Procédures modérées

1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux chirurgies de trente minutes à une semaine d'intervalle créent un anévrisme intracrânien, suivies de quatre mois d'eau salée pour provoquer une hypertension, avec mesures de pression artérielle et injections répétées de tamoxifène pour inactiver un gène dans les cellules endothéliales. Le porteur signale un risque d'infection des sutures, un risque de nécrose intestinale après remise en place de l'intestin, une irritation aux points d'injection et une perte de poids de deux à trois jours après chaque opération. Les 36 000 hémorragies intracrâniennes annuelles citées pour l'Union européenne justifient un projet dont le résultat attendu est d'identifier le rôle d'une seule protéine, le porteur écrivant qu'aucune approche alternative n'apporte le degré d'information voulu.

Objectifs

Les cellules endothéliales qui tapissent les artères sont en contact direct avec le sang qui exerce des forces de frottement sur ces cellules. Une mauvaise perception ou une mauvaise réponse des cellules endothéliales à ces forces contribue à la survenue de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’anévrisme intracrânien (AIC). L’AIC est une anomalie vasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. La complication dévastatrice de l'AIC est sa rupture et surtout l'hémorragie intracrânienne qui en résulte, mortelle dans 30% des cas, ou laissant des séquelles neurologiques majeures. L’anévrisme se forme spécifiquement là où les forces de frottement générées par le flux sont particulièrement perturbées. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces (faibles ou élevées) permettra l’identification de nouvelles cibles pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce à un travail réalisé in vitro, nous avons pu identifier une protéine , ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions des cellules endothéliales. Nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Un premier modèle (haut flux/bas Flux_HF/BF) nous permettra de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans les cellules endothéliales en conditions pathologiques (forces de frottement perturbées). Le second modèle chirurgical d’anévrisme intracrânien nous permettra alors de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans la formation des anévrismes intracrâniens. Les résultats obtenus conjointement pour ces deux modèles permettront à terme de découvrir des cibles pharmacologiques potentielles pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie intracrânienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle de notre protéine dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.

Procédures

Modèle de variations de flux (HF/BF) : Réalisation du modèle sous anesthésie générale à l'âge de 8 semaines. Durée de l'intervention: 30 minutes maximum Modèle d'anévrisme intracrânien réalisé à l'âge de 8 semaines: 2 chirurgies de 30 minutes chacune sont faites à 1 semaine d'intervalle, suivi d’un traitement au sel (0.9%) dans l’eau de boisson pendant 4 mois pour induire une hypertension modérée. La pression artérielle systolique est mesurée avant la chirurgie, puis 1.5 mois après la chirurgie puis avant le sacrifice de l'animal. Chaque série de mesures dure en moyenne 20 minutes. Enfin, pour invalider spécifiquement nos souris dans les cellules endothéliales, des injections sont réalisées soit à la naissance (P1/P2/P3), soit à l'âge adulte (1f/j/5j sur 2 semaines). L'injection ne prend qu'une minute par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Les animaux récupèrent très bien des chirurgies, grâce à la mise en place d’un protocole péri-opératoire adapté. Certains points de vigilance restent à surveiller : -les injections intrapéritonéales répétées chez l'adulte de tamoxifène (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. Pour palier à ce risque, nous réaliserons les injections côté droit de la souris, en évitant de réaliser les injections aux mêmes endroits (carré d’injection). -modèle HF/BF : risque d’infection au niveau des zones de suture, les souris pouvant elle-même essayer de retirer leur fils. Un risque de nécrose des intestins est également possible si ce dernier subit des torsions quand il est remis dans la cavité abdominale. Il est à noter que, dans nos mains, ce risque n’est jamais survenu. -modèle AIC : La présence d’un anévrisme intracrânien est, la plupart du temps, asymptomatique, ce qui en rend difficile sa détection, de surcroît chez la souris. La rupture d’un anévrisme, quant à elle, est imprévisible et brutale, suivie dans 50% des cas par un coma voire une mort subite. Les symptômes de la rupture sont consécutifs à l’hémorragie intracrânienne qu’elle occasionne. Leur intensité dépend de l’ampleur et de la localisation de l’hémorragie. Notre modèle d’AIC n’est pas un modèle de rupture. Par conséquent, nous n’avons jamais constaté de nuisances ou de souffrance en lien avec la survenue d’une hémorragie intracrânienne. Une perte de poids est observée dans les 2 jours suivant les chirurgies mais grâce à l’ajout de nourriture hydratée dans la cage, les souris peuvent se nourrir facilement. Le retour au poids initial se fait en 2 à 3jours. Comme pour le premier modèle, une infection aux zones de suture pourrait survenir. C’est pourquoi, les souris sont surveillées 2 à 3 fois/jour/3jours en post-opératoire.

Devenir

Modèle de variations de flux: Animaux mis à mort après 4 ou 14 jours en fonction des lots pour analyser le remodelage et la réactivité vasculaire des artères. Modèle anévrisme: Animaux mis à mort après 4 mois de traitement pour étudier la structure et la morphologie du réseau artériel cérébral.

Remplacement

Dans ce projet, le recours au modèle animal nous permettra de comprendre le rôle de notre protéine d’intérêt dans un système intégré, le système vasculaire, dépendant de nombreux facteurs extérieurs, non reproductible in vitro. Malheureusement, il n’existe pas d’approche expérimentale alternative apportant le degré et la qualité d’informations scientifiques nécessaires pour répondre à cette question. Toute approche in vitro nous permettant d’orienter notre travail et de réduire le nombre d’expériences menées in vivo sera réalisé en amont du travail sur l’animal (remplacement).

Réduction

Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure, nous nous sommes basés sur notre expérience et sur nos résultats antérieurs, en tenant compte de la variabilité expérimentale. L’effet de la mutation entre les deux groupes sera étudié en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, nous prévoyons d’analyser également l’effet sexe sur les différents paramètres étudiés. Nous réaliserons donc des groupes mixtes. Si nous n’observons pas de différence significative entre les 2 sexes sur les paramètres étudiés, alors les effectifs seront réduits de moitié par rapport à nos prévisions. De même, nous prévoyons de réaliser différentes expérimentations sur des animaux invalidés à la naissance mais aussi à l’âge adulte. Nous commencerons par les groupes invalidés à la naissance. En fonction des résultats obtenus, l’analyse des groupes invalidés à l’âge adulte ne sera peut-être pas nécessaire, réduisant également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront groupées de 3 à 5 par cage avec des petits morceaux de papiers leur permettant de faire un nid. Les animaux seront observés quotidiennement, week-end compris, pour détecter tout signe précoce de douleur, à minima par les animaliers mais également par le personnel en charge de nos animaux. Une surveillance accrue est réalisée en période péri-opératoire, les animaux étant alors observés 2 à 3f/jour. Une grille de score et de points limites sera mise en place et permettra de déterminer le palier de douleur (4 paliers : 0 pour une absence de douleur, et 3 pour une douleur sévère).Toute évolution anormale (perte de poids supérieure à 15%, prostration de l’animal, changement de comportement, isolement, blessure…) pourra ainsi être détectée. Le traitement analgésique sera alors mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Si la douleur ne peut être traitée, l’animal sera alors mis à mort

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire Notre modèle animal est un modèle permettant une délétion, dans le temps et dans l’espace, de notre protéine spécifiquement dans les cellules endothéliales à 2 stades : 1) en post-natal (3 jours après la naissance) ou à l’âge adulte (8 semaines). Toutes nos chirurgies sont ensuite réalisées à l’âge adulte, le réseau vasculaire étant mature. Le modèle d’anévrisme intracrânien est un modèle assez long car il comprend un traitement hypertenseur de 4 mois. Les animaux sont donc utilisés à l’âge adulte, autour de 8 semaines.

1 018 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à dix injections de composés, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. L'abdomen est irradié sous anesthésie gazeuse pendant un quart d'heure, ce qui provoque selon le porteur une toxicité et une perte de poids modérée dans les jours suivants, les tumeurs entraînant une gêne et un inconfort qualifiés de modérés. Le projet vise d'abord à installer chez la souris un modèle de chute des lymphocytes après radiothérapie, l'espoir d'un traitement pour les patients étant placé "à plus long terme" et suspendu à d'éventuels essais cliniques.

Objectifs

La radiothérapie fait partie du traitement de près de 60% des patients atteints de cancer, que ce soit dans le cadre d’un traitement ou à des fins palliatives. Un des mécanismes d’action de la radiothérapie est l’induction de dommages létaux au niveau de l’ADN des cellules, et notamment des cellules tumorales. La radiothérapie est délivrée principalement par des accélérateurs externes et les rayons, pour atteindre la tumeur, traversent également des tissus sains et touchent des vaisseaux sanguins. Les lymphocytes sont des cellules très radiosensibles. Un des effets secondaires majeurs de la radiothérapie réside dans la survenue d’une lymphopénie. Il s’agit d’une baisse drastique du taux de lymphocytes après le début du traitement par radiothérapie. La lymphopénie radio-induite (RIL) est un phénomène transitoire qui dure généralement jusqu’entre 3 et 9 mois après la fin du traitement par radiothérapie. Elle peut persister parfois pendant des années après le traitement. La sévérité comme la durée de la lymphopénie radio-induite ont été corrélées à une plus mauvaise survie globale chez les patients traités par radiothérapie. Ce phénomène est encore mal compris. Nous savons aujourd’hui que les lymphocytes sont des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale et cette chute du taux de lymphocytes pourrait concourir à une mauvaise réponse anti-tumorale. Notre projet vise à établir un modèle de lymphopénie radio-induite chez la souris pour avoir un modèle sur lequel tester de nouveaux composés pouvant éventuellement réduire ou abroger cette lymphopénie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. La lymphopénie radio-induite est un effet secondaire majeur de la radiothérapie. Il est actuellement reconnu que les lymphocytes sont essentiels dans la réponse anti-tumorale. De plus, il a été montré que les patients qui subissent cet effet secondaire ont une plus faible chance de survie. Réduire la durée ou la sévérité de la lymphopénie pourrait éventuellement permettre d’améliorer l’efficacité antitumorale du traitement par radiothérapie et d’augmenter les chances de survie des patients traités par radiothérapie. La mise en place d’un modèle préclinique de lymphopénie radio-induite permettra d’obtenir des connaissances sur ce phénomène encore assez peu exploré et permettra de tester si certains composés peuvent réduire ou atténuer cette lymphopénie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender le phénomène de lymphopénie radio-induite mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de nouvelles combinaisons thérapeutiques lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Une injection de cellules tumorales en sous-cutané sera réalisée chez tous les animaux, durée 10 secondes, sous anesthésie locale. L’injection des composés se fera par injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineux (une à 10 injections selon les composés), durée 10 secondes, sous anesthésie locale. Les souris seront anesthésiées pendant l’irradiation (maximum 15 minutes), une fois. Les prélèvements de sang sur les souris seront réalisés sous anesthésie générale, n=3, durée 3 minutes..

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de l’abdomen. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse (maximum 15 minutes). Cela peut générer du stress et de l’anxiété. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore. Elle peut induire de la toxicité qui va se traduire par une perte de poids modérée dans les jours suivants l’irradiation.L’administration des composés par voie intrapéritonéale ou sous-cutané ou intravein eux peut engendrer de la douleur et un stress léger et transitoire (mais les injections seront faites sous anesthésie locale). L’administration des composés per os peut engendrer du stress léger et de courte durée. Les tumeurs peuvent entraîner une gêne et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales aux fins d'analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il a clairement été mis en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternative permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité. De même, il n'existe pas de sytème permettant de reproduire les interactions entre les éléments du sang, les cytokines, la tumeur et le sytème immunitaire dans sa globalité. La phénomène de la lymphopénie n'a pour l'instant pas pû être modélisé in vitro ou in silico.is

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives au niveau du taux de lymphocytes dans le sang au cours du temps. L’analyse des différences de taux de lymphocytes se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections un anesthésique local sera appliqué sur la peau avant chaque injection. L’irradiation sera réalisée sous anesthésie générale pour réduire le stress induit. Les prélèvements de sang seront réalisés par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis longtemps au sein du laboratoire pour réduire le temps et le stress induit, sous anesthésie locale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

Greffées de deux tumeurs, injectées trois fois d'un immunomodulateur puis irradiées un quart d'heure sous contention, vigiles, 1 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le sang et les tumeurs. Le projet cherche à savoir si cet immunomodulateur amplifie l'effet dit abscopal de la radiothérapie sur des métastases situées hors du champ d'irradiation, la retombée pour les patients étant renvoyée au long terme et à d'éventuels essais cliniques. Le porteur reconnaît que la tumeur, en grossissant ou en se nécrosant, peut faire souffrir la souris et gêner ses déplacements, et annonce des points limites "précoces" appliqués strictement, sans dire lesquels.

Objectifs

Notre projet consiste à évaluer l’impact de l’addition d’un immunomodulateur à un traitement par radiothérapie dans le cas de cancers multi-site. Cette voie de recherche est intéressante à explorer. En effet, elle peut contribuer à améliorer de façon significative l’efficacité des radiations ionisantes, sachant qu’aujourd’hui un traitement de radiothérapie est indiqué chez plus de la moitié des patients atteints d’un cancer. De plus, il a été montré que l’irradiation d’une tumeur pouvait engendrer des effets sur des métastases situées hors du champ d’irradiation. Cet effet, nommé « effet abscopal » provient du système immunitaire et serait très intéressant à amplifier grâce à des combinaisons thérapeutiques. Par ailleurs, des combinaisons thérapeutiques combinant irradiation et d’autres immunomodulateurs ont déjà montrées des effets en clinique soulignant le potentiel et l’intérêt de telles combinaison. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire de l’hôte. Suite à l’irradiation, la réponse interféron-gamma puis la sécrétion de cytokines et de médiateurs vont favoriser l’infiltration de cellules immunitaires pro tumorale ou anti tumorales par vagues successives. Certaines réactions vont promouvoir l’effet antitumoral, tandis que d’autres, comme l’infiltration intratumorale radio-induite des lymphocytes T régulateurs vont freiner l’efficacité de la radiothérapie. Ces cellules ont normalement pour rôle de réprimer les réponses immunitaires anormales ou excessives envers des antigènes du soi ou du non-soi pour maintenir l’homéostasie immunitaire. Dans les cancers, elles sont impliquées dans le développement et la progression tumorale car elles inhibent l’immunité antitumorale. Le but de notre projet est de combiner une molécule permettant d’éliminer ces cellules avec la radiothérapie et de voir si cela peut améliorer l’efficacité de la radiothérapie et/ou l’effet abscopal induit par l’irradiation. Il a également été montré que cette nouvelle molécule augmentait l’efficacité de certains traitements dans des modèles résistants . Nous testerons donc dans un second temps le triple traitement avec radiothérapie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de miniiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostique de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet abscopal induit par l’irradiation qui est médié par le système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Deux injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, une fois, durée 1 minute, sous anesthésie locale. L’injection des médicaments durera 10 secondes, sous anesthésie locale (3 administrations au total pour chaque immunomodulateur, une injection tous les 4 jours). Les souris vigiles seront mises dans un système de contention pendant l’irradiation (maximum 15 minutes, une irradiation). Le prélèvement de sang sur les souris dédiées sera réalisé sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété, légers et transitoires. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée, elle induit pas une perte de poids modérée et transitoire. L’administration des immonumodulateurs par voie intrapéritonéale peut engendrer de la douleur (un spray contenant de la lidocaïne sera appliquée avant chaque injection intrapéritonéale). La tumeur quand elle grossit ou quand elle commence à nécroser peut gêner la souris (douleur, difficulté à se déplacer,…). Les souris seront sacrifiées aux points limites pour éviter cela. Pour les prélèvements, les souris seront d’abord anesthésiées pour prélever le sang ce qui peut générer du stress mais ces souris seront sacrifiées juste après le prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Il a clairement été mise en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternatives permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité.

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour détecter des différences significatives de croissance tumorale . L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité du traitement triple combinaison radothérapie avec des immunomodulateurs par rapport aux doubles combinaisons.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections en sous-cutanée et en intrapéritonéale, un anesthésique local sur la peau avant chaque injection. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pesée tous les jours pendant une semaine, puis placée vigile dans une boîte d'exposition pour un traitement unique par aérosol de 30 à 45 minutes. Aucune n'est infectée, le projet mesurant seulement la tolérance et l'élimination de nouveaux antibiotiques activables par la lumière, l'efficacité étant renvoyée à une autre demande d'autorisation. Le porteur écrit que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du poumon et conclut que l'expérimentation animale reste une étape "incontournable et irremplaçable", tout en annonçant qu'une espèce plus proche de l'humain, le cochon, pourra être utilisée ensuite.

Objectifs

Ce projet vise à répondre à la pénurie d’antibiotiques restants actifs contre les bactéries pathogènes pour l’homme, en particulier celles responsables d’infections respiratoires. Il s’inscrit dans le cadre de l’appel lancé par l’organisation mondiale de la santé (OMS) pour le développement de nouveaux traitements ciblant une liste de bactéries pathogènes multirésistantes. Pour ce faire, de nouveaux antibiotiques activables par la lumière ont été mis au point et leur intérêt démontré en condition in vitro. Cependant, ces études ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, des tests sur animaux doivent maintenant être effectués. La nébulisation permet de cibler directement les voies respiratoires et d’y atteindre une concentration élevée tout en réduisant la dose à administrer et ainsi les risques d’intolérance et/ou d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est de déterminer si les nouveaux antibiotiques administrés sous forme d’aérosol chez des animaux non infectés sont bien tolérés et de quelle manière ils sont éliminés. Si une bonne tolérance est mise en évidence, l’efficacité pourra ensuite être évaluée (dans le cadre d’une autre demande d’autorisation de procédure) pour le traitement d’infections respiratoires par des bactéries résistantes aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Les composés mis au point pourraient avantageusement compléter les antibiotiques actuellement disponibles, lesquels tendent à perdre en efficacité du fait du développement de résistances chez les bactéries. Le mécanisme d’action des nouveaux composés développés est différent de celui des antibiotiques dits classiques. Il repose notamment sur une activation par la lumière causant de nombreux dommages aux bactéries, limitant ainsi leur possibilité d’adaptation et d’échappement au traitement. Au-delà de ce projet, la stratégie envisagée pourrait être adaptée pour traiter divers pathogènes responsables d’infections graves dans différents tissus et organes, en particulier chez les patients atteints de pneumonie, les grands brûlés, ou les personnes hospitalisées contractant une infection au cours de leur séjour dans un établissement de soins. Ce projet a donc le potentiel d’importantes répercussions économiques et sociales, au profit des patients, de leurs proches et plus généralement de la société dans son ensemble.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à un traitement unique par aérosol dont la durée peut varier entre 30 et 45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus seront : - Lors des pesées : les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour procéder à la pesée laquelle sera effectuée tous les jours pendant 7 jours avant le traitement. Ce stress sera d’environ 30 secondes à chaque fois, son intensité étant estimée légère. - Lors du traitement par aérosol : les souris pourront éprouver un stress lors de l’étape d’aérosolisation dont la durée sera d’environ 30 minutes. Le traitement par aérosol est de gravité prospective modérée.

Devenir

Tous les animaux seront sédatés avant d’être mis à mort à différents temps afin de pouvoir procéder aux prélèvements post-mortem.

Remplacement

De nombreuses études préliminaires ont été menées au laboratoire (en condition dites in vitro) afin de s’assurer, autant que possible, que les composés pourront fonctionner en exerçant les effets souhaités chez la souris. Cependant, les études in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, l’expérimentation animale (en ayant recours à un modèle pertinent reproduisant la pneumonie survenant chez l’homme) demeure une étape incontournable et irremplaçable.

Réduction

Les études in vitro menées au préalable ont permis de sélectionner des candidats et d’optimiser leur formulation, réduisant ainsi fortement le nombre d’évaluations à conduire chez l’animal. En effet, partant d’une collection de près de 50 composés, 4 composés ont été sélectionnés à ce stade pour être évalués in vivo. En outre, le nombre d'animaux est fixé au minimum en veillant à ne pas mettre en péril l'obtention de résultats exploitables ni compromettre les objectifs et chance de succès du présent projet.

Raffinement

La procédure sera enrichie par une phase d'habituation réalisée avant la nébulisation. Pour cela, une semaine avant le traitement par aérosol, les souris seront chaque jour transférées dans la boite d’exposition pendant 10 à 15 minutes, le temps d’être pesées avant d’être remises dans leur cage d’hébergement. Ceci permettra d’établir leur courbe de croissance avant traitement tout en habituant les animaux à la boite d’exposition. Un renforcement positif (par récompense de nourriture (beurre de cacahuète)) sera effectué après chaque pesée dans le but de réduire le stress pour les animaux. Des points limites ont été définis afin d'observer d’éventuelles nuisances et mettre en place un traitement analgésique approprié.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent en première approche pour cette étude. Des animaux âgés de 8 à 10 semaines (poids 20-25 g) seront utilisés, comme dans d'autres études sur la pneumonie aigue. Les affections respiratoires humaines peuvent affecter des sujets jeunes comme plus âgés. Les effets du vieillissement sur le système respiratoire entraînent une diminution progressive des performances fonctionnelles, notamment une baisse du débit expiratoire de pointe, de l’échange de dioxyde de carbone et d’oxygène, ainsi que de la capacité vitale. Cependant, les jeunes peuvent également être touchés par des infections respiratoires telles que la pneumonie. La pneumonie est l’une des premières causes de mortalité infantile dans le monde. Il est donc essentiel de prendre des mesures pour toutes les tranches d’âge. Par la suite, selon les résultats obtenus avec cette DAP, il pourra être envisagé des expérimentations sur une espèce animale plus proche de l’humain du point de vue de son système respiratoire, en particulier le cochon.

Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.

Objectifs

Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant passer jusqu'à 96 heures seule en cage à métabolisme. Après une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc ou de l'omoplate, elles reçoivent des molécules radiomarquées, avant deux prélèvements de sang derrière l'œil et une saignée terminale par ponction cardiaque. Le porteur décrit un projet répétitif, mené selon un même schéma pour les entreprises clientes, dont il retient les composés qui passeront ensuite en études d'efficacité. Le nombre d'animaux par groupe est fixé par le client, à quatre souris aux tumeurs jugées homogènes et exploitables, ce qui laisse sans explication l'effectif total de 7 200.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapeutiques innovantes et évaluer leur efficacité. Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit dans un but diagnostic ou thérapeutique. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour objectif l’étude pharmacologique d'une sélection de candidats médicaments. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée, le modèle tumoral sous cutanée utilisé, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de la greffe des tumeurs sous cutanées puis par l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et les fluides biologiques d’intérêt. Les candidats médicaments ont été testés au préalable chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (tissus cibles, notamment tumeurs et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 15 s) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (2 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; hébergement individuel en cage à métabolisme (maximum 1 fois pendant 96 heures maximum)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intra péritonéale, intramusculaire ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; stress modéré lors du placement en cage à métabolisme.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur en cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Les canddats médicaments de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité préliminaires in vitro et/ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe est déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenus avec le modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs). Ce nombre est réduit au minimum afin d’avoir 4 animaux par groupe dont les tumeurs seront homogènes et exploitables. En effet, la méthode de quantification par mesure radioactive est très précise et répétable. Néanmoins, dans certains cas et lorsque c’est possible, ce nombre pourra être diminué.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Deux chirurgies d'implantation de pastilles à diffusion lente, six prises de sang à la queue et trois épreuves de gavage au glucose suivies d'insuline : 48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées à la fin, pour prélever les organes destinés aux analyses lipidiques, protéiques et d'expression génique. L'objectif déclaré est de savoir si bloquer une protéine du stress cellulaire, le translocon, limite le diabète et le foie gras associés à l'obésité. Le porteur retient la souris comme modèle intégré, seul moyen selon lui d'observer les communications entre organes, et fait débuter le régime gras à huit semaines d'âge pour écarter les effets du développement.

Objectifs

Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être jouer un rôle dans le stress cellulaire, le tranlocon, dans la dysfonction du tissu adipeux, un évènement se déroulant au cours de l’obésité et qui est central dans l’apparition des complications de l’obésité (diabète, maladies cardiovasculaires, foie gras). A l’aide de souries rendues obèses avec un régime gras et qui présentent une dysfonction adipocytaire, nous allons déterminer si l’inhibition du translocon avec un inhibiteur pharmacologique améliore la bonne santé du tissu adipeux et limite les complications de l’obésité (diabète et foie gras). Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant aux complications métaboliques de l’obésité et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.

Bénéfices attendus

Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux complications métaboliques de l’obésité, la dysfonction adipocytaire qui est un mécanisme physiopathologique clé du développement de ces complications a été largement étudiée dans une multitude de contextes. Cependant, les mécanismes initiateurs de la dysfonction adipocytaires demeurent encore mal connus. Le rôle du translocon dans cette dysfonction n’a, a notre connaissance, jamais été étudiée à ce jour. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus dans des modèles cellulaires montrent que le translocon induit l’augmentation de marqueurs de la dysfonction adipocytaire. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité du translocon pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer les complications métaboliques chez les patients obèses.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subissent deux procédures chirurgicales pour implanter et renouveler au bout de trois mois des pastilles permettant de délivrer l’inhibiteur pharmacologique ou le placébo. Tous les mois, à six reprises au cours de cette période, du sang sera prélevé en vigil au niveau de l’extrémité de la queue. Tous les deux mois, à trois reprises au cours de cette période et a une semaine d'intervalle, du glucose sera administré par gavage et de l'insuline en intrapéritonéale, puis du sang sera prélevé au niveau de l’extrémité de la queue, le tout sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : sédentarité due au régime obésogène, potentielle sensibilité au niveau des point de délivrance (injection intrapéritonéale, gavage oral) ou de prélèvements (sang à la veine caudale) (qui devrait être très limité au regard de la fréquence espacée dans le temps).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.

Remplacement

Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture. Ce modèle cellulaire permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle du translocon dans la dysfonction adipocytaire. L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 48 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de la mise en place de la dysfonction adipocytaire chez les souris nourries avec un régime gras et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal, la définition de points limites adaptés (signes cliniques notables ou spécifiques) couplé à un examen clinique quotidien des animaux par du personnel formé permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées en prêtant une attention particulière à la délivrance de l’inhibiteur pharmacologique (utilisation de pastilles à diffusion lente pour éviter toute injection quotidienne) et à la délivrance d’anesthétiques et d’antalgiques. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un tube tunnel en polycarbonate ) et les animaux sont hébergés en groupes sociaux.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (obésité, diabète de type 2 et hépatopathie dysmétabolique pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence systémiques d’une dysfonction adipocytaire à l’origine des complications de type diabétique et hépatique en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition du translocon. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur et du régime à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition au cours du développement de l’organisme.

Les souris qui perdent 15 % de leur poids ou présentent des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 sont mises à mort sans délai, l'infection pouvant les tuer en huit jours. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, de leur cerveau et de leur tête. Chacune reçoit une puce sous la peau du dos, subit huit prises de sang à raison d'une par semaine, trois ou quatre vaccinations par le nez sous anesthésie générale et une inoculation du virus par la même voie. Toute médication susceptible d'interférer avec la réponse immunitaire est exclue. Les résultats doivent alimenter une publication et une éventuelle demande d'essai clinique pour le candidat vaccin LVT-001, contre les symptômes du covid long.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sous anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 3 et 4 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.