Procédures modérées

Brûler la patte arrière de souris pour en tirer des cultures de cellules osseuses : 144 souris sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Chacune est épilée sous anesthésie, puis sa patte arrière est irradiée aux rayons X de basse énergie pendant vingt minutes au maximum, avant un suivi quotidien du pic lésionnel entre le septième et le trentième jour. Le porteur décrit sur la zone irradiée un œdème, une desquamation, un érythème, parfois une nécrose, une rétractation des tissus à la cicatrisation et une mobilité réduite de la patte. Tous les prélèvements sont faits après la mort, et le porteur qualifie le passage par un modèle "in vivo" d'"indispensable" pour mettre au point ces cultures cellulaires.

Objectifs

Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Ces expositions peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voire osseuse dans les cas les plus sévères. Afin d’avancer dans la connaissance scientifique des expositions accidentelles induites par des rayons X de basses énergies et de contribuer à l’amélioration de la prédiction du risque de complications, nous avons développé un modèle de brûlures radiologiques induites par des rayons X de basses énergies chez la souris (irradiation localisée de la patte). Afin de mieux comprendre les processus biologiques mis en place suite à une exposition avec ces rayons X de basses énergies pour lesquels le dépôt de dose est très hétérogène (Dtissu ≠ Dmoelle ≠ Dos), nous souhaitons mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires, ostéoblastes et ostéoclastes, à partir de prélèvements faits chez la souris afin d’étudier l’impact de l’irradiation et du temps sur le devenir et les capacités de ces cellules. En effet, les ostéoblastes, d’origine mésenchymateuse, jouent un rôle clé dans la formation et la minéralisation de l’os tandis que les ostéoclastes, d’origine hématopoïétique, jouent un rôle clé dans la résorption osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires à partir de prélèvements médullaires fait chez des souris irradiées localement avec des rayons X de basses énergies. Au-delà de la mise en place de ce protocole pour notre projet de recherche, à plus long terme, nous souhaitons grâce à ces modèles de cultures cellulaires primaires mieux comprendre les processus biologiques impliqués dans l’homéostasie osseuse suite à une irradiation.

Procédures

Epilation des pattes sous anesthésie (environ 10 minutes) Irradiation patte arrière sous anesthésie (maximum 20 minutes) Scoring des lésions (contention, environ 1 minute) Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce modèle expérimental de gravité modérée nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle une évaluation de la brulure radiologique basée sur du scoring lésionnel sera effectuée entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel) par des personnes formées à l’évaluation de ce type de lésions. L’irradiation localisée de la patte peut entrainer les signes suivants au niveau de la zone irradiée : œdème, desquamation, érythème, voire nécrose dans certains cas. Il s’en suit une cicatrisation qui peut conduire à une rétractation des tissus. Cette irradiation peut entrainer une mobilité moindre de la patte irradiée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les cultures primaires et les analyses éventuelles.

Remplacement

Dans le but de mettre en place des cultures cellulaires primaires et d’étudier l’impact de l’irradiation sur ces cellules irradiées in vivo, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation). Tout événement non attendu sera également tracé, répertorié et des actions seront mises en place si nécessaire.

Réduction

Ce projet prévoit d’utiliser au maximum 16 souris par groupe de dose et par temps. Comme nous allons procéder en étape Go / no Go l’intégralité des souris ne seront peut-être pas utilisées. L’objectif est d’avancer pas à pas afin d’utiliser le moins de souris possible pour la mise en place de ces cultures cellulaires primaires.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel, basé sur l’observation des modifications des tissus, ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce modèle expérimental de gravité modérée où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé pour des irradiations avec des rayons X de basse énergie au sein de notre. Le mise en place de ces cultures cellulaires primaires fait suite à ces deux projets afin de mieux comprendre l’impact de l’irradiation sur les ostéoblastes jouant un rôle clé dans la formation osseuse et la minéralisation et les ostéoclastes impliqués dans la résorption osseuse. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.

Quatre cents ovariectomies, trois cents agressions électriques de la carotide, trois cents agressions mécaniques, deux cent quarante poses de capsule ou de mini-pompe sous la peau : ces actes se répartissent sur 610 souris, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 600 d'entre elles, et le porteur prévoit d'enchaîner plusieurs interventions sur les mêmes animaux "dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général". Une souris qui montre des signes de douleur importante ou perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée. L'objectif est d'évaluer un récepteur des rythmes biologiques comme cible thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires, ce qui conduit à opérer les femelles pour leur retirer les ovaires afin de mimer la privation œstrogénique de la ménopause.

Objectifs

En termes de santé publique, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde, avec un coût estimé à 196 milliards d'euros en Europe. Outre les médicaments diminuant les taux de lipides les médecins ne disposent en effet pas de stratégie thérapeutique alternative efficace pour traiter les patients à haut risque cardiovasculaire et réduire le risque résiduel cardiovasculaire. À cette fin, l'identification de cibles thérapeutiques originales est indispensable. Sur la base de nos données préliminaires convaincantes et solides, ce projet a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur régulant les rythmes biologiques dans les artères, notamment dans le processus de cicatrisation endothéliale. Cibler ce récepteur par des approches pharmacologiques pourrait donc représenter un nouveau traitement alternatif aux médicaments actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients. Cette question, qui englobe des aspects intégrés, nécessite le recours à l'expérimentation animale dans le respect des normes éthiques. L’impact du genre/sexe ainsi que de la ménopause étant déterminant dans l’apparition/le traitement des maladies cardiovasculaires, les deux sexes seront étudiés, ainsi que l’impact de la privation oestrogénique mimant la ménopause (période à haut risque cardiovasculaire chez la femme).

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de proposer un nouveau traitement alternatif aux médicaments hypolipidémiants actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients.

Procédures

Certains animaux seront soumis à différentes interventions : - Injection intrapéritonéale (5 à 10sec) (240 animaux) - Pose de capsule ou mini-pompes en sous cutanée (5 à 10min) (240 animaux) - Ovariectomie (10 à 20min) (400 animaux) - Agression électrique de la carotide (20 min) (300 animaux) - Agression mécanique de la carotide (20-30 min) (300 animaux)

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisés dans ce projet sont de classe modérée (ovariectomie, pose de capsule, pose de mini-pompes, agression électrique ou mécanique de la carotide). Elles peuvent générer une douleur mais qui sera traitée par analgésique. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

L'utilisation du modèle murin nous permettra d'identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales auxquelles sont soumises les cellules endothéliales, d'autant plus que l'expression du récepteur des œstrogènes est perdue dans l'ensemble des lignées cellulaires endothéliales. Par ailleurs, l'étude de l'effet du sexe, via la sécrétion d'hormones stéroïdiennes telles que l'œstrogène et la testostérone, implique de multiples fonctions, tissus et cellules dans l’organisme, qui ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est l'unique approche permettant la réalisation de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris resteront en acclimatation pendant un minimum d'une semaine en présence d'enrichissement (de type cartons, batôns ou balle en bois) pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (variation de poids corporel, apparence et mobilité de l'animal, comportement à la contention) seront surveillés permettant de mettre en application l’arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d’arrêt des souffrances. Pour l’ensemble des chirurgies, les animaux sont gardés sur plaque chauffante pendant toute la procédure jusqu'à leur réveil. Un analgésique (morphinique) sera administré. En post opératoire, les souris sont surveillées et pesées. En cas d'amaigrissement excessif (>20%) ou de signe de souffrance de l'animal (apathie, yeux fermés, absence de toilettage, prostration, blessure), l’animal sera sorti de la procédure et euthanasié.

Choix des espèces

Mus musculus. La souris est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardio-métaboliques Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisé chez la souris adulte (à partir de 8semaines).

548 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 264 opérées une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur les muscles abdominaux, puis hébergées seules dès le réveil. Sur ces souris maintenues éveillées, une pression est appliquée dans le côlon pendant dix secondes et répétée par paliers croissants pendant qu'on compte leurs contractions abdominales, stimulus que le porteur qualifie lui-même de douloureux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 284 animaux et modéré pour 264, d'autres souris passant 23 heures en cage à métabolisme, d'autres étant mises à reproduire pour étudier l'effet du régime maternel sur la descendance. L'objet est de savoir si le fer héminique de la viande rouge, de la charcuterie ou d'un substitut végétal à base de léghémoglobine de soja aggrave la sensibilité du côlon, les retombées annoncées pour les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable se limitant à des recommandations nutritionnelles à préciser.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique répandue (5-10% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est également une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Le diagnostic pour ces patients repose en partie sur l’évaluation de leur sensibilité viscérale, qui se trouve exacerbée en réponse à l’application d’une pression appliquée sur la paroi du côlon par rapport à la sensibilité perçue par une personne saine. Bien que les causes de ce syndrome restent peu comprises, il est établi que la composition du régime alimentaire influence fortement l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de sensibilité viscérale chez ces patients, mais une étude chez la souris montre que la consommation d’un régime riche en fer héminique engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de répondre à 3 questions : 1- La sensibilité accrue induite est-elle équivalente quelle que soit la forme du fer héminique consommé ? La sensibilité viscérale induite sera mesurée chez des souris chez lesquelles le fer héminique du régime sera apporté sous forme (i) purifiée, (ii) d’hémoglobine ou (iii) de viande. 2- La mise sur le marché d’une préparation à base de léghémoglobine de soja, à savoir une molécule de la même famille que l'hémoglobine de la viande, mais d'origine strictement végétale, est envisagée en Europe pour produire des substituts de viande. Au regard de la proximité de ces deux molécules, ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est-il susceptible d’engendrer des effets sur la physiologie et la sensibilité du côlon ? 3- Sur le plan nutritionnel pendant la gestation et la lactation, un apport suffisant en fer, même héminique, est crucial. Une consommation maternelle excessive en produits carnés riches en fer héminique (environ 20% des femmes) est-elle susceptible de prédisposer sa descendance à des troubles digestifs tels qu’une sensibilité viscérale augmentée ?

Bénéfices attendus

En termes de santé publique, ces études permettront de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries, ou encore la consommation de substituts de viandes préparés à base de léghémoglobine. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale, et chez la femme enceinte et allaitante, pour qui durant ces périodes, l’apport en fer est essentiel.

Procédures

Sur les 548 souris nécessaires à la réalisation de ce projet, 152 d’entre elles seront dédiées à la reproduction pour une exposition nutritionnelle périnatale. 228 souris nourries avec un régime dont la source de fer consommée (ou celle consommée par leur mère) sera contrôlée, seront placées chacune 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. 264 souris nourries en parallèle avec ces mêmes régimes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h maximum par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Pour la mesure de sensibilité viscérale, le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intra-colique pendant 10 secondes et répétée 4 fois par palier croissant.

Impact sur les animaux

Des groupes de souris, dont la source du fer consommé (ou consommé par leur mère selon la fenêtre d’exposition concernée) sera contrôlée, seront placés 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. Le stress modéré induit par la stabulation sur grille et l’isolement transitoire, pourrait modifier la mesure de la sensibilité viscérale, c’est pourquoi ces groupes de souris seront uniquement destinés à la collecte des échantillons fécaux et urinaires. En parallèle, pour la mesure de la sensibilité viscérale, les souris exposées à ces différentes sources de fer seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h par intervention pour implanter le dispositif de mesure sur les muscles abdominaux, ce qui suppose un inconfort lors de la phase de réveil, de récupération et lors des contentions effectuées pour l'administration des traitements post-opératoires (injections sous cutanées) et la vérification des points de suture. La préservation de ce dispositif implique un hébergement en cage individuelle à partir du réveil, et donc un stress lié à un isolement transitoire. La mesure de sensibilité viscérale requière que la souris reste vigile. Le stimulus douloureux ressenti résultera d’une augmentation de la pression intra-colique appliquée pendant 10 secondes à 5 reprises par palier espacés chacun de 10 minutes. Cette mesure est donc associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Remplacement

Les modèles cellulaires ont montré que des molécules formées dans le côlon lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différente selon que la cellule exposée soit saine ou pré-tumorale. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale, que ce soit chez la souris adulte ou chez sa descendance. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de cette exposition directe ou indirecte à ces contaminants d’origine alimentaire néoformés dans le contenu du côlon. La mesure de la sensibilité viscérale en réponse à l’application d’une pression intra-colique reste par ailleurs la méthode employée chez les patients pour fiabiliser le diagnostic du syndrome de l’intestin irritable.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure de sensibilité viscérale sur le plan technique (expérience de l’expérimentateur) et du bien-être de l’animal. Ces améliorations ont permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaire. Ce nombre sera réduit à 6 pour les lots parallèles destinés aux prélèvements fécaux et urinaires. Par ailleurs, le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact des régimes maternels sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept du DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne parfois des individus surnuméraires : les femelles restées non gestantes, les mâles après la phase de reproduction ainsi que les nouveaux nés surnuméraires. Ils serviront de témoin d’exposition pour la collecte d’échantillons, préservant ainsi les femelles gestantes et leur descendance d’un cumul d’interventions. Une saisine a déjà été anticipée en parallèle pour réaffecter ces souris surnuméraires à d’autres mesures complémentaires comme la mesure de la motricité intestinale. La reproductibilité et fiabilité des résultats sera assurée par une répétition indépendante des expérimentations. Une analyse statistique univariée par facteur sera réalisée et des approches multivariées couplées à des analyses de corrélations permettront d'exploiter au maximum l'ensemble des données qui seront générées.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être des souris et de leurs conditions d’hébergement : des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires seront effectuées, et pour minimiser le stress lié aux périodes d’hébergement en cage individuelle, les cages transparentes seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Des planches de fibre de coton déchiquetables (nestlets) leur seront distribuées pour satisfaire leur besoin de nidification et d’exercice, facilitant leur thermorégulation au sein du nid et celle de leur portée dans le cas de l’étude périnatale. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière (ou sur la grille en cage à métabolisme) leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Une observation des souris à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra de détecter à temps toute anomalie éventuelle et de minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation).

Choix des espèces

La souris est un modèle courant pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons retenu une souche pour laquelle nous avons une grande expérience et une bonne base de connaissance à propos de sa physiologie digestive (barrière intestinale, système immunitaire, microbiote et sensibilité viscérale), comme de son comportement face aux produits d’anesthésie. En outre, le modèle choisi présente l’avantage d’être particulièrement sociable, la souche de souris choisie ne nécéssite pas en effet de contention pour la manipuler, et les femelles portent une grande attention envers leur descendance, ce qui limite le cannibalisme. Quelle que soit l’étude considérée, la mesure de la sensibilité viscérale requiert un tractus digestif mature. Des animaux adultes âgés de 9-11 semaines seront donc utilisés. En amont et pour permettre d’avoir des phases d’exposition aux différents régimes, nous réceptionnerons donc des souris âgées de 6 semaines pour les études chez l’adulte et des souris en âge de procréer (7-8 semaines) pour l’étude dédiée à une exposition maternelle pendant la gestation et la lactation.

Deux cent soixante-quatre souris échapperont à la mise à mort pour être replacées dans un autre projet, faute de porter la modification génétique voulue, les 576 autres seront tuées, reproductrices comprises. 840 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 324 d'entre elles et modéré pour 516. Tatouées et amputées d'un fragment de queue vers sept jours, elles reçoivent un traitement oral, et une partie subit la destruction des cellules immunitaires de ses pattes arrière suivie d'une greffe qui la laisse quinze jours avec un système immunitaire incomplet, quand d'autres passent douze semaines sous régime gras avec des tests de tolérance au glucose faits à partir d'une incision de la queue. Le porteur calcule ses effectifs sur des groupes de cinq à huit souris, sans expliquer comment il parvient à 840.

Objectifs

Ce projet vise à étudier le rôle des macrophages pancréatiques dans l’homéostasie du pancréas et durant le diabète de type 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans tous les tissus, jouant un rôle crucial dans la défense contre les infections, la résolution de l'inflammation et la régulation de la réponse immunitaire. Ces cellules peuvent être trouvées dans tous les tissus et organes, où elles remplissent des fonctions spécifiques adaptées à leur environnement local. Dans le contexte du pancréas, les macrophages pancréatiques peuvent jouer un rôle crucial dans la régulation de l'inflammation, de la réponse immunitaire et de la fonction des cellules bêta productrices d'insuline. Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique caractérisée par une résistance à l'insuline et une production insuffisante d'insuline par le pancréas entrainant une hyperglycémie chronique. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, ou facteur de stimulation des colonies 1, une protéine qui permet aux macrophages de survivre, se développer et fonctionner correctement. Le Csf1 est produit par les cellules du micro-environnement des macrophages. Des résultats préliminaires obtenus dans un projet précédent suggèrent une dépendance de certains macrophages pancréatiques à l'égard du Csf1 produit par les fibroblastes, des cellules de soutien du tissu. Comprendre la fonction des macrophages et leur interaction avec d'autres cellules pancréatiques est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le diabète de type 2. Notre projet a 3 objectifs principaux : 1/ Étudier l’impact de la délétion fibroblastique de Csf1 sur les macrophages pancréatiques 2/ Etudier le renouvellement des macrophages au sein du pancréas 3/ Déterminer si les macrophages pancréatiques jouent -un rôle clé au cours de l’évolution du diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Le pancréas, un organe vital du système digestif et endocrinien, joue un rôle crucial dans la régulation du métabolisme glucidique et la production d'insuline. Son dysfonctionnement est intimement lié à des pathologies telles que le diabète de type 2, une maladie métabolique chronique en constante augmentation dans le monde. Comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans le développement du diabète de type 2 est essentiel pour améliorer sa prise en charge. Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels. Tout d'abord, en examinant l'impact de la délétion de Csf1 dans les fibroblastes sur les macrophages pancréatiques et la physiologie du pancréas, nous pourrions identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler la réponse immunitaire dans le pancréas et potentiellement prévenir ou traiter le diabète de type 2. De plus, en étudiant comment les cellules immunitaires appelées macrophages sont recrutées dans le pancréas à l’état physiologique, nous pourrions mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de l'équilibre immunitaire dans cet organe crucial. En comprenant le rôle des macrophages pancréatiques dans la tolérance au glucose et l'insulinémie à l'état physiologique, nous pourrions développer des approches plus précises pour réguler la glycémie et améliorer la sensibilité à l'insuline. Enfin, en déterminant si les macrophages pancréatiques jouent un rôle crucial dans l'évolution du diabète de type 2, nous pourrions ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement de cette maladie complexe. En somme, ce projet offre un potentiel significatif pour une meilleure compréhension du diabète de type 2 et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Procédure 1 : En générant les lignées d’intérêt pour cette étude nous obtiendrons des accouplements avec une descendance que nous aurons besoin d’identifier afin d’obtenir les souris avec la modification génétique voulue. Pour ce faire les souris seront tatouées et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. Procédure 2 : Les souris seront traitées avec une molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant au modèle de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. Un mois après, pour laisser le temps aux effets d’avoir lieu, les cellules immunitaires des pattes arrière seront éliminées. Cette procédure se fera sous anesthésie afin de pouvoir toucher uniquement la zone souhaitée (pattes arrière). Par la suite, les animaux seront injectés de nouvelles cellules immunitaires d’une souris d’intérêt pour reconstituer les cellules précédemment éliminées. Enfin 2 mois après la reconstitution nous suivrons le renouvellement des macrophages provenant des cellules immunitaires nouvellement injectées. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces mêmes souris par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort. Procédure 4 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront mises soit sous régime riche en graisses soit sous régime standard (contrôle) et ce pendant 12 semaines. Aux semaines 4 et 8 (deux groupes de souris différents), un test de tolérance au glucose sera réalisé, pour cela, les souris seront mises à jeun 6h puis gavées avec une solution de glucose et la concentration de glucose sera suivie par prélèvement de sang au bout de la queue pendant 2h. Avant la mise à mort, les souris seront mises à jeun sur la nuit pour déterminer la glycémie et le taux d’insuline par prélèvement de sang au bout de la queue.

Impact sur les animaux

- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration d’une molécule permettant à notre modèle de fonctionner par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les animaux subiront une délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière ainsi qu'une injection intraveineuse pour réintroduire des cellules immunitaires au niveau des pattes arrière. Pendant toute la durée de la délétion ainsi que l'injection de cellules immunitaires, les animaux seront maintenus sous anesthésie (environ 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après la délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière, les animaux se retrouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées. - Une petite incision de la queue sera réalisé avant le test de tolérance au glucose et le sang sera prélevé par cette unique incision tout au long du test (nuisances modérées). L’administration de glucose par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les souris seront soumises à un régime riche en graisses pendant 12 semaines engendrant ainsi des maladies métaboliques (nuisances modérées).

Devenir

Tous les animaux reproducteurs seront mis à mort à l’issue de la période d’accouplement. A l'issue de la procédure 1, les animaux avec la modification génétique voulue seront utilisés dans les procédures 2, 3 et 4 et mis à mort afin de prélever les organes. Les animaux avec une modification génétique non voulue pourront être replacés dans un autre projet.

Remplacement

La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, tel que le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment l'absence des macrophages peut affecter la fonction du pancréas à l'état physiologique mais aussi au cours du diabète de type 2 met en jeu de nombreux types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans la fonction des macrophages pancréatiques.

Réduction

De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Une taille de groupe égale à 5 devrait permettre de produire des résultats statistiquement exploitables. La taille du groupe sera élevée à 8 souris dans le cas des transplantations de moelle osseuse, cette expérience entrainant des variabilités plus élevées entre les échantillons. Dans le cadre de cette étude, pour les souris génétiquement modifiées (mutants conditionnels pour le facteur Csf1 et leurs contrôles), les accouplements seront faits pour permettre que tous les animaux générés dans les élevages soient utilisés pour les expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.

Choix des espèces

L'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte à partir de 6 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages pancréatiques à l’âge adulte.

728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Le cerveau de 160 d'entre elles est irradié sous anesthésie à l'âge de 21 jours, 240 passent six tests comportementaux, 80 subissent deux heures d'imagerie par résonance magnétique, et toutes finissent par une chirurgie terminale destinée à prélever leur cerveau. La question posée est de savoir si le vieillissement prématuré des cellules cérébrales explique les séquelles cognitives des enfants irradiés pour une tumeur du cerveau. Le porteur retient la souris parce que sa neuro-anatomie lui paraît comparable à celle de l'être humain, et parce que le caractère social de l'espèce permet de mesurer un déficit d'interactions après irradiation.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.

Procédures

Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.

Remplacement

L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).

Raffinement

Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.