Procédures modérées

Quatre mesures de débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, six prélèvements de sang à la queue, six prélèvements d'urine, une irradiation du corps entier et une chirurgie de clampage de l'aorte rénale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est transportée entre deux établissements pendant le protocole. L'objet du projet est de comprendre le rôle d'une protéine, CD99, dans l'insuffisance rénale aiguë et chronique, repérée d'abord dans les urines de patients opérés du cœur. Les souris sont tuées à la fin de la procédure pour le prélèvement de leurs reins, ou avant si elles perdent plus de 25 % de leur poids ou restent prostrées au-delà de vingt-quatre heures.

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. CD99 est une protéine principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 endothéliales et immunitaires modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule sur deux EU (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes

Tuées à la fin de l'étude pour que leurs artères et la prothèse implantée soient examinées au microscope, 12 brebis adultes de cinq à huit ans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent quatre anesthésies générales, une chirurgie des carotides, quatre scanners avec produit de contraste et une échographie hebdomadaire pendant trois mois, entre deux établissements séparés par cinq heures de route. La liste des atteintes attendues comprend la douleur postopératoire, les infections, les risques hémorragiques ou thrombotiques et le stress du transport. Le porteur indique que le dispositif a déjà été testé sur simulateurs, et affirme que la complexité du système cardiovasculaire "impose" désormais l'essai sur un animal.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont le stress, la douleur, les infections, et les risques hémorragiques ou thrombotiques. Mise à jeun la veille le l'intervention (stress). Isolement des animaux pour l'induction de l'anesthésie (stress). Contention des animaux (stress) lors des manipulations, soins, traitement et échographies doppler réalisées sur animal vigile. Mise en place d'une perfusion veineuse (hématome, saignement, inconfort au passage de la peau) : douleur, infection, Intubation, mise sous respiration mécanique et anesthésie générale. Incision des zones opératoires, pose des prothèses artérielles, sutures au niveau des incisions : douleur, risque hémorragique, risque d'occlusion vasculaire en post opératoire. Injection de produit de contraste iodé lors des scanner (réaction allergique). Douleur post opératoire. Transport des animaux entre les établissements utilisateurs (stress).

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable sur des simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à 7 jours, 21 jours, et 4 mois après chirurgie par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste; et de 1 mois à 4 mois (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place d'une perfusion, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

Capturés à l'hameçon, anesthésiés, incisés pour l'implantation d'une marque acoustique dans l'abdomen puis suturés et marqués à l'extérieur, 150 loups et 100 daurades royales sont remis à l'eau sur leur lieu de capture. La procédure entière dure moins de dix minutes et relève d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend un stress de capture et d'éventuelles blessures dues à l'engin de pêche ou à la manipulation, sans autre effet indésirable après l'incision. Le choix de ces deux espèces tient à leur valeur commerciale et à l'importance de leur exploitation par les pêcheries, l'étude visant à mieux caler les mesures de gestion de la ressource.

Objectifs

De nombreux aspects du cycle de vie de la daurade royale (Sparus aurata) et du loup (Dicentrarchus labrax) sont aujourd'hui inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires de ces ressources halieutiques. Il est donc nécessaire de mieux connaitre les éléments relatifs à la reproduction de ces deux espèces sauvages dans leur zone de gestion respective, espèces fortement exploitées par les pêcheries artisanales locales et dont le niveau d’exploitation actuel est inconnu du fait, entre autres, du manque de données sur leur écologie spatiale et le mélange des populations. L'objectif du projet est de mieux comprendre les relations entre zones d'alimentation et sites de reproduction, par une approche de marquage par télémétrie acoustique, et ainsi de mieux comprendre la dynamique spatio-temporelle reproductive des daurades royales (Sparus aurata) et des loups (Dicentrarchus Labrax) dans leur milieu naturel.

Bénéfices attendus

Grâce à l’important réseau d’écoute régional en place, l’analyse spatiale des déplacements des indivdius marqués sur la durée de vie de la balises (>2.5 ans) ou jusqu’à la capture de l’individu permettra de confirmer les zones et périodes de reproduction et d'alimentation de ces espèces, leur niveau de fidélité d'une année sur l'autre et la dynamique spatiale qu'il existe entre aires marines sous gestion, et zones hors gestion. Les résultats seront directement exploités par les gestionnaires pour adapter leurs mesures de gestion afin d'optimiser la préservation de ces ressources aujourd'hui fortement exploitées.

Procédures

L'ensemble des individus sera soumis à une phase de capture par un hameçon, puis anesthésié avant une phase d'implantation par chirurgie d'une marque acoustique et d'une marque externe pour son identification ultérieure. L'ensemble de la procédure dure moins de 10 mn.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de la capture sont essentiellement du stress lié à la capture, et des blessures éventuelles liées à l’engin de pêche ou à la manipulation entre l’engin et les bacs de confinements. Des mesures préventives de raffinement sont prises pour limiter le stress et le risque de blessure La nuisance attendue lors du marquage externe est équivalente à la piqûre d’une aiguille. Le marquage intracorporel implique une incision suturée suite à laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables compte tenu du protocole mis en place.

Devenir

L'ensemble des animaux seront relachés dans leur milieu naturel, sur leur lieu de capture initial

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces deux espèces dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.

Réduction

Il est toujours difficile dans ces études en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaire pour capturer la variabilité de l’utilisation de l’espace pour une population. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernée et des modèles utilisés. Sur la base d’études sur l’effet de l’échantillonnage sur la qualité des résultats, le nombre d'individus testés dans les différents lots et procédures est minimal compte tenu de la dispersion de ces espèces, leur nombre en milieu naturel et la nécessité de capturer la majorité de la variabilité du comportement de cette espèce dans cette phase migratoire. Pour le loup (Dicentrarchus labrax), 50 individus seront ciblés sur 3 sites distincts (2 sites de reproduction, 1 site d’alimentation) soit un total de 150 individus. Pour la daurade (Sparus aurata), 50 individus seront ciblés sur 2 sites distincts (1 site de reproduction, 1 site d’alimentation) soit un total de 100 individus.

Raffinement

L’ensemble des étapes du projet est mis en œuvre de sorte à limiter les nuisances : la capture est réalisée avec des hameçons ou des leurres de forme ou de taille à limiter les blessures et éviter l’ingestion par le poisson, des épuisettes en silicone limitent l’abrasion du poisson à sa sortie de l’eau associée à une manipulation minimale des individus; le marquage est réalisé sous anesthésie générale, un bullage dans le bac de réveil permet une bonne récupération du poisson avant d’être relâché en douceur sans exondation. L'ensemble du protocole, de l'endormissement au réveil dure moins de 10 minutes.

Choix des espèces

Ces 2 espèces sont des espèces côtières de premier plan, tant pour l'importance de leur exploitation, leur valeur commerciale et leur aquaculture, que pour ses aspects d'espèces emblématiques. Elles sont aujourd'hui concernées par des plans de gestion des petits métiers de pêche en mer, mais de nombreux aspects de leur cycle de vie restent pourtant inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires de cette ressource. L’acquisition de connaissance sur leur dynamique spatiale est une première étape primordiale pour améliorer les mesures de gestion de ces ressources. L'objectif étant de comprendre les liens existants entre site d'alimentation et zone de reproduction, les animaux capturés seront des individius adultes.

Pour mesurer les effets d'un mélange de polluants issus de l'usure des pneus et des chaussées, 1 664 ombles chevaliers aux premiers stades de vie vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les larves sont exposées vingt-quatre heures par bain à du benzo[a]pyrène et à une molécule issue des pneus, à des doses relevées dans les bassins versants alpins, puis filmées dix minutes par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur attend jusqu'à 10 % de mortalité liée à la hausse de température, et rappelle qu'une étude antérieure avait relevé 14 % de malformations de la colonne vertébrale et du sac vitellin. Les individus malformés sont tués par surdose d'anesthésiant, les autres à la fin de l'expérience, poursuivre au-delà des stades étudiés étant jugé "inutile".

Objectifs

Les grands lacs de la région alpine, comme de nombreux écosystèmes aquatiques, sont impactés par des micro-plastiques dont la majorité serait issue de l’usure des pneus et des chaussées . L’impact sur les organismes aquatiques de ces micro-plastiques spécifiques est encore mal connu même si des études ont récemment révélé la toxicité de certains constituants chimiques sur des espèces piscicoles . Cette molécule a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho. Néanmoins, le mode d'action précis de cette molécule est toutefois encore inconnu, même s’il semble être lié à une entrainer des modifications de comportement. Ainsi, avec notre étude actuelle, menée sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier contaminés à des doses environnementales a mis en évidence une augmentation du nombre de malformations. Pour aller plus loin dans la compréhension des atteintes de cette molécule nous proposons d’explorer les effets d’un mélange de molécules issues de l’usure des pneus et des chaussées. Ainsi, nous allons combinées cette molécule avec une molécule d’hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAPs). Ces dernières proviennent essentiellement des revêtements de chaussée et des fumées d’échappement des moteurs thermiques. En raison de leur structure chimique, les HAP sont des composés hydrophobes, ce qui explique sa distribution dans les sols et les sédiments. Ces polluants sont fortement présents dans le bassin Rhône Alpes Méditerranée Corse. Ainsi, le projet se propose d’étudier un cocktail issu de deux molécules, l’une émergente et l’une connue comme toxique et marqueur d’anthropisation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à amener des connaissances sur les effets à doses environnementales d’un polluant historique marquer d’anthropisation : le BaP et d’une molécule émergente dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogène et juvénile . Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 1h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac du au transfert de animaux entre les aquariums. Les animaux seront soumis par balnéation durant 24h a une contamination au BenzoApyrene (BaP) qui est un hydrocarbure à une dose de 0.1ng/l ainsi qu'à la molécule 2-((4-Methylpentan-2-yl)amino)-5-(phenylamino)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione qui est une molécule récement découvete (6 PPD-Q) soit à 1.5 µg/L ou à 3µg/L. Ces doses correspondent à des doses environemantales retrouvées dans nos bassins versants.

Impact sur les animaux

Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Si nous nous basons sur notre précédent projet testant la toxicité de la molécule 2-((4-Methylpentan-2-yl)amino)-5-(phenylamino)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione (6 PPD-Q) réalisée au stade embryo- larvaire sur les larves d’omble chevalier , nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité, par sécurité nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison du couplage de cette molécule au BaP. La précédente étude menée sur des ombles chevalier de même age contaminés avec une solution de (6PPD-Q) à 3µg/L et incubés à 8.5°c montre une augmentations des malformations de la colonne vertébrale et du sac vitellin de 14%. Si de tels malformations se produisent les individus seront mis à mort par surdose d'anesthésiant.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis

Remplacement

Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré (différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...).

Réduction

L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude.

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends. De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience . Des points limites assez prédictifs seront établis afin de palier à toutes souffrances, mal être et stress des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD- Q couplé au BaP durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique. Les premiers stades de vie sont ciblés pour cette étude en raisons de : -Leur immaturité homéostatique , ainsi leur systéme de détoxification n'est pas mature et ils n'auraient pas la capacité de se défendre ou de facon optimale contre le stress. -Les premiers stades de vie sont un maillon clé pour le recrutement de la population

930 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections en dix jours puis deux par semaine pendant dix semaines, avec un prélèvement de sang au coin de l'œil sous anesthésie chaque semaine du traitement. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, pour l'analyse de leur système immunitaire et de leurs organes. La plupart développent spontanément un lupus, avec des atteintes rénales possibles dans les formes avancées, un autre groupe recevant une injection d'huile pour déclencher la maladie. Le porteur indique que le nombre d'animaux nécessaire à la puissance statistique est de dix par groupe, sans expliquer comment il parvient à 930.

Objectifs

Pour qu'un cancer puisse se dévelloper les cellules tumorales doivent produire des composés inhibant le système immunitaire. Partant de ce constat notre équipe a réussi à isoler, à partir de secretion de cellule tumorale, des composés ayant des capacités inhibitrice de l'immunité et permettre de trouver de nouveau outils thérapeutiques dans les maladies caractérisé par un excés d'activation de l'immunité contre son hote, les maladies auto-immune. Un composé a démontré une efficacité particulierement efficace dans des systèmes simplifié de l'immunité notamment sur les lymphocytes B. Le but de se projet et de montrer l'efficacité de cette molécule dans des modèles plus complet récapitulant toute la complexité du système immun. Afin de mieux comprendre les mécanismes d'actions de ce composé les souris seront vacciné contre différentes substance, le but étant d'induire différent type de réponse vaccinal et voir quelles types de cellules sont impactés par ce composé et comment est modulé la réponse vaccinale. Du fait de son potentiel sur les lymphocytes B nous allons nous concentré sur le lupus qui est une maladie auto-immune ou l'implication des lymphocytes B n'est plus a démontré. Le lupus étant une maladie complexe dépendant d'énormément de facteur nous allons utilisé différent modèle murins de lupus permettant de modéliser different aspect de la maladie et essayer de les traiter avec notre composé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront d’une part de comprendre les mécanismes par lesquelles les cellules tumorales peuvent inhiber le système immunitaire et proliférer et potentiellement développer de nouvelle thérapeutique afin de lever cette inhibition. D'autre part la description des ces mécanismes permettront de dévellopé de nouveaux outils thérapeutiques pour pathologies avec un excès d'activation du système immunitaire tel que les pathologies auto-immunes. En effet les thérapies actuellement disponibles, non spécifiques ou spécifiques du lymphocytes B vont engendrer de sérieux effets secondaires mais ont aussi un coût socio-économique non négligeable. Il y a donc une nécessité à développer de nouvelles voies thérapeutique à cibler.

Procédures

L'injection dans le ventre, dite intra-péritonéal est un moyen efficace pour diffuser un produit dans le système de la souris en n'entrainant quasiment pas d'incomfort et peut donc être effectué sur souris vigile. C'est cette voie qui est prévilégié pour toutes les injections dans nos différentes expériences. Pour la partie vaccination, les souris seront injecté 1 fois avec le vaccin et traité avec 5 injections pendant 10 jours. La majorité des souris vont dévellopé spontanément un lupus, cependant l'un des modèles va nécessiter une fois l'injection d'une huile pour induire un lupus. Les souris seront traité par notre composé par 5 injections pendant 10 jours puis 2 fois par semaines pendant 10 semaines. De plus afin de suivre l'évolution de la maladie le sang des souris sera prélévé 1 fois par semaine pendant toutes la durée du traitement. Ce prélévement se faisant au niveau du sinus au coin de l'oeil et pouvant être désagréable pour les souris, ils seront effectué sur souris sous anethésie générale par des professionnels formés. De plus afin de limité toutes séquelles sur l'animal une altéranance d'oeil gauche-droite sera effectué.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent entraîner une legère douleur de courte durée. Les modèles murins de lupus vont modéliser différents aspects de la maladie avec des degrés de sévérité variables en fonction des modèles. Dans les cas les plus avancé de la pathologie les souris peuvent dévelloper des atteintes rénales. Les souris seront prélevées une fois par mois pour l'urine sur la souris vigile et pour le sang par prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale. Ce geste peut entraîner une legère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasié afin de permettre d'une part une analyse détaillé du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que l'activité de la maladie et les atteintes d'organes.

Remplacement

Des études préliminaires de culture cellulaire in vitro ont été mises en place afin de minimiser au maximum l’utilisation de souris. Cependant seuls des modèles in vivo permettront d’une part d’étudier l’effet de ces nouvelles thérapeutique sur un organisme complet. D’autre part seuls des modèles in vivo permette de récapituler la dérégulation d’un système immunitaire complet ainsi que le phénotype délétère des pathologies auto-immune et donc de pouvoir d'évaluer l’intérêts thérapeutiques de ces nouveaux outils.

Réduction

Les test statistiques approprié seront utilisé pour comparer les différents groupes. et le nombre d’animaux nécessaires pour avoir la puissance statistique necessaire est de 10. La cinétique des réponses immunitaires ainsi que les modèles murins de lupus présentent de la variabilité expérimentale, elles seront répétées pour renforcer l'approche statistique. Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux à utiliser afin de pouvoir conclure avec une confiance suffisante. Afin d’éviter tout biais expérimentaux les cohortes seront randomisées et afin d’éviter les effet cage les animaux d’une même cage recevront des traitements différents en fonction des groupes expérimentaux. De plus afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux tous les organes d’intérêt seront recueillis à chaque fois et utilisé ou congelé.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera prise en compte tout au long de la procédure expérimentale. Les souris seront hébergées dans des cages de 2L à 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu de type nids de woodwoll. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. De plus tout le long des procédure l’état générale des animaux sera évalué selon une grille de score objective permettant d’évaluer le stress et la détresse des animaux.

Choix des espèces

Les modèles murins de lupus sont les seuls disponibles permettant de récapituler certains aspects de la physiopathologie humaine. De plus, les modèles murins offrent le meilleur équilibre entre la capacité de produire des résultats satisfaisants et la susceptibilité à induire de la douleur, du stress ou des dommages durables. Les stades de développement ont été choisis afin de modéliser différents moments dans l'évolution de la maladie. Ainsi, dans certains cas, des souris jeunes seront utilisées afin de modéliser l'apparition de la pathologie, tandis que pour modéliser des états plus avancés de la pathologie, nous utiliserons des souris âgées.

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

Immunodéprimées pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de carcinome à cellules de Merkel leur sont injectées sous la peau, suivies d'une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quatre semaines, molécule testée ou solvant. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé lors des études précédentes. Toutes sont tuées à l'issue, la pesée finale des tumeurs imposant leur mise à mort.

Objectifs

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif avec une survie estimée à 50 ans de seulement 40%. Il survient principalement chez le sujet agé de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffes d'organe, infection par le VIH). Dans 80% des cas les CCM sont dit viro-positifs et sont dus à l'intégration du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCpV), les 20 % restants sont dis viro-négatifs et sont principalement dus aux expositions UV. Actuellement, au stade métastatique inopérable, une seule option thérapeutique efficace est disponible, l'Avelumab, mais des phénomènes de résistances primaires et acquises à ces traitements entrainent une réponse objective durable chez seulement 25% des patients, soulignant la necessité d'identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques dans ce domaine. Des méthylations abérrantes de l'ADN ont été démontré comme étant des modifications importantes et fréquemment retrouvées dans les cellules cancéreuses. Il a été démontré dans plusieurs types de cancers que l'utilisation de molécules hypométhylant l'ADN permettait de reprogrammer les cellules tumorales vers un état "normal", re sensibilisant ces cellules à la chimiothérapie et à l'immunothérapie. Par exemple, les premières générations d'agent hypométhylant l'ADN, tel que l'azacitabine et la decitabine sont utilisés en routine pour le traitement des leucémies myeloïdes. Une nouvelle molécule hypométhylante, la guadecitabine, est actuellement en essai clinique. Nos données préliminaires démontrent que cette molécule est capable in vitro de diminuer la prolifération cellulaire et la viabilité des CCM. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer in vivo l'efficacité anti tumorale de cette molécule sur les CCM.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d'évaluer l'efficacité anti tumorale d'un agent hypométhylant, la guadecitabine, dans l'indication Carcinome à cellules de Merkel. Actuellement, au stade métastatique inopérable, seul l'immunothérapie, Avelumab est efficace, mais l’utilisation de ce traitement, du fait des mécanismes de résistance innés ou acquis, ne permet d’obtenir une réponse objective durable que chez 25% des patients. La capacité à ré induire une expression des immunes check point, tel que PDL-1, cible de l'immunothérapie par l'Avelumab, sera également évaluée. Ainsi la guadecitabine pourra ensuite être évaluée en combinaison avec des inhibiteurs d'immune checkpoint (Avelumab) dans le cas du CCM.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés 1 fois par jour en intrapéritonéal avec la molécule ou le véhicule pendant 4 semaines. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutané et une contention quotidienne pour l'injection en intrapéritonéale. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intrapéritonéale. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Une sédation avec injection en intrapéritonéal d'acépromazine sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité de la guadécitabine a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de CCM. L'obtention de l'efficacité de la molécule sur ces différentes lignées et les données déjà publiées sur des molécules similaires de première génération dans l'indication des CCM, limitent le nombrer de souris à utiliser, en nous permettant de tester une dose unique de guadécitabine. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de l'efficacité de cette nouvelle molécule sur la réponse anti-tumorale et sur sa capacité à re sensibiliser les cellules à de l'immunothérapie. Ces éléments, essentiels pour la validation de l'utilisation de cette molécule dans l'indication CCM nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les injections en intrapéritonéales sont rapides et peu douloureuse, le geste technique est déjà maitrisé par les personnes qui manipuleront les souris. De plus, bien que les injections soient quotidiennes, elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d'engendrer des douleurs répétées au même point d'injection. Une friandise sera proposée aux souris après chaque injection en intrapéritonéal. Tout au long de l'étude, le bien être des animaux sera évalué à l'aide d'une grille de score, si les animaux atteignent les points limites définis antérieurement, ils seront sortis de l'étude afin de limiter toutes souffrances. De plus, pour éviter tout stress inutile, lors de la mise à mort un sédatif, sera injectée en intrapéritonéal avant l'euthanasie.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.

Procédures

Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.

Raffinement

permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.