologie.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des freins appelés point de contrôle (PD1, PDL-1) qui vont permettre d’inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Des immunothérapies ont été développées pour bloquer ces freins et rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements et certains cancers restent largement réfractaires à ces thérapies. Notre projet de recherche fondamentale a pour but de lever la résistance aux immunothérapies ciblant le point de contrôle PD1. En effet, nous espérons identifier et réveiller une sous population de lymphocytes T freinés par les points de contrôle de la tumeur afin de rétablir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace et donc de lever la résistance aux immunothérapies. Pour évaluer la réponse à notre traitement, nous mesurerons la croissance tumorale au cours du temps pour les différents groupes étudiés (traités ou non traités) et réaliserons une analyse des différents composants cellulaires de la tumeur après mise à mort des animaux qui ont reçu ou non les traitements.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses immunitaires anti-tumorales grâce aux immunothérapies a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré. Nous espérons améliorer la réponse immunitaire contre le cancer en réveillant une population cellulaire essentielle dans la réponse immunitaire. Il est important de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les combiner et améliorer la réponse contre le cancer. Ce projet représente un énorme intérêt en immunothérapie du cancer chez l'homme puisque notre traitement est déjà utilisé dans le cadre du rejet de greffe du rein et dans le traitement des maladies auto-immunes. De plus, une étude clinique a déjà été réalisée dans le cadre du cancer chez des patients atteints de tumeurs. Notre traitement est donc facilement applicable chez l'homme et constitue donc un réel espoir dans le traitement du cancer.

Procédures

Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal quelques soit le nombre d’immunothérapies qu’il reçoit. Les différentes immunothérapies seront mélangées pour ne faire qu'une seule injection - Durée : 1 minute

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. D’éventuels effets secondaires des traitements sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement si dégradation. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

L'analgésique n'arrive qu'au-delà d'un score de douleur de 5 sur la grille du laboratoire. 80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est gavée pendant quatre semaines, d'eau ou de sucralose, avant une anesthésie générale de quatre heures, avec pour une partie des animaux deux heures d'interruption du sang dans la patte arrière suivies de deux heures de reperfusion, et pour les autres une injection d'isoprénaline qui accélère et renforce les contractions du cœur. La question posée est de savoir si le sucralose, présent dans plus de 15 % des aliments et boissons consommés, aggrave ou atténue ces dommages, et le porteur retient des souris jeunes et de poids normal pour écarter l'effet du vieillissement et de l'obésité.

Objectifs

Pour limiter les effets délétères des sucres ajoutés sur la Santé, un remplacement par des molécules édulcorantes est fréquente dans l’industrie agro-alimentaire. Elles sont commercialisées avec le bénéfice d’avoir un fort pouvoir sucrant sans induire d’apport calorique (produits de type light). Selon les dernières estimations, plus de 15% des produits alimentaires ou boissons consommées comportent des édulcorants contribuant ainsi à une augmentation progressive de la consommation chez l’adulte et l’enfant. Ces molécules sont vendues comme des composés inertes et inoffensifs pour la santé. Cependant, cette neutralité biologique est actuellement questionnée, notamment au regard du risque cardiovasculaire observé chez les consommateurs fréquents de produits contenant des édulcorants. En effet, des études de cohorte de plusieurs centaines de milliers de personnes démontrent une augmentation significative du risque de morbi-mortalité mortalité cardiovasculaire chez les grands consommateurs d’édulcorants. De manière interressante, le suivie de la cohorte NUTRINET-santé a étudié les effets spécifiques de chaque molécule sur le risque cardiovasculaire. Une étude montre notamment pour le sucralose, l’édulcorant le plus consommé à ce jour au niveau mondial, une augmentation de la mortalité s’expliquant par une augmentation du risque de développer des maladies circulatoires, de type ischémique notamment. Néanmoins, aucune étude à ce jour n’a été menée de manière prospective pour confirmer ces observations épidémiologiques. L’objectif de cette étude est donc de voir si une consommation chronique à dose physiologique contrôlée de la molécule édulcorante sucralose peut moduler les dommages biologiques liés à des épisodes ischémiques, plus particulièrement suite à une ischémie soit du membre postérieur soit au niveau cardiaque.

Bénéfices attendus

Malgré les données epidemiologiques recensées dans la littérature, aucune étude à notre connaissance ne s’est encore interréssée à un potentiel impact d’une consommation de sucralose dans le cadre d’accidents cardiovasculaires. Ce projet vise donc à évaluer si une consommation chronique de 4 semaines de sucralose à une dose controlée et physiologique (respectant la Dose Journalière Admissible) est capable de moduler (aggraver ou protéger) les dommages occasionnés par une une ischémie-reperfusion du membre postérieur ou un infarctus de 2ème type chez la souris.

Procédures

Dans notre première procédure, deux groupes de 10 souris seront gavés pendant 4 semaines avec de l’eau et deux autres avec du sucralose. Puis deux groupes de 10 animaux, qui serviront de témoin, seront soumis à une anesthésie générale de 4 heures et deux autres groupes seront soumis à une anesthésie générale couplée à une chirurgie d'une durée de 4 heures. Dans notre seconde procédure, deux groupes de 10 souris seront gavés pendant 4 semaines avec de l’eau et deux autres avec du sucralose. Puis deux groupes recevront une injection en intrapéritonéal d’un liquide physiologique et les deux autres recevront une injection d’isoprénaline. Au bout de 7 jours, une échographie cardiaque sera réalisée sous anesthésie générale pour les 4 groupes.

Impact sur les animaux

L’administration de sucralose par voie orale (gavage) peut être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal. Une partie des animaux (groupes Ischémie-Reperfusion) sera soumise à une ischémie de la patte durant 2 heures qui provoque une diminution des apports en oxygène pouvant entrainer des altérations cellulaires (mort cellulaire, gonflement mitochondrial, etc.). Cette ischémie sera suivie d'une période de reperfusion de 2 heures qui entraîne une exacerbation de la mort cellulaire engendrée par l'apport massif en oxygène. Une partie des animaux (groupes Infarctus du myocarde) recevront une injection pouvant avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux. En effet, l'injection va principalement se traduire par une augmentation de la force et de la fréquence de contraction du coeur des animaux, impliquant de potentiels palpitations cardiaques.

Devenir

Mise à mort des animaux à l'issue de la procédure pour prélèvement des tissus nécessaire.

Remplacement

Les mécanismes de digestion, d’absorption et de bioaccumulation de molécules sont complexes. Aucune méthode in vitro ne permet de remplacer de manière exhaustive les mécanismes de digestion in vivo. De plus, il n'existe à l’heure actuelle, aucun modèle de substitution in vitro ne permettant d’évaluer l’impact de l’ischémie reperfusion périphérique ou de l’infarctus du myocarde de 2ème type suite à une consommation chronique de sucralose. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser nos mesures tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela un nombre minimum de 10 animaux par condition apparait comme nécessaire. Cet effectif est basé sur un calcul d'effectif statistique.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à leurs conditions d’hébergement pendant les 11 jours suivant leur arrivée, avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les animaux sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (igloos, tubes, et coton). Pour permettre aux souris de ronger, de petits bâtonnets en bois sont également proposés. Les animaux auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités bi-quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une table de score intégrant les différents point limites et mesures médicamenteuses ou non à mettre en place (annexe en pièce jointe). Au dela d'un score de 5 sur cette fiche l'utilisation un analgésique pourra etre utilisé afin de garantir le bien être de l'animal. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Lors de la procédure d’ischémie-reperfusion de la patte, les animaux sont anesthésiés et une injection d'un analgésique sera réalisée avant l'intervention puis une seconde au bout de 2 heures pour limiter au maximum la douleur ressentie. La température des animaux est maintenue constante grâce à l’utilisation d’un tapis chauffant. Pour la procédure d’injection d’isoproterenol, les animaux seront préalablement enduits d'un anesthésique local au niveau de la zone d’injection afin de réduire la douleur liée à celle-ci. Suite à cette procédure, les animaux seront surveillés attentivement pendant les heures suivant l’injection pour observer d’éventuels changements de comportements. En accord avec la grille de score, l’euthanasie de l’animal pourra etre envisagée.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent afin d’étudier les effets d’une molécule impliquant des mécanismes de digestion car son système digestif est proche de celui retrouvé chez l’Homme. Le modèle souris a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. De plus, ce modèle d’ischémie-reperfusion périphérique ainsi que celui de l’infarctus du myocarde de 2ème type spécifiquement sur le modèle souris est particulièrement validé dans la littérature et maitrisé au sein du laboratoire. L’utilisation de ce modèle permet également de réaliser ces modèles sur des souris transgéniques le cas échéant, afin de valider une voie de signalisation ou un mécanisme moléculaire sous-jacent. Les souris seront âgées de 9 semaines en début de protocole afin qu’elles atteignent un poids d’environ 30 grammes en fin de protocole. Nous avons choisi de travailler sur des souris jeunes afin d’exclure tout impact du vieillissement sur les paramètres analysés dans notre étude. Nous avons choisi de travailler sur des souris normo-pondérées afin d’exclure un potentiel impact de l’obésité qui pourrait également impacter nos résultats. En effet, notre objectif étant de valider l’impact de la consommation subchronique de sucralose sur les dommages liés à l’ischémie reperfusion périphérique ainsi qu’à l’infarctus du myocarde de 2ème type, nous souhaitons travailler chez des animaux jeunes et sains avant de potentiellement passer sur des modèles plus spécifiques (e.g. obésité).

Capturées dans une lagune au verveux ou à la pêche électrique, qui les paralyse quelques secondes, 1600 anguilles européennes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par un bac obscur, un bain anesthésiant de cinq à quinze minutes, une injection analgésique, puis l'ouverture de l'abdomen pour y implanter un transpondeur RFID, refermée par un pansement. Toutes sont remises à l'eau après un réveil surveillé, ce que le porteur juge "primordial" pour l'objectif de l'étude, savoir par où et quand les anguilles argentées repartent vers la mer. Sur le remplacement, il écrit seulement que l'étude portant sur le comportement en milieu naturel, elle ne peut pas "s'affranchir de l'emploi de poissons sauvages", l'espèce étant classée en danger critique d'extinction.

Objectifs

L’anguille européenne est classée « critiquement menacée d’extinction » depuis 2008 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) et est inscrite depuis 2009 à l'annexe II de la convention sur le commerce international des espèces de faune et flore sauvages menacées d'extinction (CITES). Des plans de gestion au niveau national et par bassin hydrographique fixent des objectifs pour évaluer le nombre d'individus qui colonisent (recrutement des civelles - juvéniles qui arrivent de la mer) et le nombre d'individus qui s'échappent (dévalaison des anguilles argentées - adultes qui repartent en mer pour aller se reproduire). Ce projet de suivi télémétrique a pour objectifs d'améliorer la connaissance relative aux déplacements de l'anguille à l'intérieur d'un système lagunaire et notamment de mieux caractériser sa migration de dévalaison : par où et quand l'anguille argentée cherchent-elles à repartir en mer ? Ces résultats permettront d'identifier des mesures de gestion pour faciliter son retour en mer.

Bénéfices attendus

L'utilisation de la télémétrie RFID (Radio-frequency identification) permet d'enregistrer in situ le passage d'individus identifiés avec une puce de marquage à des points clés du système étudié. Les résultats permettront de connaître les périodes auxquelles les anguilles argentées cherchent à repartir en mer, les voies empruntées, les éventuels obstacles à la migration et l'identification des facteurs environnementaux d'influence. Les résultats de cette étude permettront de plus d'évaluer l'efficacité d'un projet de restauration de continuité écologique. À terme ces résultats permettront d'affiner la gestion des ouvrages de connexion entre les marais et les étangs, et de faire des recommandations pour d'éventuels projets altérant les continuités hydroécologiques.

Procédures

Capture dans un verveux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement, ou capture par pêche électrique : paralysé quelques secondes. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide d'un pansement hydrofuge : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h

Impact sur les animaux

La capture par pêche, leur stabulation dans des bacs, leur anesthésie, la réalisation des mesures biométriques, le marquage par laparotomie, la phase de réveil et de stabulation avant remise à l'eau sont autant d'étapes sources de stress pour les animaux. Une mise en couve des individus (10 par couve) dans leur milieu naturel jusqu'à 3 jours maximum pourra être éventuellement pratiquée, si les captures sont trop nombreuses, ne permettant pas de traiter tout le même jour. Un individu traité sera gardé dans des bacs obscurs avec aération jusqu'à maximum 8h avant d'être relâché dans son milieu d'origine.

Devenir

L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.

Remplacement

L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.

Réduction

L’enjeu de l’étude est de comprendre les déplacements des anguilles supérieurs à 30 cm en fonction de la variation des conditions environnementales, de pouvoir prédire les pics de migration (nombre élevé d'anguilles argentées qui dévalent à la même date) et d'identifier d'éventuels obstacles à la migration. De plus, le marquage des individus permet de récolter des données de capture-marquage-recapture (CMR), des données indispensables pour évaluer les paramètres de dynamique de population (par exemple taux de survie et indice d'abondance). Pour que les modèles de CMR soient robustes et représentatifs de la réalité, il est nécessaire de maintenir un effort de marquage significatif à un pas de temps constant dans le temps sur une période qui couvre le temps de croissance de plusieurs générations. Ainsi, les conclusions attendues par ce présent projet, sur l’étude comportementale de l’anguille, ne peuvent pas s’affranchir de l’emploi des poissons. Au maximum, ce seront 1600 individus au total qui seront marqués sur les 2 années du projet.

Raffinement

Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie (benzocaïne) et analgésie (lidocaïne). Pour limiter la surinfection postopératoire, le marquage sera procédé lorsque les températures de l’eau n’excèdent pas 16°C, soit sur la période d'octobre à avril. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 0.17kg/L (soit 7kg pour 40L). Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à divers points de passage grâce à des stations d'écoute installée dans le milieu naturel. Le suivi télémétrique constitue un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements au sein de système, la dynamique de sa phase de dévalaison, et mettre en place des dispositions pour favoriser sa migration retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Les anguilles supérieures à 30 cm et ayant un poids suffisamment important (>40g) pour supporter l’implantation d’un transpondeur de 23 mm sans affecter leurs constantes vitales seront utilisées. Il s’agit de stades jaune ou argenté de l’anguille. Les individus de 30 cm qui pèsent au minimum 40 g sont marqués avec des transpondeurs de 23 mm qui ont une masse de 0.6 g. L’impact du transpondeur est négligeable lorsque sa masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.