Procédures modérées
Utilisation de modèles transgéniques murins pour l’étude de la lymphomagenèse
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet ont été construites pour surexprimer la protéine humaine BCL2 et porter une seconde altération génétique, de façon à développer un lymphome folliculaire. Elles sont 1 284, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 40 un niveau modéré. Elles reçoivent trois gavages, des injections dans l'abdomen et des prises de sang à fréquence mensuelle, une partie subissant en plus une irradiation du corps entier de trente minutes suivie d'une greffe de cellules. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des stades de la lymphomagenèse.
Objectifs
Le lymphome folliculaire (LF) est un cancer des cellules immunitaires se développant au sein des ganglions. Cette pathologie, malgré des avancées thérapeutiques notables, reste à l’heure actuelle incurable et sa fréquence est en constante augmentation dans les pays industrialisés. Les cellules tumorales de LF se caractérisent par l'accumulation d'altérations génétiques. La première altération conduit à la surexpression de la protéine de survie BCL2, puis d'autres altérations additionnelles sont fréquemment observées. Ainsi les modèles murins que nous avons développés pour mimer le LF surexpriment la protéine BCL2 humaine et possèdent une altération fréquemment décrite chez les patients. Ces multiples anomalies présentes dans le LF favorisent la croissance tumorale et la résistance au traitement en agissant directement sur la survie ou la prolifération des cellules tumorales mais aussi en favorisant le dialogue des cellules tumorales avec les cellules qui l’entourent, les cellules du microenvironnement. Nos modèles murins permettent ainsi d'analyser le développement tumoral en étudiant la fonctionnalité des cellules tumorales et en caractérisant la composition du microenvironnement tumoral.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la lymphomagenèse.
Procédures
1)- La majorité des animaux aura une administration par voie orale d'une molécule chimique à 3 reprises pour l'induction des altérations d'intérêt, ce geste prend quelques secondes. En parallèle, ces souris recevront à une fréquence mensuelle une administration intrapéritonéale pour stimuler leur système immunitaire, cette administration prendra moins de 30 secondes. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum mensuelle et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration intrapéritonéale prenant moins de 30 secondes. 2)- Une petite partie du projet sur des souris non transgéniques implique cette fois-ci une irradiation de 30 minutes des souris sous oxygène (évite le stress), puis une injection intraveineuse de cellules, réalisée en moins d'une minute, pour reconstituer les souris.
Impact sur les animaux
L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques portant la double altération et conservés plus de 6 mois, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Concernant les souris ayant reçues une irradiation corps entier, une perte de poids en lien avec des diarrhées induites par l'irradiation peut être attendue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement du cancer que nous étudions (lymphome folliculaire) ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) alors que celui-ci est justement essentiel au développement de ce type de cancer. Même si nous travaillons en parallèle à développer des modèles 3D plus complexes et de plus en plus fidèles à la réalité afin d'avoir recours au minimum à l'expérimentation d'animaux, l'utilisation de modèles animaux est indispensable pour certaines étapes de nos recherches sur la lymphomagenèse.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. Les croisements principaux des souris pour l'élevage ont été conçus de manière à obtenir uniquement des souris qui pourront être expérimentées sans produire des souris de mauvais génotype à euthanasier. Lorsque des expérimentations différentes sont nécessaires pour l'analyse des différents types cellulaires, les organes non utilisés sur chaque souris expérimentée seront congelés pour des analyses complémentaires afin d'éviter d'avoir d'autres souris à expérimenter pour générer ces échantillons. Notre expérience précédente nous a permis de dimensionner les groupes de souris pour l'étude des stades tardifs par la connaissance du taux de développement tumoral. Enfin, lorsque cela était pertinent, un calcul d'effectif a été réalisé afin de définir la taille des groupes d'animaux permettant d'observer l'éventuel effet des mutations étudiées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, un environnement contrôlé (température, humidité, pression), avec alternance jour/nuit (12h/12h), accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum, change des cages 1 fois/semaine, et hébergement en groupe avec respect de la densité recommandée. Ils bénéficient également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin qu’elles puissent se construire un «nid». Afin de limiter le stress lié aux gavages et injections, une acclimatation à la manipulation sera réalisée (manipulation préalable sans administration dans la salle d’expérimentation) par les expérimentateurs. Pour l'irradiation des animaux, ils seront placés dans une boite de confinement afin de maintenir une asepsie maximum, et de l'oxygène sera administré dans cette boite en continu à l'aide de filtre pour éviter l'apparition de stress ou de l'inconfort aux souris. Egalement, dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris possède un système immunitaire proche du système humain. Les mécanismes de diversification du répertoire et de réponse à une stimulation antigénique sont similaires. De plus le modèle murin a déjà démontré sa pertinence pour reproduire les mécanismes de développement de nombreuses pathologies lymphoprolifératives humaines. Les souris transgéniques seront utilisées à partir de 12 semaines et jusqu'à 18 mois dans le cadre de la procédure la plus longue, ce stade a été déterminé afin de reproduire au mieux la pathologie humaine survenant tardivement et avec un développement s'étalant sur plusieurs années. Les souris sauvages seront utilisées à 6 semaines puisque ce stage jeune favorise une reconstitution post-greffe efficace.
Squelette neuronal et dyskinésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie générale, puis reçoit des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines. 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dont 412 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif déclaré est de comprendre comment la L-Dopa s'intègre au squelette interne des neurones et provoque les mouvements involontaires des patients parkinsoniens traités au long cours. Le porteur ramène les atteintes à une perte de poids et à une perte d'autonomie pour boire et manger, compensées selon lui par les soins, et annonce des tests comportementaux moteurs tous les deux jours sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une affection cérébrale qui perturbe les mouvements et peut avoir un impact considérable sur la vie quotidienne. La L-Dopa, le médicament le plus couramment utilisé, aide à gérer les symptômes de la maladie de Parkinson, mais après un traitement prolongé, elle peut provoquer des effets secondaires très gênants tels que des mouvements involontaires anormaux nommés dyskinésies. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme en cause afin d’identifier un moyen de limiter ces effets indésirables. Nous avons découvert que la L-Dopa peut s'intégrer directement dans les structures qui composent le squelette interne des neurones, appelées microtubules. Ces microtubules sont importants pour la transmission d'informations d'un neurone à l'autre. Notre projet vise à comprendre le rôle des microtubules contenant de la L-Dopa dans le développement de la dyskinésie et à contribuer à mieux comprendre les défauts neurologiques chez les patients en traitement prolongé à la L-Dopa.
Bénéfices attendus
Étant donné que la L-Dopa est le traitement standard de la maladie de Parkinson et que son utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires tels que les mouvements involontaires (dyskinésie), il est très important de comprendre son impact sur le fonctionnement normal du squelette neuronal dans la communication entre les neurones. En étudiant les protéines impliquées dans la modification de ce squelette neuronal par la L-Dopa, nous pourrions trouver de nouvelles façons de minimiser les effets secondaires de ce traitement.
Procédures
Les souris subissent des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes. Nous administrons quotidiennement des substances par injections dans l'abdomen pendant deux semaines. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrices impactées par l'administration du traitement contre la maladie de Parkinson. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaines, avec un test tous les deux jours. Les souris peuvent subir une injection intraveineuse sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur affectant l'autonomie des souris à s'hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour l'étude de l'anatomie du cerveau.
Remplacement
Une première partie des expériences a été faite in vitro et sur des neurones en culture. Pour la suite du projet, il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau et les mouvements anormaux.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Pour permettre l'acclimatation, un minimum d'une semaine sera alloué lorsque les animaux seront transférés d'autres installations. Afin de donner la priorité au bien-être des animaux et de minimiser la douleur, la détresse ou la souffrance potentielles pendant les expériences, nous surveillons l'état de santé et de stress des souris tout au long de l'étude. Pendant les semaines de convalescence suivant l'opération, les souris seront surveillées et recevront de la nourriture supplémentaire. En cas de douleur ou d'inconfort, un analgésique sera administré. Nous utilisons des points limites adaptés permettant d’intervenir rapidement pour limiter la souffrance de l’animal. Étant donné que la procédure chirurgicale pour l'induction de la lésion qui générerait la maladie de Parkinson peut entraîner des problèmes d'alimentation et de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée d'une solution de glucose et de sérum physiologique immédiatement après l'opération et une fois par jour pendant la première semaine postopératoire. Compte tenu de la possibilité de complications postopératoires, un dossier complet d'évaluation de la santé sera tenu pour chaque souris pendant les 14 premiers jours suivant l'opération. Des tests comportementaux seront effectués après une période d'entraînement pour limiter le stress de la nouveauté.
Choix des espèces
La souris est un mammifère génétiquement modifiable, dont l'anatomie et la physiologie sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. En outre, l'élevage des souris et les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. Des modèles génétiquement modifiés d'intérêt existent déjà dans notre laboratoire et les échelles de dyskinésie pour les souris sont maintenant bien validées et largement utilisées. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines.
Modèle expérimental de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1425
Lapins : 1425
Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.
Objectifs
La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.
Bénéfices attendus
Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.
Procédures
La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Mesure de la valeur alimentaire des aliments pour ruminants sur des ovins
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Réutilisés d'une période de mesure à la suivante après au moins quatre semaines de repos, les moutons réintègrent à la fin du projet la filière classique d'élevage ovin. 35 moutons de race Texel vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est conduit au licol jusqu'à une cage de digestibilité et maintenu à l'attache pendant onze jours, avec une pesée au début et à la fin de la période. Le porteur reconnaît que cette attache de onze jours est la principale nuisance et précise que les moutons voient, sentent et touchent leurs congénères à travers les parois ajourées, l'objet du projet étant de mesurer la valeur alimentaire de fourrages destinés aux élevages de ruminants.
Objectifs
L’objectif du projet est de mesurer la valeur alimentaire des fourrages ce qui implique de mesurer l’ingestion de ces fourrages par les animaux et la digestibilité des mêmes fourrages.
Bénéfices attendus
L'alimentation des ruminants est une des principales clefs de réussite de leur élevage. Clef technique, pour réaliser les objectifs de production de l'éleveur, clef économique puisque c'est une des principales charges des élevages. Il importe donc de pouvoir optimiser les aliments utilisés et/ou produits sur l'exploitation pour nourrir les animaux de la dite exploitation. La connaissance la plus précise possible de la valeur alimentaire de ces aliments, fourrages notamment, est donc un facteur de réussite technique et économique des élevages de ruminants. Ce projet permet également de caractériser finement les fourrages distribués à nos bovins, et donc de calculer les apports des rations ingérées par nos bovins expérimentaux et de les mettre en regard des caractères que nous mesurons (production laitière, croissance,...).
Procédures
Les moutons sont conduits au licol de leur parc jusqu'à la cage au début de la période de mesure. Ils sont également pesés au début et à la fin de chaque période. Chacune de ces opérations dure environ une minute. Les moutons sont à l'attache lors des périodes de mesure qui durent 11 jours.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendues sur les animaux est le fait qu'ils soient à l'attache dans la cage de digestibilité pendant 11 jours. Ils ne sont cependant pas totalement isolés puisqu'ils peuvent voir, sentir et toucher leurs congénères à travers les parois ajourées des cages de digestibilité.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux sont réutilisés pour une nouvelle période de mesure, mais après une période de repos d'au moins 4 semaines pendant l'hiver. Sur la saison de pâturage, il n'y a pas de période de mesure donc les animaux sont toujours au pré (d'avril à octobre). A la fin du projet, les animaux réintègrent la filière classique d'élevage des ovins.
Remplacement
Il existe une méthode chimique pour déterminer la digestibilité des fourrages. Cette méthode n'est cependant pas assez précise pour obtenir des résultats scientifiques fiables, d'où l'utilisation de la méthode de référence, à savoir des mesures in vivo.
Réduction
L'utilisation de 6 moutons pour une période de digestibilité est l'effectif minimum pour avoir une moyenne représentative.Les résultats obtenus (mesures et analyses) sont moyennés pour obtenir la valeur alimentaire du fourrage étudié. Si un mouton a des valeurs à plus d'un écart-type de la moyenne (de la digestibilité de la matière sèche), ses mesures et analyses sont retirées du calcul de la valeur alimentaire du fourrage.
Raffinement
Pour mesurer la valeur alimentaire d'un fourrage, 6 moutons sont attachés en stalles individuelles contiguës pendant 11 jours. Pour leur confort alimentaire, une transition alimentaire permet de les habituer progressivement à l'aliment testé. Pour améliorer leurs conditions d'hébergement dans les stalles, celles-ci sont équipées d'un abreuvoir individuel et d’une petite brosse pour le grattage. Les moutons sont de race TEXEL. En effet, la race TEXEL étant doté d'aplombs solides, elle a été utilisée dès la création de la méthode. Elle continue à l'être.
Choix des espèces
L’espèce cible est un ruminant (bovin) et le mouton est utilisé comme modèle de ruminant de plus petite taille. Les ovins (40-100 Kg de poids vif) sont plus facilement manipulables que des bovins (700-1000 Kg de poids vif) et plus dociles que des chèvres. Et leurs résultats sont extrapolables aux autres espèces de ruminants. Animaux entre 1.5 et 4 ans d'âge à un poids compris entre 40 et 85 Kg de poids vif.
Etude de la réponse immunitaire induite chez le furet après vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Commandés à un fournisseur après une première série de quatre furets utilisés entre novembre 2023 et février 2024 pour que les expérimentateurs acquièrent les gestes, 12 furets vont être utilisés à leur tour, tous tués à l'issue pour constituer une banque de tissus. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Sur onze semaines, chaque furet reçoit un implant télémétrique, jusqu'à huit prises de sang, une vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée, une administration intratrachéale et un lavage broncho-alvéolaire, tous ces actes sous anesthésie générale de 5 à 30 minutes. Le furet est retenu parce qu'il est sensible à Mycobacterium bovis comme le blaireau, espèce sauvage visée par le programme de vaccination, dont l'expérimentation est soumise à une réglementation plus contraignante.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique plus global visant à étudier la vaccination contre la tuberculose, dans la faune sauvage. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Les objectifs sont d’analyser l’influence de la voie de vaccination (orale vs sous cutanée) sur la mise en place d’une réponse immunitaire contre les mycobactéries. Le modèle furet est utilisé pour la première fois dans nos conditions « infectieuses » d’expérimentation. Une première expérimentation a eu lieu avec 4 furets entre novembre 2023 et février 2024 afin de permettre aux expérimentateurs d’acquérir les gestes techniques. Le présent projet est prévu pour au maximum 12 furets : 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie orale et 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie sous-cutanée. Le sexe ratio sera adapté selon les capacités du fournisseur à nous fournir au moment de la commande. La voie sous cutanée a été testée sur des blaireaux mais elle nécessite une capture des animaux. Si ce projet démontre que la voie orale est aussi efficace, elle serait plus adaptée pour une vaccination à grande échelle. La voie sous-cutanée est une référence car elle est bien décrite dans différents modèles pour son efficacité. La voie intratrachéale est utilisée pour mimer l’exposition des animaux au pathogène (voie pulmonaire) afin de visualiser la réponse protectrice développée par la vaccination. Il s’agit d’un boost pour pouvoir quantifier la réponse immunitaire. Dans le modèle murin il s’agit d’une voie classique d’exposition. Ce projet a 3 finalités : 1) Répondre à la réglementation en expérimentation animale en vigueur concernant la maitrise et le maintien du savoir-faire du personnel. Ce projet permettra de perfectionner la mise en œuvre de gestes techniques sur modèle furet (manipulation, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale, injection sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) 2) Valider les outils d’analyse de la réponse immunitaire developpé sur des furets sains « non infectés » 3) Quantifier la reponse immunitaire des furets suite à une vaccination BCG.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles : 1) valider les outils nouvellement developpés (analyse des cellules immunitaires par cytométrie en flux, analyse des réponses immunitaires par transcriptomique) 2) définir la meilleure voie d’administration du vaccin BCG (voie sous cutanée ou orale), permettant la mise en place d’une protection optimale contre les mycobactéries.
Procédures
Au cours des 11 semaines du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : - 1 pose de puces télémétriques qui durent quelques secondes - 8 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes - 1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min - 1 administration en SC (sous cutanée), qui dure quelques secondes - 1 administration en intra-trachéale, qui dure quelques secondes.Tous ces actes se feront sous anesthésie générale pendant 5 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. En raison de leur hébergement en couple, d'éventuelles blessures infligées par les congénères sont possibles (griffure, morsure, abcès…).
Devenir
La totalité des animaux sera mis à mort à l’issue du projet afin de constituer une banque de tissus d’animaux qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimal d’animaux a été fixé à 6 par lot pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux (hébergement en couple) et pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet. En fonction de ce que le fournisseur sera en mesure de nous fournir au moment de la commande, le sexe ratio de chaque lot pourra être adapté. L’expérimentation contient 2 lots : un lot pour lequel le BCG est administré par voie orale et un lot avec une administration par voie sous-cutanée. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants.
Raffinement
Dans les 2-3 jours suivants leur arrivée, les furets seront anesthésiés pour permettre la pose des implants télémétriques puis une période d’acclimatation à l’environnement et d’habituation au personnel sera mise en place pendant 21 jours. La seule intervention du personnel sera de les habituer à leur présence et aux contacts : jeux, friandises. Ils seront également vermifugés. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues spécifiquement pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage mais elles seront interconnectées par 2 avec un système de tunnel permettant aux furets de se regrouper. Un hamac en tissu sera suspendu à l’intérieur de chaque cage permettant aux furets d’avoir un coin repos. Différents types de jouets seront utilisés (balle, tissus…). Des récompenses alimentaires (saumon, jus de thon, pâte appétente) seront données après les interventions qui ne nécessitent pas d’anesthésie (pesée, traitement anti-parasitaire). Ces récompenses alimentaires qui seront données au cours de la période d’acclimatation permettront d’habituer les animaux pour l’administration orale du vaccin à J0. Les furets seront maintenus sous anesthésie générale gazeuse. Tout au long de l’anesthésie, ils seront sous monitoring (fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, température), sous lampe et/ou tapis chauffant et sous la supervision du personnel en charge des anesthésies. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel sera mis sur la sonde pour anesthésier la gorge. Lors de la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera faite, jusqu'à son réveil complet. En cas de besoin, des traitements seront mis en place pour faciliter le réveil et gérer une éventuelle douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique sera mis en place. La vétérinaire de l'unité sera systématiquement consultée en amont. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin d'assurer les soins quotidiens, de surveiller l’état de santé des animaux. Des point limites adaptés ont été définis et la vétérinaire de l’unité sera avertie en cas d’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 1 an (poids d’environ 1400 g pour les mâles et 1200 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes est conditionné par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement.
Evaluation de nouveaux outils radiothérapeutiques ciblant le noyau des cellules cancéreuses – EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Les souris retenues sont dépourvues de thymus, donc privées d'une grande partie de leurs cellules immunitaires, pour que leur organisme ne rejette pas la tumeur humaine qu'on leur greffe. 2 480 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à six anesthésies, une greffe sous-cutanée, une injection intraveineuse de composé radiomarqué, jusqu'à 45 minutes d'imagerie et des mesures de tumeur au pied à coulisse, avec hébergement individuel après l'injection radioactive, ce que le porteur décrit comme un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression". La mise à mort sert à compter la radioactivité organe par organe, le cadavre étant lui aussi récupéré.
Objectifs
Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, menant à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.
Devenir
Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.
Raffinement
Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des cellules tumorales (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.
Choix des espèces
Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.
Rôle de forces mécaniques dans le développement du système nerveux chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.
Objectifs
Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).
Impact sur les animaux
La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).
Remplacement
L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.
Evaluation de traitements contre la rhinite chez le cobaye
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés quatre fois par injection, triés selon leur réaction inflammatoire, puis exposés à l'allergène dans les deux narines, 1 260 cobayes développent éternuements, frottements du museau, larmoiement et écoulement nasal, comportements observés pendant deux heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 1 080 d'entre eux et léger pour 180, avec jusqu'à 28 administrations d'un candidat médicament sur quatre semaines. Le porteur écrit que "les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi" au moment de justifier l'intérêt du projet, après avoir décrit ces mêmes symptômes comme le résultat recherché chez les cobayes. Les animaux répondants sont tués pour prélèvement terminal du liquide nasal, du sang et d'organes, les 180 non-répondants restant en vie pour de "potentielles études futures".
Objectifs
La rhinite allergique est une maladie chronique des voies respiratoires très fréquente. Sa prévalence a augmenté considérablement ces dernières décennies, au point de constituer un problème de santé publique. 25% de la population est affectée dans les pays développés. La rhinite allergique constitue un problème de première importance en raison de sa prévalence élevée, des coûts qu’elle occasionne, de son évolution vers l’asthme et de ses effets considérables sur la qualité de vie des personnes affectées. La rhinite est déclenchée par une réaction excessive du système immunitaire en présence d’un allergène, comme le pollen ou les acariens. Pour défendre l’organisme, le système immunitaire libère divers composés, notamment de l’histamine, qui sont responsables des symptômes allergiques. Le traitement le plus efficace est l’éviction de l’allergène en cause, mais ceci est difficilement possible en pratique (e.g. cas d’une allergie aux pollens). Différents traitements sont disponibles. Cependant, les corticoïdes en suspension nasale ont des d’effets indésirables, tels que saignement de nez, irritation, fragilisation de la muqueuse nasale en cas de traitement prolongé. Les antihistaminiques peuvent également entrainer de la sédation. L’immunothérapie spécifique ou désensibilisation permet aussi d’induire une tolérance à un ou plusieurs allergènes. Dans ce contexte, le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et les symptômes (éternuement, écoulement nasal,…) de la rhinite chez le cobaye.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de substances en cours de développement sur l'apparition des symptômes de la rhinite mais également sur la réponse inflammatoire. En effet, si les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi, leur association peut les rendre difficiles à supporter et avoir un impact non négligeable sur la qualité de vie des patients (troubles du sommeil, fatigue chronique, difficultés de concentration, baisse de performance,…). Sans compter que les allergies peuvent exacerber les maladies suivantes : asthme, infection des voies respiratoires supérieures, sinusite ou bronchite. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer un traitement efficace afin d’inhiber les symptômes de la rhinite et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les cobayes seront sensibilisés à 4 reprises en standard par l'injection d’un réactif (durée d’environ quelques secondes). Une semaine a minima après la dernière sensibilisation, les animaux répondants seront sélectionnés par injection (durée de quelques secondes) du même réactif (observation non invasive pendant 40 minutes de l’apparition d’une réaction inflammatoire au point d’injection). La rhinite est ensuite induite par une injection du réactif au niveau des 2 narines, durée de quelques secondes. Les symptômes de la rhinite seront évalués par observation du comportement de l’animal (en général pendant 2 heures après le challenge, après une période d'habituation de 30 minutes). Des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes) peuvent être réalisés au cours de l’étude (maximum 2 prélèvements). Après l’évaluation des symptômes, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements, e.g. sang, liquide nasal ou organes d’intérêt (durée de quelques secondes). Les candidats médicaments seront administrés (durée de quelques secondes) de manière aigue (une administration unique) ou chronique (durée maximum de 4 semaines selon le composé, soit 28 administrations).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, il est attendu le développement des symptômes de la rhinite après le challenge par voie nasale, i.e. principalement éternuement, frottement du museau, larmoiement, rhinorrhée et sécrétion de mucus. Il n’est pas attendu d’effets indésirables pendant la phase de sensibilisation des animaux. Pendant la phase d’observation des animaux, ces derniers sont isolés afin de mieux les observer. Des prélèvements intermédiaires réalisés au cours de l’expérience chez les animaux vigiles pourraient également constituer un stress.
Devenir
Tous les animaux répondants sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (prélèvement du liquide nasal, de sang et/ou d'organes) afin d'évaluer l'effet des candidats médicaments sur la réponse inflammatoire. Les animaux non-répondants à la sensibilisation sont maintenus en vie car ils ne présentent pas de symptômes particuliers et pourront donc être utilisés dans de potentielles études futures.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests in vitro et in silico ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système respiratoire chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études (otamment, les prélèvements terminaux systématiques permettent d'éviter d'utiliser d'autres animaux). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe non sensibilisé, à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux par groupe est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye est reconnu comme un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de rhinite ou toux. Les études sont principalement réalisées chez des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique.
Impact de l’inhibition l’héparanase-1 sur la dysfonction endothéliale, le risque thrombotique dans un modèle murin de syndrome des antiphosholipides
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées avant la fin du protocole. 135 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 90 d'entre elles et sévère pour 45. Chacune reçoit sept injections intrapéritonéales sous contention, subit une chirurgie de vingt minutes destinée à provoquer une thrombose, une mesure de flux au doppler carotidien, puis un prélèvement terminal dans la veine cave. Il s'agit de tester chez la souris un inhibiteur de l'héparanase-1 déjà évalué sur cellules endothéliales humaines, le porteur indiquant projeter ensuite d'étudier cette inhibition chez l'être humain.
Objectifs
Le syndrome des antiphospholipides est une thrombophilie acquise par des anticorps anti-phospholipides. Les manifestations cliniques associent des thromboses artérielles, veineuses et microcirculatoires ainsi que des complications obstétricales dont le traitement est symptomatique et repose actuellement exclusivement sur les antivitamines k . Les antivitamines K sont la première cause d’hospitalisation et de mortalité en France, de plus malgré ce traitement le taux de récidive reste de l’odre 16 %. Notre équipe a précédemment montré que les patients atteints de cette maladie avaient une dysfonction endothéliale, un stress oxydant accru et une altération du glycocalyx . Par ailleurs, nous avons montré que l’inhibition spécifique de l’héparanase-1 par SiRNA et par un inhibiteur pharmacologique permettait d’améliorer la dysfonction endothéliale induite par les anticorps antiphospholipides sur les cellules endothéliales humaines en cultures. Nous souhaitons montrer que l’inhibition pharmacolique de l’héparanase-1 permet de réduire l’état prothrombotique par l’admnistration de ce traitement à des souris C57/BL6J.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle de l'heparanase-1 dans l'induction d'une thrombose veineuse, artérielle et dans la dysfonction endothéliale artérielle mésentérique induit pas l'administration anticorps anti-phospholipides. Cela ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie pour lequel nous ne disposons actuelement que de traitements symptomatiques.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections intrapéritonéal d'une durée de quelque seconde avec une contention de l'animal vigile (7 fois par animal). Les Animaux auront subi des chirurgies pour induire une thrombose artérielle ou carotidienne cela sera sous anesthésie / Analgésie et d'une durée de 20 minutes (1 fois par animal et une chirurgie par animal). Etude du flux par dopplor carotiene durée 20 minutes sous anesthésie / Analgésie (une fois par animal). Prélèvement de sang par la veine cave en manipulation terminal sous anesthésie générale et analgésie durée 3 minutes (1 fois par animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont principalement sont une injection quotidienne pendant 7 jours pour un groupe qui peut crée un stress chez l'animal . Les animaux de la procédure subiront une anesthésie gazeuse et une anesthésie par voie intrapéritonéale pour la chirugie de la ligature de la veine cave qui peut entraine une leger perte de poids chez l'animal . Une fatigue des animaux après ligature est observable sur une durée de 12h . La procédure chirugical de classe modérée pouvant occasionner une douleur modérée post-opératoire et une gêne au niveau des zones d'incision .Les animaux des trois procédure subiront une anesthésie par voie intrapéritonéale en phase terminal pour l'analyse de l'artere mesentérique en artériographie et prélèvements d’organes.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de toutes les procédures pour récuperation des organes et analyse histologiques.
Remplacement
Nous travaillons dans le labortaoire sur des modèles in vitro de SAPL avec des cellules endothéliales en culture, ,nos avons déjà montré de facçon indirecte que l'inhibition de l'HPSE pouvait avoir un intérêt. Cependant l'étude de la thrombo formation implique l'interface entre les cellules endothéliales, les éléments figurés du sang, les composés de la cascade de la coagulation et le flux sanguin. Ces interactions ne peuvent pas être reproduite dans leur complexite in vitro à l'heure actuelle. Enfin nous projetons d'étudier l'inhibition de l'PHSE chez l'homme.
Réduction
Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux, afin que l'étude sur différents plans (histologique et statistique) puisse se dérouler sans encombre et une analyse des résultats sera effectuée à mi-parcours, afin de déterminer si le nombre d’animaux est suffisant pour l'analyse statistique. La fonction endothéliale, la vitesse d’apparition du thrombus intra carotidien et le pourcentage de thrombose cave inférieure seront les critères de jugement principaux, alors que les paramètres biologiques et histologiques d’hémostases, d’inflammation, et d’activation endothéliale seront des critères de jugements secondaires. Sur la base des données historiques obtenues avec d’autres modèles murins , nous avons effectué une simulation pour chaque paramètre obtenu chez des animaux non traités .
Raffinement
Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé . Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé plusieurs fois par jour durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres du bien être animal (cf. : grille de points limites). Les souris perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en préopératoire et pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser des souris mâles, ce qui diminuera les variations et permettra une meilleure comparaison entre nos groupes.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’utiliser la souris comme modèle expérimental pour la comparabilité des résultats avec études antérieurs, faites uniquement sur modèle murin. De plus le modèle de SAPL chez la souris est proche de la physiopathologie humaine et les protéines cibles de la pathologie étudiée ont une homologie de séquence à celle de l’homme ce qui implique que les anticorps humains sont capables de reproduire la pathologie chez la souris. Par ailleurs, le système cardio-vasculaire murin se rapproche de l'être humain. Nous allons utiliser des souris males adultes de 12 semaines (22/24g) comme précédemment publié dans notre laboratoire. L’âge de ces souris permet un actes de chirurgie plus optimal .
Etude des effets de différentes techniques de préparation de spermatozoïdes utilisées pour la procréation assistée sur le profil épigénétique de la descendance de souris minces ou obèses.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Pour savoir si les techniques de préparation du sperme utilisées en procréation médicalement assistée modifient le profil épigénétique de la descendance, 3 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle puis sont tuées pour récupérer leurs ovocytes. Les mâles, soumis à des régimes alimentaires contrastés pendant quatre à douze semaines, subissent un gavage et neuf micro-prélèvements de sang lors du test de tolérance au glucose, un scan de composition corporelle, puis un prélèvement sanguin terminal. Les femelles receveuses d'embryons sont transférées par voie vaginale ou par chirurgie abdominale, avec sept à dix jours de convalescence, et tuées quand elles sont "trop âgées pour être utilisées pour la procréation".
Objectifs
L’infertilité, due à une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux, est une condition qui touche 1 couple sur 6 en âge de procréer. Les techniques de procréation médicalement assistée (PMA) sont des traitements largement acceptés pour les couples infertiles. Elles sont considérées comme des procédures sûres, cependant, des corrélations avec l’augmentation de l’incidence de syndromes liés à des anomalies épigénétiques (modification de l’activité de gènes sans changement de la séquence d’ADN mais pouvant être transmis) ont été suggérées. Des incertitudes demeurent quant à l’attribution de ces anomalies à la procédure elle-même, à des facteurs liés à l'infertilité, à des facteurs médicaux et environnementaux sous-jacents, ou à une combinaison de ceux-ci. Il est donc important de déterminer si les techniques de procréation assistée apportent des modifications entraînant des conséquences sur le développement et la santé de leur progéniture. La majorité des travaux dans ce domaine se concentre sur les influences maternelles, mais l’importance du rôle des pères apparait de plus en plus évidente. Certaines anomalies présentes au niveau des spermatozoïdes ont été associées à une diminution de la fertilité et suscitent des interrogations quant à une éventuelle transmission à la descendance. L’objectif de ce projet est d’établir les profils des pères et de leurs descendants afin de mieux comprendre comment sont transmises ces anomalies en évaluant les effets du style de vie (alimentation) et des techniques de préparation d’échantillons de spermatozoïdes sur l’efficacité et la qualité de la reproduction dans le cadre de techniques de PMA utilisées en Clinique.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude pourraient avoir des implications significatives en ce qui concerne la procréation médicalement assistée, et plus généralement en termes de santé métabolique et reproductive. Déterminer les effets du style de vie et des techniques actuellement utilisées sur la santé de la progéniture représenterait une avancée importante dans le domaine. Les découvertes liées à ce projet aideront au développement d’outils qui permettront aux cliniciens d’identifier les échantillons de sperme présentant des caractéristiques associées à une susceptibilité accrue aux troubles de la fertilité, facilitant le parcours de traitement pour les couples ayant recours à la procréation assistée. Par ailleurs, mieux comprendre l’hérédité de la prédisposition aux maladies pourrait ouvrir de nouvelles voies dans le domaine de la prévention.
Procédures
Les femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons subissent deux injections d'hormones (30s/injections) à 48h d’intervalle. Lors du test de tolérance au glucose, les males subissent un gavage (administration orale à l’aide d’une sonde adaptée) (20s) et 9 micro-prélèvements de sang (20s/par prélèvement). Pour la détermination de la composition corporelle (masse maigre et masse grasse présentes dans le corps des animaux) la durée du scan par l'appareil est de moins de 5min. Les animaux sur lesquels un transfert d’embryon par voie vaginale est pratiqué subissent une anesthésie gazeuse de courte durée (environ 10min). Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée pour le transfert d’embryons (durée
Impact sur les animaux
Les femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons subissent deux injections d'hormones à 48h d’intervalle. Compte tenu de l’innocuité connue des substances administrées, aucun effet indésirable particulier n’est attendu suite à cette procédure. Lors du test de tolérance au glucose, une douleur modérée de courte durée associée aux prélèvements de sang est attendue. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, un appareil permettant d’utiliser des animaux vigiles et avec un minimum de stress (contrainte de quelques minutes seulement) est utilisé.Les animaux sur lesquels un transfert d’embryon par voie basse est pratiqué subissent une anesthésie gazeuse de courte durée (environ 10 min) il n’est pas attendu de douleur pour ce geste. Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée pour le transfert d’embryons (durée
Devenir
La collecte des échantillons de sperme ainsi que des tissus à analyser à l'issue de l'étude où les mâles sont soumis à différents régimes nécessite la mise à mort des animaux. La récupération des ovocytes chez les femelles stimulées hormonalement nécessite également la mise à mort des animaux. Les femelles receveuses d'embryons seront euthanasiées lorsqu'elles seront trop agées pour être utilisées pour la procréation.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les caractéristiques transmises à la génération suivante. Pour cette raisons, nous ne pouvons pas procéder sans un organisme vivant qui nous permettra d’obtenir plusieurs générations mais également de reproduire les techniques de procréation médicalement assistée utilisées actuellement en clinique. L’utilisation de souris est donc essentielle pour que les résultats soient transférables pour des applications chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Afin d’optimiser les protocoles de collecte d’ovocytes, de fécondation in vitro et de transfert d’embryons, nous prévoyons tout d’abord d’utiliser un nombre restreint d’animaux au cours d’une étude pilote qui sera réalisée avant le démarrage de l’étude principale. Les animaux impliqués dans l’étude pilote représentent 1,5% du nombre total d’animaux. Ceci permettra de s’assurer que les méthodes utilisées sont appropriées pour répondre à notre problématique avant d’impliquer un plus grand nombre d’animaux. Les prélèvements de sperme pour cette étude pilote seront réalisés post-mortem sur des mâles surnuméraires de l’établissement, afin de ne pas impliquer d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Toutes les expériences prévues ont été planifiées de telle sorte que les points finaux (lorsque la souris est euthanasiée) précèdent autant que possible le moment où le stress ou la douleur surviennent. Nous effectuons une évaluation précise de l’état de santé des animaux lors de l’hébergement et des procédures expérimentales. A leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (dômes, briquettes en bois pour ronger etc.). La boisson et la nourriture seront disponibles à volonté. Les conditions d'hébergement et de soins ainsi que les méthodes utilisées ont été choisies et conçues pour minimiser toute douleur, anxiété ou dommage durable que pourraient subir les animaux. La voie « basse » est privilégiée par rapport à une méthode chirurgicale pour le transfert d’embryons car elle est moins traumatique pour l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés chaque semaine. Des points limites précis et adaptés ont été établis pour ce projet.
Choix des espèces
La souris est le plus petit mammifère modèle utilisé en recherche nutritionnelle, de plus s’agissant d’études concernant la transmission de caractères héréditaires, il est essentiel d’utiliser une espèce nous permettant d’obtenir plusieurs générations mais également de pouvoir reproduire des techniques utilisées chez l’Homme dans le cadre de la procréation médicalement assistée. Les mâles seront réceptionnés au sein de l’établissement utilisateur à 3-4 semaines et soumis à un minimum de 4 semaines de régimes (maximum 12 semaines) afin de pouvoir procéder à la collecte de sperme au moment de leur maturité sexuelle. Les femelles donneuses d’ovocytes sont utilisés à partir de 3-4 semaines d’âge (âge permettant la récolte du plus grand nombre d’ovocytes et permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisés). Les femelles receveuses seront utilisées entre 8 et 12 semaines d’âge (âge correspondant à la maturité sexuelle).
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
30 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dans environ 600 études de 50 souris destinées à tester des candidats médicaments contre le cancer. Selon les études, elles reçoivent des tumeurs humaines ou murines par chirurgie ou par injection, et peuvent subir d'autres chirurgies jusqu'à 30 minutes, castration ou interventions sur le fémur, le foie ou le poumon, ainsi que des traitements par toutes les voies, des séances d'imagerie jusqu'à 45 minutes et des prises de sang. Certaines sont immunodéficientes, d'autres dotées d'un système immunitaire humain à partir de cellules de cordon ombilical ou de sang humain. Le porteur justifie leur mise à mort par l'implantation de tumeurs, sans rien dire du sort des souris sans tumeur prévues pour des études pilotes, de biodistribution et de toxicité. Il indique avoir fixé l'effectif d'après les études des années antérieures, en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration des souris R26-p53PC. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.
Raffinement
En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. La castration pourra être réalisée à partir de 10 semaines d’âge.
Etude du rôle du récepteur ERa sur la fonction endothéliale lymphatique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Après cinq jours d'injections quotidiennes, des souris, en grande majorité des femelles, subissent sous anesthésie une chirurgie qui provoque un lymphœdème dans une patte, une injection de cellules tumorales, ou les deux. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un récepteur aux œstrogènes, ERα, dans les vaisseaux lymphatiques. Le porteur décrit le lymphœdème humain comme une "accumulation massive" de liquide et de graisse dans un membre, puis écrit que la chirurgie qui le provoque chez la souris "ne génère pas d'effet indésirable majeur", tout en annonçant "des douleurs modérées" liées aux chirurgies et aux tumeurs. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs tissus, et celles qui passent par une lymphographie, injection fluorescente dans les pattes sous anesthésie, sont tuées sans réveil.
Objectifs
Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.
Procédures
Dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Enfin les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.