Procédures modérées

Pour constituer une banque de tissus et de fluides partagée entre laboratoires, 150 souris et 30 rats, chez qui des maladies neurodégénératives sont modélisées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soixante d'entre eux subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie, dès l'âge de quatre semaines. Tous sont tués par perfusion à travers le cœur, à partir d'un mois, pour l'examen histologique du cerveau. Le porteur annonce un risque de paralysie lié à la maladie modélisée et présente la banque comme un moyen de "ne pas générer des animaux supplémentaires", alors qu'elle repose sur 180 animaux tués pour la remplir.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont des troubles neurodégénératifs. Les similitudes et les différences entre les maladies neurodégénératives (MN) sont définies en fonction du statut pathologique des zones et des types de neurones affectés. Cependant, on ne sait toujours pas quelles altérations sont les causes ou les conséquences de ces maladies. Ce projet de recherche permettra de mettre en commun nos forces et notre matériel biologique afin d'élucider les points communs et les spécificités des pathologies. Pour ce faire, nous devons construire une bio banque (base de données) de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de MN qui sera utilisée et partagée par tous les investigateurs. Cet effort permettra de réduire le nombre d'animaux générés et utilisés indépendamment par chaque chercheur dans une seule bio banque utilisée et ouverte à tous ceux qui s'intéressent aux MN dans la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Construire une biobanque disponible de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de maladies neurodégénératives Cette biobanque disponible pour tous les laboratoires du departement et aura pour bénéfice de donner un accès aux tissus et aux prélèvements. Cette action permettra leur mutualisation, et ainsi de ne pas générer des animaux supplémentaires.

Procédures

Chirurgie à partir de 4 semaines (2heures sur animal anesthésié) pour 60 animaux Perfusion intracardiaque (sur animal anesthésié) et euthanasie à partir de 1 mois d'âge pour l'ensemble des animaux

Impact sur les animaux

1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie ce risque est compensé par l’analgésie 2/Risque de paralysie du à la MN

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau

Remplacement

La souris et le rat sont les espèces de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement des maladies neurodegenratives. Néanmoins, toutes les étapes préliminaires pouvant être réalisées in vitro, telles que les validations des constructions moléculaires qui seront injectés en intra cerebral le seront sur cultures cellulaires

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat sont deux espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à partir de 4 semaines. Afin de travailler sur des modèles cohérents avec la mise en place de phénotypes pathologiques

Quinze minutes le nez maintenu au contact d'un aérosol de bacilles de la tuberculose, puis un gavage d'antibiotique cinq jours par semaine pendant quatre semaines : 5940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes. L'objet réel du projet est bactérien, il s'agit de savoir quelles fonctions permettent au bacille de survivre à la fois au traitement et à la réponse immunitaire, la souris fournissant le lieu de l'infection. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit les granulomes des phases tardives et que le modèle animal reste "incontournable". Les bénéfices annoncés, des traitements plus courts et plus efficaces, restent au conditionnel, l'infection de près de six mille souris étant, elle, planifiée sur cinq ans.

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier. Cette maladie se caractérise par la persistance des bacilles de la tuberculose chez l’hôte et la longueur des traitements antibiotiques. Plusieurs résultats suggèrent un lien entre la tolérance bactérienne aux médicaments, c'est-à-dire la capacité à supporter certains niveaux d'antibiotiques pendant un certain temps, et la capacité bactérienne à résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, les études qui font le lien entre ces deux domaines manquent cruellement. Nous proposons ici d'explorer les fonctions et les adaptations importantes pour survivre au traitement médicamenteux et à la réponse immunitaire de l'hôte chez les bacilles de la tuberculose. Notre objectif est d’évaluer si cibler des fonctions importantes pour la persistance chez l’hôte et la tolérance aux antibiotiques permet une meilleure efficacité des traitements et une élimination plus rapide des bacilles. Dans des travaux antérieurs, nous avons sélectionné des mutants de bacilles de la tuberculose présentant une persistance accrue chez la souris. Nous avons constaté que la tolérance à l’isoniazide et la rifampicine, deux antituberculeux utilisés en clinique, était également accrue chez ces mutants. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser les mutations responsables et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous construirons ensuite des souches recombinantes de bacille de la tuberculose dans lesquels les gènes identifiés seront soit inactivés soit placés sous contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline. Enfin nous évaluerons dans le modèle souris l'effet synergique des médicaments et de l’inactivation de ces gènes. Les résultats attendus devraient mettre en lumière les caractéristiques mycobactériennes expliquant la pandémie actuelle de tuberculose et fournir des perspectives intéressantes pour le contrôle de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez les bacilles de la tuberculose et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre la tuberculose dans le but de réduire la durée des traitements et d’augmenter leur efficacité.

Procédures

Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose. Pour cela, les souris seront maintenues dans des chambres individuelles de contention permettant de maintenir le nez de la souris en contact avec l’aérosol. Cette opération dure 15 minutes. Certains groupes d'animaux recevront 5 jours par semaine pendant 4 semaines maximum une dose d’antibiotique donnée par gavage.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques . Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (contention) d’une durée d’environ 15 min. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une contention de quelques minutes 5 jours sur 7 pendant 2 ou 4 semaines. L’impact de cette manipulation sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que les bacilles de la tuberculose. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission. Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les granulomes rencontrés dans ces phases tardives et d’étudier la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans ceux-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour ces études. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain. Dans ce projet, les souches mutantes de Mycobacterium tuberculosis seront testées au préalable in vitro et dans des modèles cellulaires mimant les étapes précoces de l'infection. Le modèle souris sera utilisé en cas de résultats positifs pour mimer les étapes tardives.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et administration des antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. L’expérience implique un traitement antibiotique quotidien (5 jours sur 7). Nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux et choisir la voie d’administration la moins contraignante pour les animaux tout en permettant d’observer l’effet des antibiotiques. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons aussi le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté

Choix des espèces

Pour notre projet visant à explorer le lien entre tolérance aux antibiotiques et persistance chez l’hôte par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie , ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

Tuées après leur dernier repas, celui des moustiques, 3600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris élevées pour cela servent huit fois, chaque fois anesthésiées dix à trente minutes le temps que les moustiques les piquent, avec une anémie passagère et une injection de sérum physiologique pour compenser le sang perdu. D'autres viennent des surplus de l'animalerie, animaux qui allaient être tués pour leur génotype ou leur âge, et ne servent qu'à un seul repas. Le porteur écarte le repas artificiel sur membrane parce que 40 à 50 % des moustiques femelles s'y nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant, ce qui menacerait le rendement en œufs de ses 110 lignées.

Objectifs

Les animaux de ce projet seront utilisés pour un élevage d’une centaine de lignées de moustiques que nous utilisons pour nos expériences, qui ont pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les moustiques et le pathogènes qu’ils transmettent, et de mettre au point de nouvelles stratégies de lutte contre ces maladies. Pour ce faire, nous générons diverses lignées de moustiques, sélectionnées en fonction de leur phénotype ou génétiquement transformées, et étudions leur comportement lors d’infections. Les repas sanguins sont nécessaires aux femelles pour pondre leurs œufs. Le site fournit également des services, notamment l’envoi ou l’infection de moustiques, à des laboratoires publics ou privés extérieurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de maintenir les lignées existantes en expérimentation, et d’en créer de nouvelles pour les projets de recherche de notre laboratoire et des laboratoires extérieurs utilisant notre plateforme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour permettre aux moustiques de prendre un repas sanguin pendant 10 à 30min. Ils sont exposés aux nuisances suivantes : (1) injection d’anesthésique, et (2) prélèvement sanguin par les moustiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont limitées. Aucun signe de démangeaison n’est observé après piqûres par les moustiques, et leur récupération est rapide. Cependant, au cours de sa vie, chaque souris est soumise à 8 anesthésies générales avec perte limitée de sang qui génère une anémie passagère.

Devenir

Les animaux surnuméraires qui seront utilisés pour un unique repas sanguin des moustiques seront mis à mort après le repas. Les souris spécifiquement élevées pour les repas sanguins des moustiques seront utilisées pour 8 repas et mises à mort après le dernier repas.

Remplacement

La méthode alternative à savoir la prise de repas sanguins sur du sang humain ou animal à travers une membrane artificielle, n’est pas applicable du fait des contraintes techniques de mise en œuvre de ce système qui ne sont pas adaptées au nombre élevé de lignées de notre élevage (≈ 110 lignées). De plus, lors d’un repas artificiel sur membrane, 40-50% des femelles moustiques se nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant. Ainsi, le rendement en œufs des lignées nourries artificiellement risque d’être insuffisant, et d’interférer avec les expériences ou même de conduire à la perte de certaines lignées.

Réduction

Chaque souris est utilisée en moyenne 6-8 fois pour les repas sanguins. Nous proposons également de récupérer les souris surnuméraires de l’animalerie (souris qui sont mises à mort sans être utilisées dans des protocoles expérimentaux à cause de leur génotype, de leur âge…) pour réaliser des repas sanguins uniques et ainsi réduire le nombre de souris que nous élevons spécifiquement pour les repas sanguins des moustiques.

Raffinement

Les souris utilisées pour le repas sanguins sont hébergées en groupe. Elles bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont anesthésiées pour le repas sanguin puis elles reçoivent une injection de solution saline physiologique pour compenser les pertes en volume sanguin lors du repas des moustiques. Durant le repas, les yeux des souris sont protégés avec un gel pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Pendant la phase de réveil, les souris sont placées sous lampe chauffante pour limiter les déperditions en chaleur. Les souris sont laissées au repos pendant au minimum 4 semaines entre 2 repas sanguins afin qu’elles puissent reconstituer leur stock de cellules sanguines et éliminer toute trace d’anesthésique.

Choix des espèces

Parmi les espèces de rongeurs possibles Mus musculus s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences : - Les moustiques Anophèles et les moustiques Aedes, naturellement anthropophiles, sont capables de se nourrir sur cette espèce. - Les souris ne présentent pas de signe de démangeaison après piqûres de moustiques. - Les souris récupèrent rapidement après avoir été soumises à un repas sanguin. - Les infections des moustiques pour leur phénotypage se font en majorité sur des souris infectées (avec le parasite murin Plasmodium berghei, ou avec les virus de la dengue ou Zika). - Les moustiques sont plus enclins à se nourrir sur les souris infectées quand ils sont régulièrement nourris sur la même source de sang. Nous utiliserons des souris adultes âgées au minimum de 8 semaines (> 35 g) car les souris plus petites risquent une perte volumique trop importante lors des repas sanguins.

Pour répondre à une revue scientifique qui réclame les mêmes expériences sur des femelles ovariectomisées avant de publier un article en révision, 80 rattes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, l'ablation des ovaires en dix minutes puis une ouverture du crâne de trente à quarante-cinq minutes pour implanter une canule à la surface des méninges. Jusqu'à quatre injections de substances inflammatoires y sont faites, une tous les deux jours, suivies de mesures de la sensibilité de la face au filament pendant trois heures, et chaque ratte reste seule en cage jusqu'à deux semaines pour ne pas arracher la canule. Le porteur écrit que la procédure ne permet pas de réutiliser les animaux, toutes sont donc tuées à la fin.

Objectifs

L'objectif général du projet est d'étudier l'influence des hormones dans la migraine, dans un modèle animal qui consiste en l'injection de substances inflammatoires (SI: bradykinine, prostaglandines, sérotonine, et histamine) à l'aide d'une canule positionné à la surface des méninges des rats. Nous avons déjà montré que les males et les femelles à différents cycles hormonaux avaient une douleur migraineuse différente et une sensibilisation des neurones du complexe trigémino-cervical (TCC ) dépendante du cycle hormonal. Ces résultats font l'objet d'un article en révision dans une revue scientifique qui nous demande de réaliser les mêmes séries d'expériences mais avec des femelles contrôles ovariectomisées. Nous souhaitons donc i) évaluer l'intensité de la douleur ressentie, ii) étudier l'activation globale des neurones impliqués dans la migraine, et iii) enregistrer les propriétés électrophysiologiques des neurones du TCC suite à des injections répétées de substance inflammatoire au niveau des méninges et ceci chez des femelles contrôles ovariectomisées.

Bénéfices attendus

Même si la migraine touche plus les femmes que les hommes et est fortement corrélées aux cycles hormonaux, la plupart des études précliniques ont été réalisées chez les mâles. Ainsi, à moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiologiques d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles selon le cycle hormonal. A plus long terme, mieux comprendre cette pathologie pourra nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes et cycle menstruel.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales qui consistent en une ovariectomie et en une craniotomie, pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation (mimant ce qui se passe pendant les crises de migraine). Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. L'ovariectomie dure 10 minutes et l'implantation de la canule dure environ 30 à 45 min. Les injections des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine seront de 1 injection tous les 2 jours avec 4 injections au maximum ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Une mesure de la sensibilité cutanée de la face sera réalisée à l’aide de filament de Von Frey. Les jours d’injection de subsatnces inflammatoires ou de solution physiologique, la mesure des seuils se fera avant et toutes les 45 min pendant 3 heures après l’injection de soupe inflammatoire pour vérifier l'apparition et/ou l'aggravation de l'allodynie.

Impact sur les animaux

La douleur suite aux chirurgies est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour garder en place la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines maximum.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe.

Raffinement

Les rates bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur :si l’animal perd plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit la chirurgie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données que nous avons obtenues et ceux de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

Ce projet ne produit aucune connaissance, il sert à ce que des stagiaires, des contractuels et des titulaires s'exercent aux gestes techniques sur 1000 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris peut recevoir jusqu'à trois actes. Prises de sang à la joue ou à la queue, injections sous la peau, dans la patte, le muscle, l'abdomen ou la veine, instillation nasale sous anesthésie, gavage, pose d'une puce sous-cutanée. Le porteur précise que le nombre de souris dépend de la dextérité de la personne formée, qu'il puise dans les animaux de réforme et de surplus de l'élevage, et que les souris sont tuées selon leur état général ou gardées pour une à deux répétitions à 48 heures d'intervalle. Il écrit que les méthodes non animales, vidéos ou mannequins, "ne sont pas pratiquées" et qu'il les envisagera plus tard "si cela est possible", la formation continue étant réclamée par la réglementation.

Objectifs

Les objectifs pédagogiques et scientifiques de cette formation sont doubles et répondent à la réglementation en expérimentation animale en vigueur et à la maîtrise et au maintien du savoir-faire des expérimentateurs : - former les expérimentateurs à la mise en œuvre d’expérimentation animale : procédures faiblement invasives (injections intrapéritonéale, intradermique et sous-cutanée), pose de puces télémétriques, gavage et prélèvements sanguins. Cette formation fait partie de la formation réglementaire à l’expérimentation animale, du maintien de compétences et du suivi des compétences (livret de compétence individuel). - former les expérimentateurs à la maîtrise de leurs procédures expérimentales, au respect du bien-être animal et à l’utilisation du modèle murin dans leurs projets de recherche. Ce projet est validé par la direction de l’unité sur fonds propres afin de répondre aux attentes réglementaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est la formation du personnel et maintien des compétences des agents permanents et des contractuels temporaires (Main d’œuvre occasionnelle (MOO), contrat à durée déterminée (CDD) et étudiants de tous niveaux).

Procédures

Prélèvement de sang à la veine submandibulaire sur animaux vigiles : 5 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Prélèvement de sang à la veine caudale latérale sur animaux vigiles : 5 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration par voie sous-cutanée, intrapodale, intradermique, intramusculaire et intrapéritonéale, intraveineuse sur animaux vigiles : 10 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration par voie intranasale sous anesthésie générale : 10 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration de liquide par gavage Pose d'une puce télémétrique sous-cutanée sur animaux vigiles : 3 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former.

Impact sur les animaux

Trois actes maximums, décrite dans la procédure, peuvent réaliser sur un même animal. Les principales nuisances attendues seront donc le stress de la contention, la formation d’hématome lié à la prise de sang et les fausses routes au cours d’un gavage. Les différents sites d'injection (Intrapéritonéal (IP), intramusculaire (IM) et sous-cutanée (SC)) peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection, et en cas d’échec à l’injection, un hématome pourrait survenir.

Devenir

Les animaux utilisés par les stagiaires ne peuvent pas être réintroduits dans l’élevage et ne peuvent pas être utilisés pour des expérimentations. Les souris sont donc mises à mort en fonction de leur état général et de la dextérité l’expérimentateur ou conserver pour une à deux répétitions des gestes à 48h d’intervalle avant euthanasie.

Remplacement

A la fin de leur stage ou de leur contrat de travail à durée déterminée, les expérimentateurs sont sensibilisés à l'utilisation d'animaux vivants et savent comment réaliser une expérimentation animale dans sa globalité chez la souris. Il est donc nécessaire que leur formation, pour qu'elle soit complète, comporte des manipulations. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode de remplacement pour étudier les agents infectieux permettant la formation appropriée de nos expérimentateurs. Les méthodes non animales ne sont pas pratiquées. Cependant, dans un futur, nous envisagerons, si cela est possible, d’utiliser ces méthodes.

Réduction

Utilisation des animaux de réforme et de surplus issus de l’élevage principalement et des 2 sexes, soit au total 1000 souris sur 5 ans (20 stagiaires par an pour 10 souris maximum, soit 200 souris par et dont sur 5 ans = 1000). Plusieurs actes pourront être effectués sur une même souris afin de réduire le nombre de souris utilisées Le nombre est à adapter en fonction du nombre d'essais pour les procédures à réaliser. Aucune analyse statistique ne sera réalisée. Les méthodes non animales ne sont pas pratiquées actuellement. Cependant, dans un futur, nous envisagerons, si cela est possible, de réaliser et d’utiliser ces méthodes (vidéos ou mannequins) afin de réduire l'utilisation de souris.

Raffinement

Avant le début de l’expérimentation, les personnes formées sont sensibilisées à la préhension/contention des souris, aux procédures à réaliser et au comportement à avoir afin de limiter le stress des animaux. Les souris sont acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant la formation, et réparties en groupe de 3 animaux socialement harmonieux par cage et avec un environnement enrichi (type sopalin, tunnel (à ronger) ou igloo). Pour toutes les interventions nécessitant une anesthésie générale, les animaux sont maintenus sous tapis chauffant pour leur bien-être, afin de prévenir d’une chute de température corporelle lié à l’anesthésie. Les animaux sont placés dans leur cage les uns contre les autres avec les voies respiratoires dégagées pou favoriser également le réchauffement naturel entre eux. De l’enrichissement pour la nidation est également rajouté dans leur cage. Pas de point limite attendu car uniquement injection d’eau physiologique, donc en théorie pas de douleur attendue en dehors de celle potentielle à l’introduction d’une aiguille, mais tout de fois, si nous observons le moindre signe de mal être, au niveau facial, au niveau du poil (légèrement hirsute) ou au niveau de la posture (légèrement vouté), agressivité, l’animal sera automatiquement euthanasié par le formateur/tuteur.

Choix des espèces

L'unité doit s’assurer de la maitrise des gestes techniques mis en œuvre dans l’unité par l’ensemble du personnel y travaillants. Cette formation (tutorat) fait partie de la formation continue demandée par la réglementation sur l’expérimentation animale et du suivi des compétences de l’ensemble du personnel. L’objectif est de maîtriser certains gestes techniques sur le modèle murin afin de les mettre en œuvre dans des projets scientifiques. 1000 souris d'âges variables en fonction des demandes scientifiques : 20 stagiaires en moyenne par an et pour 10 souris maximum par stagiaire, soit 200 souris par an. La demande est prévue pour 5 ans et dont un total maximum de 1000 souris d'âges variables en fonction des demandes scientifiques.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard sept jours après le début de la procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule administration du composé, une injection dans l'abdomen ou un gavage de trente secondes, et son sang comme ses organes sont prélevés après la mise à mort. Le projet ne mesure pas l'efficacité de la molécule mais son trajet dans le corps, absorption, diffusion, élimination, afin de choisir la dose et la voie des futures études sur des souris atteintes de cancers du sang. Le porteur indique avoir calculé l'effectif par groupe avec des logiciels statistiques reconnus, sans dire combien de groupes il prévoit ni ce qui conduit à 370 animaux.

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Les traitements des cancers hématologiques peuvent entrainer un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une petite molécule qui a montré lors de précédentes études, un effet prometteur sur des cellules de cancers hématologiques. Cette molécule ou composé est capable d’être internalisé par les cellules, et d’empêcher l’interaction de différentes molécules, ce qui permet de perturber la survie et la prolifération des cellules tumorales puis de jouer sur leur résistance à différents stress cellulaires. Une étude de ce composé a déjà été réalisé au préalable chez la souris, celle-ci avait pour but de définir sa tolérance par l’animal selon les modes d’administration. Ayant connaissance de ces informations, le présent projet vise à étudier le devenir de ce composé dans l’organisme une fois administré. Différentes voies d’administrations, différentes doses seront testées chez l’animal et une analyse du composé dans le plasma au cours du temps, nous permettra alors d'étudier au bout de combien de temps celui-ci est-il est détectable dans le sang, la quantité maximale que l'on va pouvoir atteindre et au bout de combien de temps il va être éliminé. L’objectif principal étant alors grâce à ces informations, de conclure quant à la voie et la fréquence d’administration, ainsi que la dose, qui seront préférées pour de futures études d’efficacité de ce traitement sur des souris atteintes de cancers hématologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intrapéritonéal (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang et d'organes sont réalisés en post-mortem.

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille lors de l'injection intrapéritonéale. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n'ont été observé chez la souris lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 7 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancer sur lequel il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez la souris a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de projets futurs son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantitiés maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de souris par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez la souris, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les souris seront observées tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé ou le véhicule sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez la souris non consanguine. Les souris non consanguines sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les souris non consanguines présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.

120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux examens d'imagerie de l'œil sous anesthésie gazeuse, un électrorétinogramme de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, et pour une partie d'entre elles une exposition à une lumière forte pendant trois heures, éveillées. L'objectif est de mesurer ce que devient la rétine quand une protéine protectrice manque, dans une lignée dont le porteur précise qu'elle ne développe pas de maladie grave. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit un trajet optique complet et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Les Rétinopathies Pigmentaires (RP) touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, les photorécepteurs à bâtonnets puis à cônes, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. Les études menées antérieurement par l’équipe sur les RP ont mis en évidence un gène qui code pour des facteurs ayant une fonction protectrice sur les cellules touchées. Une des deux protéines est sécrétée par un type de photorécepteurs, les batônnets et a une activité protectrice sur le 2ème type de photorécepteurs, les cônes. Le second produit du gène, joue un rôle protecteur contre l'oxydation. Pour ce faire, nous avons étudié les conséquences de l’absence d'un des produits du gène à l'aide d'un modèle de souris transgénique sur la fonctionnalité des photorécepteurs lié au stress oxydatif en comparaison avec des animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Les rétinites pigmentaires (RP), sont les formes les plus communes des dégénérescences rétiniennes congénitales. Elles touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer.

Procédures

- L’imagerie oculaire: examens réalisés sous anesthésie gazeuse sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée : 20 minutes par animal et par passage. Examen réalisé 2 fois par animal, espacé de 2 semaines. - Electrorétinogramme: examen réalisé sous anesthésie générale sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée 45 minutes. Examen réalisé une seule fois par animal. - Surexposition lumineuse pendant 3 heures sur animal vigile avec une seule mesure tout au long de l'expérience. Les animaux testés pour la surexposition lumineuse, auront avant le test, une injection sous-cutanée de sérum physiologique puis une pesée avant et après le test de surexposition lumineuse pour évaluer l'effet de cette surexposition sur une déshydratation éventuelle.

Impact sur les animaux

L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra-péritonéales et les examens phénotypiques de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent être considérées comme une nuisance de douleur légère et de courte durée dû à l'introduction de l'aiguille Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers. L'exposition des animaux à une lumière forte peut entrainer une déshydratation se traduisant par un poil hérissé dû au positionnement de la cage, placée en dessous des néons et séparés par une plaque en plexiglass.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale pour les analyses post-mortem. L’euthanasie est requise afin de procéder aux différents prélèvements nécessaires en vue des analyses à mettre en œuvre pour répondre à la question scientifique

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Il y a nécessité d'avoir la rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Dans ce projet, le modèle animal développé s'inscrit dans certaines caractéristiques de pathologies. Il n’y a donc pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement en fonction des naissances. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel adapté. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque groupe a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe, en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (rentabilité technique). Ce projet impliquera au maximum 120 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. L’application de cette échelle adaptée à nos expérimentations pourra nous amener à décaler dans le temps les actes prévus dans la séquence expérimentale. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale adaptée. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées avec un logiciel adapté. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Le raffinement réside aussi dans le fait de concevoir les expériences en limitant au maximum l'utilisation de groupes contrôles surnuméraires. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique permettant d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt. Cette souris ne présente pas de phénotype dommageable car elle n'entraine pas le développement d'une maladie grave. Nous avons sélectionné cette espèce car la rétine de la souris est semblable en plusieurs points à celle de l’Homme (organisation des couches neuronales, les membranes, la vascularisation, les circuits). Nous voulons commencer les études juste avant l’apparition de modification de la structure de la rétine (du fait du modèle animal). Les animaux auront environ deux mois à leur entrée dans les procédures expérimentales.

48 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque femelle retenue passant dix fois deux heures sous anesthésie, intubée et sous myorelaxant, à raison d'une acquisition IRM par semaine pendant dix semaines. Vingt-quatre femelles gestantes sont d'abord anesthésiées pour dater leur gestation, avec un prélèvement de 12 mL de sang. Aucune n'est tuée, elles sont sorties de leur groupe social le temps des acquisitions puis réintroduites, et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Le porteur écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de façon répétée pendant plus de dix semaines, et applique précisément ce protocole à des babouines gestantes.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

Nées avec une croissance dentaire anormale, des dents trop longues et incontrôlées pour certaines, rabougries pour d'autres, 2700 souris génétiquement modifiées sont élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À dix jours, chacune se voit couper un morceau de queue pour vérifier son génotype. Le porteur indique que la douleur y serait alors faible, voire nulle, l'ossification de la queue n'ayant pas commencé, et prévoit de la nourriture en gelée et des bâtonnets à ronger pour compenser les difficultés à s'alimenter. Cet élevage ne répond par lui-même à aucune question scientifique, il alimente de futures demandes d'autorisation sur les macrophages, et les animaux conservés à l'issue rejoignent d'autres projets.

Objectifs

Nous élevons une lignée de souris génétiquement modifiées qui présente un phénotype spécifique, impliquant des altérations physiologiques et comportementales. Ces souris, en raison de modifications précises de leur génome, affichent une croissance anormale des dents. Cette anomalie dentaire peut entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui, à son tour, peut causer un retard de croissance et une diminution de leur poids corporel. Pour atténuer ces effets néfastes, nous mettons en place une prise en charge adaptée, incluant une alimentation spécifique qui compense les limitations dues à la croissance dentaire. Ces souris sont produites dans le but de répondre à des objectifs scientifiques variés. En raison de leur modification génétique, elles sont un modèle précieux pour étudier les rôles spécifiques de certaines cellules immunitaires, comme les macrophages, qui jouent un rôle crucial dans divers tissus du corps. La suppression de certaines populations cellulaires permet d'examiner en profondeur les conséquences de leur absence, ce qui est pertinent pour la recherche sur le développement et la régulation immunitaire. De plus, ces souris modifiées sont utilisées pour modéliser diverses pathologies comme le cancer ou l’étude des rôles homéostasiques des macrophages. Permettant ainsi dans l’avenir des applications biomédicales.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, la recherche sur les macrophages a émergé comme un domaine clé en immunologie. Ceci est dû à notre compréhension croissante du rôle vital de ces cellules dans l'homéostasie des tissus et leurs divers rôles significatifs dans différentes maladies tels que le cancer, les infections ou encore maladies auto-immunes. Le premier Conseil Scientifique Présidentiel réuni en avril 2024 a spécifiquement souligné les macrophages comme un "axe majeur et émergent" pour les années à venir. Ce modèle de souris va permettre d'étudier le rôle de plusieurs populations de macrophages dans divers tissus très localisés. Les différentes caractéristiques observées après génération des souris confirment d'ailleurs la nécessité de comprendre leurs fonctions et l'utilité de ce modèle pour y répondre.

Procédures

2700 souris se verront prélever un morceau de queue 10 jours après leur naissance.

Impact sur les animaux

Après la première génération de souris, nous avons observé que certaines étaient plus petites que leurs congénères du même groupe. Nous avons également constaté une croissance anormale des dents : certaines souris présentaient des dents nettement plus petites et plus fines, tandis que d'autres avaient des dents beaucoup plus longues avec une croissance non contrôlée. Ces deux problèmes pourraient être liés, la croissance anormale des dents pouvant entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui diminuerait la prise de poids. Un prélèvement de la queue sera réalisé sur les animaux 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le système nerveux de cette partie est encore immature et l’ossification de la queue inexistante.

Devenir

Les animaux qui sont conservés après la fin de cette étude seront utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche. Cette utilisation continue permet de maximiser les données obtenues à partir des animaux tout en respectant les principes d'éthique de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet décrit l’élevage de souris génétiquement modifiées en condition de maintien pour une lignée à phénotype dommageable. Ces souris seront utilisées pour de futures demande d’autorisation de projet interrogeant la fonction des macrophages ciblés. Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et son microenvironnement puisque nous ne connaissons pas l’ensemble des signaux.

Réduction

Nous maintiendrons un élevage à minima sur la base de 5 accouplements avec 1 mâle et 3 femelles par accouplement car cette lignée semble avoir des portées de petites tailles. Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.

Raffinement

- de la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage pour surmonter toutes les difficultés d'alimentation des souris. - Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées lorsque cela sera nécessaire. - Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux seront surveillés pendant cette période d’accouplement et d’élevage et des mesures adéquates prises en cas de comportement agressif allant de l’enrichissement de la cage en dômes, de mesures d’isolement temporaire en cas de comportement agressif, en l’’administration de crème par voie cutanée sur de possibles blessures pourront être mises en place si nécessaire.

Choix des espèces

L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour de futures recherches. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement en fonction des projets dans lesquels ils seront impliqués. Par exemple, si nous nous intéressons au développement dentaire qui est altéré dans ce modèle, nous analyserons des souris durant les premières semaines après la naissance. Pour les projets étudiant le rôle des macrophages de la tête et du cou dans diverses pathologies (cancer, infection), des animaux adultes seront utilisés. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6 à 10 semaines au moment du début de l'accouplement.

2 880 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois administrations par jour pendant trois semaines et subir six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 2 700 souris sont tuées et 180 réutilisées ailleurs, ces dernières étant celles sur lesquelles un geste invasif a été pratiqué sans qu'un candidat médicament leur soit administré. Gavage à la sonde, injections intraveineuses après passage en enceinte thermorégulée, injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales et sous-cutanées, instillations oculaires, recueil d'urine de quatre heures, examen ophtalmologique, prélèvement en veine jugulaire sous anesthésie juste avant la mise à mort : le porteur ajoute que la molécule testée peut par elle-même provoquer des effets cliniques. Il s'agit de trouver la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité, et le porteur présente ce projet comme une réduction des contraintes futures, puisque les études suivantes utiliseront davantage de souris.

Objectifs

L’objectif principal de la recherche et développement (R&D) est de développer de nouveaux candidats médicaments chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. des études préliminaires in vivo de sécurité non clinique sont mises en place sur des espèces rongeurs afin de déterminer un profil de sécurité robuste des nouvelles molécules avant administration chez l’Homme,. le développement d’un médicament nécessite d’évaluer à la fois : - la sécurité : par des études de toxicologie sur la souris (procédures encadrées par la présente DAP). - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres DAP). Ces études in vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo d’efficacité) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après des étapes de caractérisation/sélection in vitro (modèles cellulaires de toxicité) et in silico (ex. analyse informatique de la génotoxicité). A ce stade ni la dose efficace ni la première dose toxique in vivo ne sont connues. La réalisation de ces études chez la souris permet de déterminer un intervalle de doses tolérées par l'animal ainsi que la dose maximale à ne pas dépasser. Ces données sont essentielles pour que les études de pharmacologie, utilisant un effectif plus important de souris, puissent être réalisées dans des conditions optimales. Dans ce projet, des études de sécurité non clinique chez la souris seront réalisées afin de prédire la toxicité chez l’animal dans les études d’efficacité qui nécessiteraient d’utiliser de fortes doses et/ou des doses potentiellement toxiques (souvent le cas en oncologie). Elles permettent d’évaluer sur une courte durée et avec moins d’animaux si la dose et le schéma d’administration seront bien tolérés dans les études d’efficacité. L’utilisation de doses croissantes dans ces études peut permettre d’identifier la Dose Maximale Tolérée (DMT) pour un produit (ou un nouveau véhicule) et de l’utiliser en toute sécurité dans les études ultérieures. Ces études utilisent des souris ayant le même fond génétique (modèle non pathologique avec phénotype dommageable non exprimé) que les études d’efficacité afin qu’elles soient les plus prédictives possibles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet aux doses envisagées en efficacité et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux seraient soumis dans les études d’efficacité par la suite et qui, elles, utiliseront un nombre plus important d’animaux.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 3 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration sous-cutanée d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 4h heures sur sable hydrophobe (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang en veine jugulaire réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 1 jour à 3 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : •Administration orale de la molécule : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour). (Degré de sévérité léger) •Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). •Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une ip unique ou modéré si l’administration ip est réitérée. Pour les autres types d’administrations degré léger. •Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal. (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) •Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) •Recueil urinaire (sable hydrophobe) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (4 heures maximum) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. . Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet

Remplacement

Ce projet couvre les études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. De méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo. Cependant, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes après ces premières étapes de sélection par des méthodes alternatives. Les études incluses dans ce projet ont un design optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données essentielles pour les études ultérieures.

Réduction

Les molécules les plus prometteuses sont sélectionnées à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux est adapté à la variabilité des paramètres étudiés et prend en compte l’homogénéité des souches, la disponibilité de données historiques pour les paramètres étudiés et de leur variabilité. Pour ces études, le nombre habituel d’animaux est déterminé pour être le compromis le plus efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Il permet d’intégrer de la mixité male/femelle dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Exceptionnellement ce nombre peut être ponctuellement augmenté dans le cas où la variabilité d’un paramètre serait élevée (ex : haute variabilité individuelle dans la distribution du produit). Ces études permettent de confirmer les premières données in vitro, avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles participent à la réduction du nombre total d’animaux utilisés par projet thérapeutique car les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie utilisant un nombre d’animaux plus important en prédisant la toxicité éventuelle aux doses testées. Selon la procédure, un ensemble d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire. Dans le cas d'un véhicule bien connu, les données historiques internes vont permettre de réduire le nombre d'animaux dans l'étude en supprimant le groupe témoin véhicule). En cas de protocole particulier (ex : nouveau schéma d’administration ou besoin de suivre plus précisément un paramètre/biomarqueur particulier), le service de biostatistiques pourra aider à définir le design expérimental adapté. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) peu invasive, rapide, permet de permet de réduire le nombre d’animaux en réalisant une cinétique complète sur un même individu (sans animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Ces études permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Les administrations pourront être réalisées de manière décalée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe pourraient ne pas être traités ou leur dose administrée pourrait être diminuée. Dans tous les cas, si apparition de signes cliniques, une décision rapide est prise entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Cette décision peut mener à une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de dose ou une euthanasie, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude (si besoin utilisation du score d’une grille de points limites spécifique à la souris). L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement strictes empêchant ainsi l’expression du phénotype dommageable lorsque les animaux utilisés sont immunodéprimés. Les animaux sont manipulés par un personnel technique formé au bien-être animal afin de limiter le stress et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (ex : contention pour administration intraveineuse. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire), avec de l’enrichissement adapté à la souris (matériel de nidification). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques. Elle permet d’éviter le placement de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux. La durée du recueil urinaire sera limitée à son minimum (max 4h) et réalisé en cage conventionnelle en remplaçant la litière par du sable hydrophobe. Cela permet d’éviter l’usage de cage à métabolisme (environnement plus stressant). Dès qu’un acte expérimental nécessite une incision (ex: prélèvement de sang en veine jugulaire), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

L‘unique procédure de ce projet sera réalisée sur l’espèce souris car elle intervient en amont des études d’efficacité réalisées sur ce modèle. De plus cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont chez le rongeur. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.