Procédures modérées

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant cinq semaines seule en cage à cause de la prothèse fixée sur son crâne. Deux interventions chirurgicales, de 45 à 90 minutes puis de 90 à 120 minutes, ouvrent la peau et le crâne pour une injection stéréotaxique et la pose d'une lentille dans le cerveau. Les souris sont ensuite habituées à porter un appareil d'imagerie sur la tête, puis soumises à une tâche d'apprentissage que le porteur qualifie de légèrement désagréable. L'étude vise la compréhension des mécanismes de la mémoire, les retombées annoncées pour Alzheimer ou Parkinson étant renvoyées à un "à terme" sans échéance.

Objectifs

La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur modérée de 2 jours, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent suite à l'incision de la peau, la craniotomie, l'injection stéréotaxique, l'installation de la lentille GRIN et la réalisation des points de sutures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement par le séparateur en plexiglasse.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de la procédure afin de réaliser des expériences histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Pour estimer correctement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons sollicité l'avis de deux experts renommés dans le domaine. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes neuronaux sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d’âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie crânienne d'une heure trente, puis deux séances d'imagerie cérébrale d'une heure et demie à deux et quatre jours d'intervalle, certaines sur animal éveillé, d'autres sous anesthésie avec un courant électrique appliqué sur la patte. Le laboratoire évalue ainsi des candidats analgésiques non opioïdes qu'il a lui-même développés et dont il indique qu'ils ont déjà montré un effet chez le rat et la souris. La mise à mort est justifiée en ces termes : "dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés".

Objectifs

Face à la crise des opioïdes largement répandue en Amérique du Nord, et qui menace aussi les pays européens, il est devenu essentiel de développer de nouveaux médicaments analgésiques non opioïdes, plus sûrs et sans risques d’addiction. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de nouveaux candidats-médicaments non addictifs et de mieux comprendre comment ils traitent la douleur. Les candidats- médicaments développés par le laboratoire ont montré un effet antidouleur significatif chez les rats et les souris. Pour renforcer ces résultats, nous utiliserons des techniques d'imagerie cérébrale pour observer les effets de ces médicaments sur le cerveau. Cette imagerie nous permet de visualiser et de comprendre les effets précis de ces molécules. Dans cette étude, nous utiliserons l'imagerie fonctionnelle pour observer la réponse du cerveau après l'administration des candidats-médicaments en les comparant à des analgésiques de référence. Cette méthode nous aide à mieux comprendre comment ces médicaments agissent sur le cerveau et à confirmer leur potentiel en tant que traitements sûrs et efficaces contre la douleur.

Bénéfices attendus

Les candidats médicaments développés par le laboratoire sont des molécules très affines et sélectives pour leur cible. Leur haute affinité les rend actives à faible dose et leur sélectivité limite les effets indésirables. Ces molécules ont montré des activités thérapeutiques très intéressantes lors d’études pré-cliniques. L’imagerie fonctionnelle permettrait d’apporter des informations complémentaires sur les mécanismes pharmacologiques de ces molécules et ainsi mieux comprendre leurs effets thérapeutiques. Dans ce projet nous nous intéresseront à leur effet analgésique et cela pourra aboutir au développement de potentiels nouveaux analgésiques plus sûrs pour les humains.

Procédures

Dans les deux expériences, chaque animal subira une chirurgie préalable (1h30) aux sessions d’imagerie. Cette chirurgie se fera sous anesthésie générale et sera complétée d’une anesthésie locale, d’une analgésie et d’une injection d’anti-inflammatoires. A J+2 et J+4 de cette chirurgie, 2 sessions d’imagerie d’une heure et demie (30 min de préparation + 1 heure d’acquisition) auront lieu. Les sessions d’imagerie se font chez l’animal éveillé libre des ses mouvements dans l'expérience 1 et sous anesthésie au cours de l'expérience 2. Au cours des sessions d’imagerie de l'expérience 2, le candidat-médicament sera injecté en sous-cutané puis un court stimulus sera appliqué par un courant électrique sur la patte de l'animal.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire pour préparer l'animal à l'imagerie, peut occasionner une douleur locale ainsi que du stress physique immédiatement après la procédure. Elle peut également conduire à une réduction temporaire de la prise alimentaire due à l'inconfort lors de la mastication et provoquer une perte de poids. De plus, l'implantation d'un dispositif pour l'imagerie éveillée, le cas échéant, peut engendrer une douleur post-opératoire et une gêne. Au cours de l’acquisition d’imagerie, le stimuli électrique appliqué provoquera une douleur courte et transitoire de la patte

Devenir

Dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’objectif du protocole est d’étudier la réponse du cerveau à l’effet analgésique d’un candidat médicament. La douleur étant un processus physiologique complexe, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’intégration et le traitement du message nerveux douloureux dans sa globalité.

Réduction

Les analyses seront effectuées avec 8 animaux par condition, afin d’assurer une puissance statistique suffisante. Pour la procédure 1, ce nombre a été augmenté à 9 du fait d’une possible perte des dispositifs de maintien de la sonde. Pour réduire le nombre d’animaux, chaque animal pourra réaliser jusqu’à trois acquisitions d’imagerie

Raffinement

La douleur sera prise en charge à chaque étape de l’expérience (pré, per et post-opératoire) afin d’être minimisée. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’aide d’une grille de score permettant dévaluer leur état général selon différents critères (apparence, comportement, poids). En cas de mal-être constaté, des mesures seront prises pour améliorer l’état de l’animal. Le stress sera minimisé grâce à une habituation aux expérimentateurs, un hébergement en groupe et des enrichissements. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum selon les résultats de tests statistiques. En cas d'atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le rat est une espèce utilisée très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments et l’étude physiopathologique du système nerveux central. Les premières études précliniques caractérisant les effets analgésiques du candidat médicament ont été réalisées chez le rat. Dans un souci de reproductibilité, le rat semble donc l’espèce la plus adapté à notre étude . Il s’agit également d’une espèce bien adaptée à la méthode d’imagerie. Les rats seront âgés de 6 semaines (225-250g) à leur arrivée au laboratoire afin d’étudier l’effet des agents pharmacologiques sur des cerveaux pleinement développés.

Les porcs qui manifestent des signes cliniques graves sont mis à mort avant le terme prévu. 90 porcs de six semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour rechercher des lésions et quantifier le virus dans leurs tissus. Trente d'entre eux reçoivent par voie intranasale un virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin, puis subissent onze prises de sang et huit écouvillonnages nasaux sur animal vigile, les 54 sentinelles étant exposées à l'air qu'ils respirent. L'enjeu déclaré est la maîtrise d'une infection présente dans plus de 60 % des élevages porcins bretons, décrite d'abord par son impact économique pour la filière.

Objectifs

Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des suidés, à fort impact économique pour la filière porcine. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes et des problèmes respiratoires et retards de croissance chez les porcelets. En raison de son caractère immunodépresseur, ce virus favorise les co-infections virales et bactériennes au niveau respiratoire. Le SDRP est une maladie a distribution mondiale qui est particulièrement présente dans les zones à forte densité de production porcine. Ainsi, en France cette infection est présente dans plus de 60% des élevages de porcs en Bretagne. Il existe deux espèces du virus, le SDRPV-1 présent surtout en Europe et le SDRPV-2 présent en Amérique et en Asie. La transmission du virus se produit essentiellement de manière horizontale par contact direct entre un porc infecté et un porc sensible. La transmission verticale peut également se produire de la truie infectée aux fœtus au cours du dernier tiers de gestation. La transmission indirecte du virus peut se produire via du matériel ou des résidus contaminés. La transmission par les bioaérosols a également été démontrée pour les souches de SDRPV-2, avec une transmissibilité d’autant plus importante que la souche de SDRPV-2 est virulente. En ce qui concerne les souches de SDRPV-1, il n’existe quasiment aucune donnée sur la possibilité d’une transmission aéroportée. Cette question est d’autant plus intéressante à explorer que du génome du SDRPV-1 a été détecté dans des bioaérosols collectés dans ou à proximité de fermes infectées par ce virus. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude est d’évaluer en conditions expérimentales et sur des porcs d’élevage, la transmission aéroportée de 3 souches de SDRPV-1 de niveau de virulence variable (souche de virulence modérée, souche de faible virulence et souche d’origine vaccinale). Si la transmission aéroportée est démontrée pour au moins une des souches, un système d’assainissement d’air (filtration) sera évalué vis-à-vis de sa capacité à prévenir la transmission aéroportée du SDRPV-1. Etant donné que nous n’avons pas de données sur l’infection expérimentale de porcs d’élevage par la souche de SDRPV-1 de niveau de virulence modéré que nous souhaitons utiliser dans ce projet, nous mettrons en place un pré-essai (procédure n°1) visant à caractériser la virulence de cette souche et ses capacités de transmission directe.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de démontrer la capacité de transmission aéroportée pour les souches de SDRPV-1 qui est pour le moment seulement suspectée. Si cette transmission aérienne est avérée, elle pourra être prise en compte dans les mesures de prévention et de contrôle du SDRPV mise en place sur le terrain. Par ailleurs, l’évaluation d’un système d’assainissement de l’air par fitration pourrait permettre, s’il donne des résultats satisfaisants, de proposer une solution pour prévenir la transmission aéroportée de ce virus.

Procédures

Les animaux des groupes inoculés (n total = 30) recevront à J0 par voie intranasale du virus du SDRP ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Ces animaux seront soumis à un total de 11 prises de sang et 8 écouvillonnages nasaux sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes. Les animaux sentinelles (n total = 54) seront soumis à 11 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes. Les animaux contrôle (n = 6) seront soumis à 3 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes.

Impact sur les animaux

- Lors des inoculations intranasales de virus, les animaux subiront un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. - Suite à l’infection par le virus SDRPV de faible virulence, les animaux développeront une maladie d’intensité légère (fièvre modérée, légère diminution d’activité) qui durera 2 à 3 jours - Suite à l’infection par le virus SDRPV de virulence modérée, les animaux développeront une maladie d’intensité modérée (fièvre, apathie, baisse d’appétit, troubles respiratoires modérés) qui durera 3 à 5 jours - Lors des prélèvements (prise de sang et/ou écouvillons nasaux), les animaux subiront : + un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. + une douleur liée au prélèvement. Cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection des différentes souches de SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro ou bien ex vivo pour le virus du SDRP. Cependant ces modèles ne permettent pas de recréer le processus d’infection tel qu’il se produit à l’échelle de l’animal. Par ailleurs ces modèles ne permettent pas non plus d’évaluer la transmission du virus. Ainsi le recours au modèle animal est-il indispensable. Dans la mesure où seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le SDRPV, le modèle porc reste obligatoire.

Réduction

Tous les lots comporteront 6 animaux chacun de façon à avoir une puissance statistique suffisante. Pour l’étude de transmission directe ou indirecte, le nombre de 6 animaux sentinelles permet d’estimer les taux de transmission avec une précision satisfaisante.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation). Afin de limiter les contraintes liées aux prélèvements, les écouvillons nasaux seront stoppés à partir de J21 puisqu’après cette date notre expérience montre que le génome du SDRPV n’est plus détecté dans ces prélèvements. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du SDRPV. Le virus étant spécifique de cette espèce, il n’est pas possible d’utiliser un autre modèle animal. En effet il n’existe pas d’autre modèle animal (ex : modèle murin) sur lequel le virus du SDRP a été adapté A 3 semaines d’âge, les animaux seront sevrés et transférés dans nos installations. Ils seront inoculés à 6 semaines d’âge. Cet âge correspond à la période de post-sevrage, à un moment transitoire où le système immunitaire devient mature, période propice aux infections SDRPV.

Cinq injections quotidiennes pour déclencher des polypes intestinaux, puis pour d'autres lots une greffe de polype sous la peau ou une injection de cellules tumorales dans le rectum irrité ou le cæcum : 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce des mises à mort avant l'apparition de gros polypes susceptibles d'altérer la santé, tout en reconnaissant que ces polypes peuvent provoquer un mal-être plus tôt que prévu. Il affirme par ailleurs que ces deux lignées transgéniques ne développeront jamais de cancer, alors que le projet vise à repérer les polypes capables de se transformer en cancer et de métastaser au foie. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs intestinales, et immédiatement si un point limite est atteint.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser de façon très approfondie l'hétérogénéité des polypes (tumeur benigne) intestinaux pré-cancéreux afin d'identifier des marqueurs de prédiction de leur progression ou non en cancer. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris qui développent spontanément des polypes dans l'intestin. Ces modèles sont très pertinents pour la bonne réalisation de notre projet grâce ils représentent très bien ce qu'il se passe chez l'homme. Dans un premier temps, nous caractériserons les différences entre les polypes selon leur localisation et leur taille. Certains polypes seront utilisés pour l'étude de l'expression de gènes, d'autres seront utilisés pour la caractérisation de la présence de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de fibroblastes et de cellules immunitaires. Dans un deuxième temps, nous identifierons le profil de facteurs protéiques produits localement par ces polypes ainsi que ceux libérés dans la circulation sanguine. Puis, nous avons pour objectif d'identifier quels sont les polypes qui ont la capacité à se transformer en cancer et à migrer dans d'autres organes vitaux tels que le foie, site préférentiel de métastases dans le cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Grâce à la caractérisation approfondie de l’hétérogénéité des polypes intestinaux avec l’identification de signatures géniques, l’infiltration inflammatoire et de facteurs protéiques solubles locaux mais aussi dans la circulation, nous espérons identifier un ou des marqueurs sanguins spécifiques qui permettront de distinguer les polypes qui ont ou non le potentiel de se transformer en cancer. Ce projet est très pertinent en cancérologie puisqu’à l’heure actuelle, il n’y a pas de marqueurs sanguins spécifiques qui permettent de différencier les polypes à faible risque de ceux à haut risque de progresser en cancer du côlon. Si nous arrivons à mettre en évidence un ou des marqueurs sanguins qui permettent de savoir si le patient est en train de développer un adénome qui a le potentiel de se transformer en cancer, cela permettra d’éviter des coloscopies de dépistage inutiles et sûrement une compliance plus importante grâce à ce test de dépistage sanguin, pas seulement par rapport à la coloscopie mais aussi par rapport au dépistage Hemocult. D’après la littérature et les cliniciens, il y a un réel besoin de trouver une méthode alternative de dépistage précoce qui sera rapide, non invasive, peu couteuse et qui pourra être utilisée sur une plus grande population, pour dépister un adénome douteux même chez des patients asymptomatiques.

Procédures

Les animaux trangéniques (nous utilisons 2 modèles différents, 330 animaux au total) vont recevoir des injections d'une molécule à des doses non toxiques afin d'induire le développement de polypes spécifiquement dans l'intestin (durée de l'injection par animal : 10 sec). Les animaux recevront 5 injections au total, 1 par jour pendant les 5 premiers jours. Afin de déterminer le potentiel des polypes à se transformer en cancer et à former des métastases, les souris contrôles vont être soumis à des procédures chirurgicales de quatre types différents : Injection sous la peau de cellules issues de polypes (50 souris, chirurgie de 10-15min), greffe sous la peau d'un polype entier (50 souris, chirurgie de 10-15min), injection de cellules issues de polypes dans le rectum" irrité" (100 souris, chirurgie de 10-15min) et finalement injection de cellules de polypes dans le cecum (100 souris, chirurgie de 10-15min) (25-30min).

Impact sur les animaux

Le développement de polypes dans l'intestin sera induit chez les souris transgéniques qui seront euthanasiées avant que les souris ne commencent à développer de gros polypes qui peuvent vraiment altérer la santé de l'animal. Mais la présence de ces polypes dans l'intestin peuvent induire chez certains animaux un mal être plus tôt que prévu. La molécule aux doses utilisées n'est pas toxique pour les animaux mais son injection va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les injections de cellules de polypes en sous-cutanée va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les autres nuisances proviendront des actes chirurgicaux : des douleurs pré et post-chirurgicales. Si les cellules de polypes poussent et se transforme en masse ou tumeur, cela peut induire de la douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour effectuer les prélèvements nécessaires au projet tels que les tumeurs intestinales. Si un des points limites est observé avant le temps suggéré pour chaque procédure, l'animal sera immédiatement euthanasié. Une grille de scoring pour chaque procédure sera mise en place.

Remplacement

L'utilisation des modèles murins de tumorigenèse intestinale précoce tels que les modèles décrits dans ce projet, est le seul moyen pour répondre au mieux aux questions posées dans ce projet. Il n'existe pas aujourd'hui de modèle in vitro pouvant récapituler l'hétérogénéité et la complexité des adénomes.

Réduction

Le nombre de souris que nous devons inclure dans nos expériences a été calculé rigoureusement pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée. Pour le projet, nous avons besoin de prélever plusieurs adénomes sur la même souris, des adénomes de tailles différentes et surtout à des localisations différentes dans l'intestin dans les 2 modèles animaux transgéniques. Parfois certaines souris développent moins d'adénomes que d'autres ou sont localisées à un certain endroit de l'intestin et moins dans les autres. Pour l'étude de la progression tumorale, nous avons des mises au point à faire pour déterminer quel modèle sera le plus adapté pour étudier la progression tumorale (injection de cellules ou greffe d'adénome en sous-cutanée) et métastatique (caecale ou rectale). Cependant, si nous voyons qu'une procédure fonctionne et est appropriée pour répondre à notre question pour le projet, nous arrêterons les autres procédures et n'utiliserons pas toutes les souris demandées. De plus, pour ce projet, nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.

Raffinement

En plus des bonnes conditions d'hebergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie agée sera rajoutée dans la cage. Une grille de scoring avec des points limites adaptés à chaque procédure sera utilisée pour éviter des douleurs inutiles aux animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques (locaux et sous-cutané) en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

Notre projet utilisera deux modèles de souris transgéniques car il sont les plus pertinents pour répondre à nos questions. Dans ces 2 modèles de souris, les animaux vont développer des polypes spécifiquement dans l'intestin et ne développeront jamais en cancer. C'est pour cela que nous avons choisi ces 2 modèles qui sont très proches de ce qu'il se passe chez l'homme pour essayer de déterminer un ou des marqueurs de prognostique de risque à développer un cancer. Les animaux recevront la molécule pour induire les polypes à 8 semaines (quand l'intestin est mature) et seront ensuite utilisées pour le projet 5 mois après l'administration du produit. Concernant les chirurgies, les souris contrôles seront utilisées entre 6 et 8 semaines.

260 souris vont être utilisées, chacune passant onze échographies cardiaques sous anesthésie entre deux et sept mois, et 120 d'entre elles recevant en plus 75 gavages, un tous les deux jours pendant cinq mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à sept mois, le cœur prélevé lors d'une chirurgie terminale. La lignée utilisée développe à partir de quatre mois une cardiomyopathie dilatée qui évolue en insuffisance cardiaque, avec une cyphose, environ 20 % de perte de poids et une espérance de vie réduite. Le porteur écrit que la complémentation alimentaire testée "ne provoque aucune nuisance" et devrait plutôt être bénéfique, sur des animaux dont la maladie est justement ce qui les rend utiles.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre la contribution d’une voie de signalisation moléculaire à la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) et d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques. La CMD se caractérise par une dilatation du ventricule gauche, une réduction de la fonction systolique possiblement associée des arythmies. Malgré l'efficacité des traitements classiques de l'insuffisance cardiaque, la CMD présente un taux élevé d'hospitalisations qui impose une charge financière aux systèmes de santé, liée à l’implantation de stimulateurs cardiaques et/ou des procédures de transplantation. Il est donc nécessaire de poursuivre l’étude des mécanismes physiopathologiques pour identifier des cibles thérapeutiques actionnables afin d’arrêter ou inverser le cours de cette maladie cardiaque. Plusieurs études ont montrées que la modulation la voie de signalisation moléculaire étudiée à l’aide de petites molécules présentent un intérêt croissant pour le traitement de la CMD. Si un nombre important de ces études expliquent les effets bénéfiques par l’activation de voies cellulaires connues, peu d'entre elles ont exploré l'impact de cette voie de signalisation dans la CMD. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure cette voie de signalisation moléculaire étudiée joue joue un rôle dans le développement de la CMD. Nous proposons d’identifier l’ensemble des protéines impliquées dans cette voie de signalisation dans le cœur d’un model murin de CDM, d’identifier les protéines d’intérêt et d’étudier le rôle de ces protéines dans la CDM. Pour y parvenir, nous administrerons des molécules régulatrices de cette voie de signalisation par gavage ou injection intraveineuse. La fonction cardiaque des animaux sera évaluée en échographie. Apres traitement nous procèderons à l’analyse protéomique, biochimique et moléculaire des cœurs extrait des animaux traités.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette étude est de mettre en évidence un nouveau mécanisme de signalisation moléculaire impliqué dans le développement de la cardiomyopathie dilatée. L’identification de ce nouveau mécanisme ouvrira la voix à de nouvelles perspectives thérapeutiques qui seront étudiées à la suite de ce projet. La cardiomyopathie dilatée à une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la CMD proviennent d’insuffisance cardiaque (70 pourcent) et d’arythmies (30 pourcent). Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc d’un intérêt majeur en matière de politique de santé publique.

Procédures

Evaluation de la fonction cardiaque en échographie. 260 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tout les quinze jours sur animal anesthésié. Soit 11 échographies par animal. Chaque échographie dure environ 5 minutes. Traitement par gavage. 120 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tous les deux jours sur animal vigil. Soit 75 gavages par animal. Chaque gavage dure environ 30 secondes. Injection intra péritonéales. 164 animaux à l’âge de 7 mois sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Injection intraveineuse. 160 animaux, une fois à l’âge de 3-5 jours sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie: 164 animaux à l’âge de 7 mois. Soit une fois par animal. Une chirugie dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable qui débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois. Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Le régime alimentaire des animaux sera complémenté par un composé impliqué dans la voie de signalisation moléculaire d’intérêt. Cette complémentation ne provoque aucune nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux à long terme et devrait plutôt avoir un effet bénéfique. Toutefois, la méthode de délivrance par gavage peut générer un stress et une légère irritation au niveau de l’œsophage. Les injections nécessaires à ce projet peuvent générées un stress et une légère douleur lors de l’injection intraveineuse et en post injection pendant quelques jours.

Devenir

L'ensemble des animaux (260) sera euthanasié pour prélèvements d'organes. Le prélèvement des organes et notamment le cœur est indispensable pour effectuer les analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique abordée dans ce projet.

Remplacement

Les cardiomyocytes adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Les cardiomyocytes adultes se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires derivée de cellules souches, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. La lignée mutée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux sauvages seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Le fait d'injecter les virus chez des souriceaux entre 3 et 5 jours de vie nous permettra d'exploiter toutes les naissances, quel que soit le jour de la semaine où elles surviennent du fait des accouplements continus (pas d'injection le week-end) et ne pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Au total nous utiliserons 260 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Les points limites seront évalués régulièrement. Si un animal dépasse ces points limites, il sera euthanasié. Afin de prévenir au maximum l’irritation liée au gavage, nous utilisons des sondes de gavage en plastique souple dont la longueur et le diamètre sont adaptés à la morphologie de l’animale. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous privilégierons les injecterons par voie systémique afin d’éviter une chirurgie cardiaque lourde. Dans le but de limiter au maximum le nombre de manipulations réalisées sur les souriceaux, leur stress ainsi que celui de leur mère pour favoriser leur survie, nous identifierons par tatouage les souriceaux injectés. Pendant tout le temps que durera l'injection d'une portée, les souriceaux seront séparés de leur mère et gardés ensemble dans un peu de litière provenant de leur cage, puis ils seront rendus ensemble à leur mère en les déposant hors du nid. Nous vérifierons qu'ils sont bien repris en charge par la mère et ramenés au nid. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives. Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place pour tous les animaux impliqués dans la procédure de chirurgie sans réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant la mutation d'intérêt responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire de cardiomyocyte dérivés de cellules souches, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris à différents stade de la progression de la pathologie étudiée (3, 5, et 7 mois) afin d’avoir une analyse complète du phénomène. De plus nous utiliserons des souriceaux pour l’injection de molécules d’intérêts. Cela présente l’avantage de diffuser ces molécules à l’ensemble des organes de l’animal, de limiter la réponse immunitaire et d’éviter un acte chirurgical lourd dans le cas de l’utilisation d’animaux plus âgés.

Mesurer la valeur nutritionnelle de matières premières pour trois sociétés clientes fabricantes d'aliments : 210 coqs adultes vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 42 par an, renouvelés chaque année. Ils sont enfermés en cages individuelles pour que la totalité de leur ingéré soit contrôlée et la totalité de leurs fientes collectée sur des plateaux, les nuisances attendues étant des modifications de consistance des fientes et des régurgitations. En fin d'essai, certains partent chez des particuliers pour finir en basse-cour, les autres à l'abattoir, le taux d'adoption variant selon les années. Le porteur qualifie ce dispositif d'"indispensable" pour mettre à jour les tables d'alimentation qui servent aux fabricants d'aliments français et étrangers.

Objectifs

L'objectif du projet consiste à pouvoir mesurer la valeur nutritionnelle des matières premières destinées à l'alimentation animale. En connaissant plus précisément les valeurs nutritionnelles des matières premières, cela permet aux experts de la nutrition animale de mieux répondre aux besoins physiologiques des animaux d'élevage, de mieux utiliser les matières premières disponibles sur le marché. Ainsi, nous optimisons les aliments qui nourrissent plusieurs millions de volailles chaque année en France et dans le monde au travers de nos clients fabricants d’aliments. Si une matière première est mal évaluée nutritionnellement, elle sera mal valorisée par l’animal : il faudra plus d’aliment pour le nourrir, les rejets dans les fèces seront plus importants, ce qui augmente l’impact sur l’environnement. L’animal peut même être malade car il digèrera mal ce qu’on lui donne à manger. Pour formuler les aliments, les nutritionnistes utilisent des tables d’alimentation et des matrices qui caractérisent les matières premières utilisées. Pour une formulation de précision, il est indispensable de mettre à jour régulièrement cette matrice car elle doit prendre en compte les variabilités annuelles des matières premières, les nouvelles origines, les nouveaux co-produits industriels. Si ce travail n’est pas réalisé, la table d’alimentation sera vite périmée et la formulation sera mal réalisée avec les conséquences précisées ci-avant.

Bénéfices attendus

Ce dispositif est indispensable pour mesurer des digestibilités et ainsi évaluer les matières premières : cela permettra ensuite de compléter des tables de valeurs qui permettent de formuler les aliments des volailles d'élevage (aliments qui correspondront mieux aux besoins de l'animal). C’est le seul dispositif qui permet de maîtriser les consommations individuelles et de réaliser une collecte totale des fientes. Concrètement, afin de mesurer la digestibilité des matières premières, nous contrôlons l’ingéré alimentaire, nous récupérons l’excrété et par différence, nous mesurons les nutriments absorbés par l’animal. Les chercheurs réalisent une veille en permanence pour savoir ce qui est fait ailleurs dans le domaine public. Tous nos travaux sont réalisés pour 3 sociétés différentes et concurrentes sur le marché, ce qui permet de mutualiser certains savoirs (et de ne pas démultiplier les essais). De plus, nous collaborons avec d'autres instituts de recherche. Ainsi, certains de nos travaux sont intégrés dans des tables de composition et de valeur nutritive des matières premières destinées aux animaux d’élevage, qui servent à tous les fabricants d’aliment français voire étrangers.

Procédures

Les coqs sont peu sollicités, il n'y a pas de prélèvements sur animaux ou de procédures chirurgicales de réaliser. Les coqs sont d'abord placés dans les cages et entrent en phase d'adaptation (pendant laquelle aucune mesure n'est réalisée); afin que les coqs s'adaptent à leur nouvel environnement et à leur nouvel animalier. Les animaliers passent plusieurs fois par jour pendant les périodes de mesures pour collecter les fientes sur des plateaux sous les cages ou mesurer la consommation d'aliment dans les mangeoires, ce qui ne nécessitent pas de contact direct avec les animaux.

Impact sur les animaux

En fonction des matières premières testées, les nuisances attendues peuvent être des modifications de consistance de fientes ou des régurgitations.

Devenir

Soit les animaux poursuivent leur vie chez des particuliers (qui les élèvent ensuite dans leur basse-cour) soit ils sont envoyés en abattoir dans des conditions identiques à des volailles élevées sur le terrain et donc conformes aux standards d'élevage de l'espèce. Le taux d'adoption dépend des années. Les coqs sont remplacés une fois par an.

Remplacement

Les évaluations de ces matières premières à partir d’analyses chimiques restent problématiques et les techniques in vitro utilisant des préparations enzymatiques sont encore délicates à mettre en œuvre. De plus, elles demeurent imprécises quand on cumule l’incertitude des modèles de prédiction à celle associée à la variabilité analytique. L'objectif de ce projet est d'évaluer des matières premières pour les utiliser dans l'alimentation animale (notamment en volailles), c'est pourquoi il est nécessaire de faire appel à des oiseaux. Nous utilisons des coqs adultes pour effectuer les mesures sur un animal en entretien et ne pas avoir le biais des animaux en croissance. Cela permet de mesurer une énergie métabolisable à bilan azoté nul (ni gain, ni perte de poids).

Réduction

La méthodologie utilisée s’appuie sur la publication d'une méthode européenne qui fait référence en la matière dans le domaine. Cette méthode de référence permet de déterminer l’énergie métabolisable des matières premières sur des coqs adultes. Il s’agit d’une méthode de référence qui détermine l’énergie métabolisable des matières premières sur des coqs adultes. Pour ce faire, nous récoltons la totalité des excrétas (fèces et urine grâce à des plateaux sous les modules) pour récupérer la totalité de la fraction non digérée correspondant à la totalité de l’ingéré alimentaire que nous avons mesuré en parallèle. Nous mesurons ainsi l’énergie disponible pour le métabolisme (entretien et production) de l’animal. Compte tenu de la variabilité animale, environnementale et de la précision que nous recherchons pour le calcul des valeurs nutritionnelles, 8 coqs /régime sont nécessaires. 42 coqs / an x 5 ans = 210 coqs. Les coqs sont renouvelés chaque année. Pour chaque essai, nous testons 5 régimes alimentaires, 1 régime correspondant à une 1 matière première testée. 1 régime = 8 coqs, soit 40 coqs en tout. Nous avons 42 coqs en tout de façon à avoir 2 coqs de remplacement en cas de besoin. En effet, en fonction des points limites (tableau ci-après), un coq peut être retiré d’un essai. Ce nombre a été calculé afin de pouvoir observer des différences significatives (pour une valeur de probabilité de 5%, soit une chance sur 20 que notre hypothèse soit fausse) sur la digestibilité entre les groupes. Ce nombre a été déterminé par un test statistique de puissance de notre dispositif expérimental (avec calcul de la ppds = plus petite différence significative que le dispositif permet de détecter entre les groupes).

Raffinement

Au minimum, deux fois par jour le comportement (Chant, position, attitude, boiterie) est observé. A chaque début d’essai ces critères sont évalués en suivant la grille de notation présente en annexe. -Si la note cumulée est >= à 3, on retire l'animal de l'essai : distribution d’un aliment standard (entretien) et on installe un repose patte plastique disposé dans la cage si présence de boiterie (ce que nous n’avons jamais vu mais si cela devait arriver, voici la mesure qui serait prise), -si la note est >= à 6, l'animal est euthanasié.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible (mesures de digestibilité de matières premières destinées à l'alimentation animale et notamment des volailles). Nous utilisons des coqs adultes pour effectuer les mesures sur un animal en entretien et ne pas avoir le biais des animaux en croissance. Cela permet de mesurer une énergie métabolisable à bilan azoté nul (ni gain, ni perte de poids).

Deux chirurgies cérébrales à cinq jours d'intervalle, la première pour déclencher une épilepsie, la seconde pour reprogrammer les cellules gliales en neurones : sur 561 souris, 516 passent sur la table stéréotaxique et 378 y reviennent une seconde fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées entre trois jours et huit semaines après l'opération pour le prélèvement du cerveau. Les 327 souris transgéniques reçoivent en plus deux injections par jour pendant deux semaines pour déclencher l'expression de leur transgène, après une biopsie de la queue au sevrage. Le porteur écrit que l'état de mal épileptique qui suit la chirurgie "n'est pas douloureux", que les crises ultérieures ne le sont pas davantage et que les troubles de mémoire et l'anxiété observés n'induisent pas de douleur, tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée.

Objectifs

Le cerveau adulte est incapable de se régénérer, ce qui veut dire que les neurones détruits lors d’une pathologie sont définitivement perdus et les symptômes associés permanents. Dans de nombreuses pathologies, la mort des neurones est associée à la multiplication de cellules non neuronales, les cellules gliales ou glies, qui vont changer d’état et devenir réactives. Récemment, la reprogrammation cellulaire, qui consiste à transformer les cellules gliales en nouveaux neurones, a émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont déjà démontré qu’il était possible de reprogrammer différentes catégories de cellules gliales en nouveaux neurones en exprimant dans les glies des facteurs de reprogrammation. Plus spécifiquement, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales qui se multiplient dans les premiers temps de la pathologie peuvent être reprogrammées en nouveaux neurones, dits induits, capables de réduire de moitié les crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. Cependant, il reste encore beaucoup de choses à comprendre sur les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies en neurones. En particulier, le type de cellules gliales qui est reprogrammé avec succès reste à ce jour inconnu. Par ailleurs, il est important de comprendre si la multiplication et la réactivation de ces cellules gliales impacte leur capacité à être reprogrammées en neurones. Enfin, il est essentiel d’étudier les changements de l’expression des gènes des cellules gliales permettant l’expression progressive des gènes neuronaux durant la reprogrammation. Notamment le rôle spécifique d’acteurs épigénétiques, c'est-à-dire d’acteurs capables de contrôler l’expression des gènes, dans ce processus reste à être élucidé. Utilisant un modèle murin d’épilepsie, les objectifs du présent projet sont : 1) Déterminer quel type de cellules gliales peut être reprogrammé durant la phase de développement de l’épilepsie. 2) Comprendre comment les gènes des cellules gliales de départ et leur modification impacte la reprogrammation des glies en neurones. Ceci permettra d’identifier ce qui rend certaines glies reprogrammables. 3) Évaluer le rôle spécifique de deux acteurs épigénétiques dans la reprogrammation glie-neurone.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire, qui consiste à convertir les cellules gliales résidant au site de la lésion en neurones induits fonctionnels, permettait de réduire les crises dans un modèle murin d’épilepsie réfractaire aux médicaments. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique (ex: identification du type de glies reprogrammées, impact de la prolifération, rôle des facteurs épigénétiques). En nous permettant de comprendre les mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire des glies réactives proliférantes, ce projet donnera des pistes essentielles pour dépasser ces limites et envisager des thérapies cellulaires futures pour le traitement des épilepsies pharmacorésistantes. Par ailleurs, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire ouvrira la porte vers la généralisation de cette stratégie à d’autres pathologies où la prolifération gliale est limitée.

Procédures

Une partie du projet implique des animaux transgéniques (327 souris) pour lesquels il est nécessaire de déterminer le génotype. Une petite biopsie de queue est réalisée au sevrage afin de mesurer la présence des transgènes par PCR. Elle sera réalisée en moins d’1 min et sous anesthésie locale pour éviter toute douleur. Plusieurs injections d’un produit (2X/jour pendant 2 semaines) sont ensuite nécessaires pour déclencher l’expression du transgène chez ces animaux. Chaque injection est réalisée rapidement (

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une à deux chirurgies stéréotaxiques sous anesthésie générale complétée d’une analgésie locale. Il est nécessaire d’immobiliser l’animal en le prenant par la peau du dos pour injecter les produits anesthésiques et analgésiques. Cette immobilisation entraîne un léger inconfort et du stress pendant quelques secondes. La piqûre d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère très brève. Le traitement de la douleur post-opératoire s’effectue par plusieurs injections d’analgésiques. La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève. Dans les heures suivant la chirurgie visant à générer le modèle murin d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges de pointes sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Celui-ci est associé à un arrêt du comportement naturel et à la présence de stéréotypies. Cet état de mal n’est pas douloureux mais les animaux vont moins s’alimenter durant cette période, pouvant entraînant une perte de poids transitoire (48h). Une fois cette période passée, le comportement des animaux est normal malgré la survenue de crises d’épilepsie focales non convulsives dans l’hippocampe. Celles-ci sont non douloureuses mais s’accompagnent de l’arrêt de l’activité de l’animal. Par ailleurs, les animaux épileptiques présentent quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Ces légers troubles n’impactent pas le comportement général de l’animal, ni sa capacité à se déplacer et se nourrir. Ils n’induisent pas non plus de douleur. Le génotypage des souris transgéniques sera effectué par biopsie d’un petit morceau de queue sur animal vigile sous analgésie locale. Ceci nécessite l’immobilisation des animaux qui peut entraîner inconfort et stress. Ces animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’un produit permettant de déclencher l’expression du transgène (2X/j pendant 10j). La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules gliales de départ et celles en cours de reprogrammation et analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet consiste spécifiquement à étudier, dans le contexte de l’épilepsie, ce qui rend les glies qui se multiplient lors des phases précoces de la maladie particulièrement sensibles à la reprogrammation. De plus, l’environnement cérébral, dont la complexité ne peut pas être reproduite en culture, a un impact sur la reprogrammation glie-neurone. Ceci ne peut donc être étudié que dans le cerveau d’un animal rendu épileptique.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Pour déterminer les différences dans l’expression des gènes dans les cellules gliales de départ et au cours de la reprogrammation, nous effectuerons différentes techniques d’analyse sur les mêmes cellules, permettant ainsi de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ces expériences. Par ailleurs, ces expériences permettront de générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur postopératoire, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’analgésique. Une surveillance sera mise en place en postopératoire avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation clinique adaptée à notre étude. En cas de signes de douleur, les animaux recevront une analgésie supplémentaire. Les animaux pourront également se voir présenter de la nourriture liquide et supplémentée afin de faciliter leur récupération après l’opération. L’interruption des expériences pourra intervenir pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Raffinement des conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Cas des animaux transgéniques : Le déclenchement de l’expression du transgène pourra se faire par gavage oral (3X, tous les 2j) pour réduire l’inconfort des animaux si cela s’avère aussi efficace que les injections répétées.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer (1) les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies se multipliant dans la phase précoce de la maladie et (2) l’impact de la modulation de deux facteurs épigénétiques sur l’efficacité de reprogrammation glie-neurone dans le contexte de l’épilepsie. Ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections intracérébrales seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.