Procédures modérées

Un mini-porc dont l'état de santé atteint un point limite, sans retour possible à l'état basal, est mis à mort avant la fin du protocole. 9 cochons, de jeunes mini-porcs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués à la fin du projet pour des analyses histologiques. Sous anesthésie, ils subissent la pose d'un cathéter, une ouverture du crâne pratiquée avant l'âge de cinq mois et l'implantation d'électrodes d'enregistrement et de stimulation intracérébrale profonde, la chirurgie et l'imagerie pouvant durer jusqu'à six heures. Le porteur cite des hémorragies, un possible gonflement du cerveau, une douleur modérée après l'opération et un risque d'infection des sutures, et garde un défibrillateur en salle "pour éviter la mort précoce de l'animal durant les tests". Éveillés, habitués au préalable à marcher sur un tapis, les mini-porcs sont enregistrés jusqu'à trois heures par jour "avec et sans tremblement" pour tester des électrodes destinées aux troubles du mouvement comme la maladie de Parkinson, sans que le texte dise d'où vient ce tremblement.

Objectifs

La maladie de Parkinson est incurable ainsi que d'autres troubles de mouvement, mais des thérapies comprenant des médicaments, de la chirurgie et de la réadaptation peuvent permettre de réduire les symptômes. En effet, la stimulation intracérébrale profonde est proposée aux patients souffrant de maladies neurologiques avec des troubles du mouvement (maladie de Parkinson, tremblement essentiel et dystonie). Cette étude consiste en l'évaluation de la fonctionnalité et des effets de nouvelles interfaces corticales et sous-corticales (électrodes d'enregistrement et de stimulation intracérébrale profonde (DBS)), afin d’en caractériser les capacités d'enregistrement, de stimulation et les effets sur un modèle porcin (minipig) en situation comportementale avec et sans tremblement. Ce projet offre de nouvelles perspectives telles qu’une meilleure prise en charge des cas de troubles du mouvement.

Bénéfices attendus

Si les résultats sont favorables, ce travail pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des maladies de troubles du mouvement.

Procédures

Les animaux sont soumis à : - Pose de cathéter sous anesthésie légère, durée maximum de 20 minutes ; - Procédure chirurgicale et analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 6h , et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés ; - Les enregistrements de comportement : sur les animaux vigiles, maximum 3 heures par jour;

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue sur la partie des enregistrements : léger stress et inconfort lié à la piqûre et au tremblement. La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible swelling cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - le léger traumatisme local provoqué dans le cerveau par la pose des électrodes ainsi que la douleur modérée en postopératoire ; - infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang) : stress de la contention et de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter ces complications inattendues.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

La réponse à l'objectif posé implique le suivi de la réponse de stimulation du dispositif, donc seules des études chez l’animal vivant le permettent. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme — sain ou malade — compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître.

Réduction

Au total, 9 animaux seront utilisés (un seul animal avant de poursuivre l’étude 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables sur l’évaluation de la fonctionnalité et des effets de nouvelles interfaces corticales et sous-corticales chez les porcs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins).  Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique.  La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportées sur des fiches de suivi adaptées. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal, alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Avant le début d'étude, les animaux seront habitués à la marche sur le tapis. Concernant l'enregistrement du comportement, la procédure sera arrêtée avant que l'animal ne se fatigue. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le porc a été retenu car (1) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (2) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, les porcs ont une taille et un volume de cerveau compatibles avec ceux des primates non humains ; et l'anatomie et le développement neurologique du cerveau du porc sont similaires à ceux du cerveau humain. Le cerveau du porc peut ainsi s'adapter à l'imagerie multimodale et à l'installation chirurgicale de plusieurs électrodes, similaires à celles utilisées pour les humains. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car la craniectomie doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Les souris utilisées sont génétiquement hypercholestérolémiques et développent rapidement des plaques d'athérosclérose dès qu'elles reçoivent un régime gras. Elles sont 2 148, toutes tuées pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pneumonie leur est provoquée par instillation dans la trachée sous anesthésie générale, et le sang est prélevé plusieurs fois par incision de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, entre dix semaines et huit mois d'âge. Le porteur annonce une première étape vers la prévention de l'athérosclérose après une pneumonie, et justifie l'effectif en une phrase, un nombre "réduit au minimum" pour permettre une analyse statistique fiable.

Objectifs

Les pneumonies font partie des maladies infectieuses principales, qu’elles soient acquises dans la communauté (comme la grippe ou la COVID-19) ou au cours d’une hospitalisation. Les maladies cardiovasculaires sont quant à elles l’une des causes les plus fréquentes de mortalité dans le monde. Il a été observé que l’incidence des maladies cardiovasculaires augmente après une infection, mais les mécanismes reliant l’un et l’autre n’ont pas encore été mis en évidence. L’idée principale du projet est d’étudier la relation causale entre la progression des maladies cardiovasculaires et les altérations observées suite à une pneumonie au niveau de la réponse immunitaire et de l’ensemble des microorganismes vivant en communauté complexe au sein du poumon. Ceci permettrait d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués et nous permettrait de contribuer, sur une plus grande échelle, à de nouvelles pistes pour mieux identifier les patients à risque, à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, et globalement à améliorer le rétablissement des patients et diminuer l’impact des infections. Notre objectif pour cette partie est de mettre en place et caractériser un modèle murin de pneumopathie dans un contexte de prédisposition aux maladies cardiovasculaires, ici l’athérosclérose, une maladie fréquente et caractérisée par le dépôt d’une plaque essentiellement composée de lipides (aussi appelée athérome) sur la paroi des artères. À terme, ces plaques peuvent entrainer une lésion de la paroi artérielle (sclérose) et conduire à l’obstruction des vaisseaux ou à leur rupture avec des conséquences souvent graves. Pour cela, nous allons : 1) Étudier la réponse de l’hôte à une pneumonie après le développement de plaques d’athérosclérose et d’une hypercholestérolémie, et caractériser le paysage immunitaire pendant et après la guérison de la pneumonie. 2) Étudier la progression des maladies cardiovasculaires après résolution d’une pneumonie et étudier la composition des cellules immunitaires dans les lésions d'athérome Pour ces deux parties, nous chercherons également à identifier les médiateurs immunitaires affectant la susceptibilité à la progression des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre comment l'athérosclérose influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant de maladies cardiovasculaires et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, le projet mettra en lumière les interactions complexes entre l'athérosclérose et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet constitue la première étape pour prévenir la progression de l'athérosclérose et améliorer les résultats du traitement après la pneumonie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Pour toutes les souris, plusieurs prélèvements de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps, sur animaux vigiles. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes d’IT, SC et prélèvements sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles entraînant quelques nuisances attendues et contrôlées (type perte de poids et poils hérissés) avec une récupération de l’état général des souris à partir de 2 jours après l’infection. Une petite douleur consécutive à l’instillation intratrachéale peut survenir, due à l’insertion de la sonde de gavage. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) et modérée (environ 10%) est observée, sans perte de motricité. Les souris présentent une hypercholestérolémie et développent une athérosclérose lorsqu’elles sont nourries avec un régime hyperlipidique, sans impact négatif sur la vie de l’animal. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés par incision minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles après application d’une crème anesthésiante.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'athérosclérose nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Celui-ci permet notamment d’évaluer l’aspect physique global (perte poids et état de la peau, présence de plaie), le comportement des animaux (prise d’eau et de nourriture ; absence d’activité et perte de mobilité) et la modification des selles et des urines. Un système de score a été établi en fonction des signes cliniques observés, et selon les résultats obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’analgésique pour anesthésier localement la trachée. Une crème anesthésiante est utilisée comme anesthésiant local lors des prélèvements sanguins. Les volumes de sang et les temps de récupération ont été définis selon les recommandations (prélèvement inférieur à 7.5% du volume sanguin total et temps de récupération minimal d’une semaine). Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol et des maladies cardiovasculaires. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 10 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.

Objectifs

La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.

Bénéfices attendus

La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.

Procédures

Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.

Choix des espèces

Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.

110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.

Procédures

Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.

Remplacement

Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).

Réduction

Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).

Deux prises de sang au sinus occipital sont pratiquées sur des poulets éveillés, à deux semaines d'intervalle, pendant leur exposition à une élévation de température en fin d'élevage. 200 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à six semaines pour prélever leur foie et leur muscle. Le porteur décrit chez eux un halètement, un déploiement des ailes pour dissiper la chaleur et une baisse de la prise alimentaire. Ce projet, déclaré au titre du bien-être animal et de la nutrition animale, cherche à savoir si les poulets consomment d'eux-mêmes un aliment antioxydant quand ils en ont "besoin".

Objectifs

Les poulets sont fortement vulnérables à l’élévation de température ambiante en raison de leur capacité limitée à réguler leur température interne et à dissiper la chaleur au regard de leur croissance. Nous proposons dans ce projet exploratoire de tester la capacité des poulets à mettre en œuvre un comportement d’automédication en régulant leur statut redox (indicateur de stress cellulaire pouvant affecter de nombreuses fonctions physiologiques) lors d’une exposition à un stress thermique de chaleur en fin d’élevage, une période pendant laquelle les poulets sont plus vulnérables à l’élévation de la température ambiante. Des aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes seront mis à disposition des animaux pendant toute la période d’élevage. Le comportement alimentaire individuel de poulets vis-à-vis d’aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes sera analysé pendant toute la période d’élevage. Les données permettront de savoir si les poulets consomment les différents aliments de manière aléatoire ou préférentielle au cours de leur vie et notamment au cours du stress thermique. L’hypothèse est que les poulets ne consomment un aliment supplémenté en antioxydant que s’ils en ont besoin pour équilibrer leur statut redox (notamment pendant la période de stress thermique), et que sinon, ils éviteraient de le consommer. Un panel de marqueurs du métabolisme, du statut redox et d’inflammation sera dosé dans le sang des animaux avant la mise en place du stress thermique et deux semaines plus tard correspondant à la fin de l’élevage, ainsi que dans le foie, organe cible du stress oxydant et de sa régulation, et le muscle dont dépend directement la qualité de la viande.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux les comportements et mécanismes d’adaptation à la chaleur des poulets de chair, particulièrement importante dans le cadre du changement climatique auquel sont exposés les animaux. Le projet permettra de déterminer s’il est possible d’atténuer les effets néfastes de la chaleur sur les poulets en leur proposant des aliments contenant des extraits végétaux permettant de revenir à un état physiologique non altéré.

Procédures

Deux prises de sang au sinus occipital seront effectuées sur les mêmes animaux à deux semaines d’intervalle en situation de stress thermique. Elles seront réalisées sur des animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition des animaux à un stress thermique d’élévation de température peut entrainer chez les poulets une réduction de la prise alimentaire et des manifestations de halètement et de déploiement des ailes pour réguler la température corporelle.

Devenir

Suite à la procédure de prise de sang pendant le stress thermique, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus et organes à l’âge de six semaines.

Remplacement

L’étude du comportement d’automédication chez le poulet qui fait l’objet du projet ne peut se réaliser que chez l’animal et directement sur l’espèce cible (Gallus gallus domesticus, poule domestique).

Réduction

L’effectif de 200 animaux (50 animaux par groupe, 4 groupes) a été défini pour permettre de détecter statistiquement un effet de la chaleur et de l’aliment sur la stabilité du statut antioxydant des animaux dans 3 tissus (sang, foie, muscle), sur la base de données d’études précédentes réalisées dans des conditions comparables.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher (Perch'up) ainsi que le dispositif de mangeoires électroniques lui-même avec 8 accès d’aliments possibles. Le suivi des performances est continu pendant toute la durée de l’élevage et permet de disposer de suivi individuel. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les poussins éclos au couvoir commercial seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à l’âge de six semaines.

Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.

Objectifs

L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.

Raffinement

De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.

Le dossier réglementaire exigé avant une première administration chez l'être humain repose sur 182 macaques à longue queue, tous tués pour évaluer la toxicité et la biodistribution du produit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures, jusqu'à quatre heures pour un traitement bilatéral, et parfois deux chirurgies espacées d'un mois. Les prises de sang se font sur animal éveillé sous contention manuelle, le liquide cérébrospinal est ponctionné sous anesthésie, et le recueil des urines et des fèces impose un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce comme effets indésirables possibles une perte d'équilibre, un défaut de clignement des paupières et une paralysie faciale transitoire, et présente la réalisation de ce projet chez le primate comme "indispensable".

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le primate afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier les surdités génétiques/héréditaires tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un implant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 et 2 heures (traitement unilatéral) et jusqu’à 4 heures (traitement bilatéral). Chaque animal est soumis à une chirurgie généralement. Potentiellement, un animal peut être soumis à deux chirurgies espacées d’au moins 1 mois pour réaliser des injections bilatérales non simultanées. Examens cliniques : les animaux sont suivis quotidiennement mais des examens spécifiques peuvent être conduits pour suivre les paramètres cardiovasculaires, la pression artérielle par exemple. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces examens sont réalisés entre 2 et 4 fois selon la durée de l’étude. Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes). Liquide de l’oreille, liquide cérébrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie sous anesthésie générale et à la nécropsie après euthanasie). Larmes, salive, température corporelle : ces prélèvements non invasifs sont réalisés chez les animaux avec une contrainte manuelle légère pour que l’animal ne bouge pas le temps du prélèvement (durée : quelques secondes et moins d’1 minute). Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces prélèvements sont généralement réalisés une fois dans les semaines précédant le traitement, deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines après traitement, puis en milieu et en fin d’étude. Les urines et les fèces sont collectés quand l’animal est hébergé dans une cage dédiée pour le recueil de ces fluides. L’hébergement individuel ne peut dépasser 24 heures. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Chaque animal est soumis à 4 collectes généralement, réalisées une fois dans les semaines précédant le traitement, une fois dans les 2 premières semaines après traitement en milieu d’étude et en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère, ponctuelle et transitoire de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre, un défaut de clignement des paupières et/ou une paralysie faciale transitoire(s). Des effets indésirables liés aux prélèvements et/ou aux examens cliniques sont liés à la contention légère des animaux qui peut induire un léger inconfort ou stress aux animaux, qui restent transitoire. Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le primate afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum requis pour permettre une analyse statistique, conformément aux recommandations des lignes directrices. L’estimation du nombre d’animaux a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et d’une éventuelle variation de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire, de réveil et les jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement notamment l’activité et la mobilité des animaux, les interactions sociales, l’apparence physique, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. Toute anomalie est signalée au vétérinaire pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se font sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a des signes d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de Macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 à 2 000 mm3, se nécrose, ou qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 2 707 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes, sang et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la veine des cellules leucémiques prélevées sur des patients ou une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis deux prises de sang par semaine à la veine jugulaire sous anesthésie, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur écrit que la diminution de la tumeur chez la souris "présage" sa diminution chez l'humain lors des futurs essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les leucémies aigües myeloïdes. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Les LT sont normalement capables d'éliminer les cellules tumorales et les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont capables d'aider la tumeur à grossir. Nous cherchons donc à activer les LT et désactiver les TAM au sein de la tumeur grâce à de nouvelles molécules plus efficaces et surtout plus spécifiques que celles déjà existantes. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les LAM.

Bénéfices attendus

L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral, d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement. A terme, la validation de certains médicaments conduiront à des essais cliniques chez l'homme. Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge de l'évolution de la tumeur, donc une diminution de la tumeur sous l'effet des molécules thérapeutiques utilisées dans ce projet. La diminution de la tumeur chez la souris présage donc une diminution de la tumeur chez l'humain lorsque que ces mêmes molécules seront testées en essais cliniques.

Procédures

Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. La prise de la maladie sera suivie par 2 prélèvements sanguins par semaine à la veine jugulaire pour minimiser l'impact sur les animaux quiauront été anesthésiés au préalable. La mise en place du modèle de cancer de poumon sera faite par injection en sous-cutané dans le flan des animaux des cellules tumorales. Afin de suivre les cellules greffées nous injecterons une molécule fluorescente spécifique des cellules ciblées par voie intraveineuse dans la queue de l'anima, l'animal sera ensuite anesthésié et observé en imagerie non invasine. Afin d'éliminer de manière totale les cellules tumorales, des molécules de thérapie ciblée seront injectées par voie intraveineuse (veine caudale) ou en intrapéritonéal.Les animaux seront surveillé pour leur bien-être, la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Les animaux ne subiront pas de chirurgie. La durée de chaque intervention (acte expérimental) est d'environ 3 minutes pour chaque souris.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante, à une légère perte de poids. Les animaux peuvent être stressés par le prélèvement sanguin au niveau de la veine jugulaire. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveineux peut engendrer un léger stress (poils légèrement hérissés).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.

Remplacement

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le recours à l'expérimentation animale pour nos projets est essentiel car elle nous permet de prendre en compte le microenvironement tumoral de la tumeur qui intervient d'une manière très importante dans les mécanimes que nous étudions et notamment ceux reliés à l'immunothérapie qui est basée sur le système imunitaire dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux sera de 6 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Le nombre de 6 animaux à été déterminé afin d'avoir des tests statistiques fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, les doses de molécules thérapeutiques à utiliser seront préalablement définies grâce a des expériences in vitro notamment avec des modèles 3D (sphéroides) que nous avons mis en place au laboratoire.

Raffinement

Les manipulations des animaux sont effectuées en environnement stérile. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Pour l'analyse des animaux à l'IVIS (In Vivo Imaging System), les animaux seront anesthésiés. Les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié par élongation cervicale. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd plus de 15% de poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1500-2000 mm3) ou si la tumeur est nécrosée (score 2: >-50%), l’animal sera euthanasié . Les personnes en charge du projet ont été formés aux gestes qu'ils vont mettre en oeuvre.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.