Procédures modérées

Quatre anesthésies générales, deux incisions de dix centimètres au niveau des carotides, treize séances d'échographie doppler en contention et deux transports routiers de cinq heures entre établissements : 12 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le prélèvement des artères et de la prothèse sert à confirmer par histologie ce que les images ont montré. L'objet du projet est la validation d'un instrument chirurgical destiné aux pontages artériels périphériques pratiqués sur des patients âgés. Le choix de la brebis tient au diamètre de ses artères, stable avec l'âge, contrairement au porc qui atteindrait 300 kg et rendrait le suivi impossible.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28, après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable surdes simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à J7, J21, et M4 par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste, et de M1 à M4 (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

Écartées des projets de l'animalerie et jugées non replaçables, 260 souris de réforme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une biopsie de peau de 4 mm suivie de deux points de suture posés par un stagiaire, se réveille, puis est réutilisé le lendemain pour la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, cette fois sans réveil. Le porteur écrit que les gestes pratiqués par des personnes en formation "ne permettent pas de garantir un confort de vie aux animaux", ce qui justifie l'injection létale à la fin du cathétérisme. La formation est réglementaire, agréée par le ministère de l'Agriculture et obligatoire pour toute personne concevant ou réalisant des procédures chirurgicales.

Objectifs

La prise en compte du bien-être animal nécessite la sensibilisation, la formation et l’acquisition des compétences pour le personnel concevant ou appliquant des procédures expérimentales. L’acquisition de ces compétences est un prérequis et leur mise à jour et leur adéquation avec les besoins des projets scientifiques est obligatoire. Nous proposons une formation d'initiation à la chirurgie expérimentale qui est une formation réglementaire agréée par le ministère de l’Agriculture. Elle est obligatoire pour les personnes concevant des projets comprenant des procédures chirurgicales ou réalisant ces procédures. Le but de cette formation est d’acquérir des notions élémentaires et des gestes de base nécessaires à l’expérimentateur pour réaliser une procédure définie avec une prise en charge satisfaisante de l’anesthésie, de l’analgésie et du bien-être animal. Chaque session de formation comprend un enseignement théorique de 15h et un enseignement pratique de 10h30 dont 7h00 sur animal anesthésié et 3h30 sur matière inerte. Elle permet tout d'abord de mettre en évidence les contraintes liées au choix du matériel et à l’organisation du champ opératoire puis de faire acquérir au manipulateur les bonnes pratiques pour intervenir sur l’animal dans les étapes pré, per et post-opératoires. Le stagiaire est initié aux étapes et techniques chirurgicales en réalisant de manière encadrée et après entrainement sur matière inerte, une biopsie cutanée et la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire.

Bénéfices attendus

Etre sensibilisé et initié aux bonnes pratiques chirurgicales est essentiel, et obligatoire d'un point de vue réglementaire, pour concevoir ou mettre en oeuvre des actes de chirurgicaux. Cette initiation passe par une formation réalisée par des experts (vétérinaires et ingénieurs/techniciens compétents) et doit être complétée ensuite par un encadrement adapté pour la mise en oeuvre d'une procédure chirurgicale en particulier dans le cadre d'un projet autorisé. Cette formation n’a pas vocation à transformer les stagiaires en chirurgiens accomplis mais doit leur permettre d'acquérir les notions élémentaires et les gestes de base fondamentaux pour réaliser une procédure chirurgicale associée à une prise en charge per-opératoire satisfaisante.

Procédures

Les ateliers proposés dans cette formation sont l’anesthésie, l’analgésie, l'asepsie, les points de suture et une expérience chirurgicale simple : une biopsie cutanée de 4 mm2 ou "punch biopsie"avec réveil et suivi de l'animal. L'intervention chirurgicale dure environ 1/4h. La grande partie du temps de la procédure est consacrée à la préparation de l'animal (Anesthésie, tonte, désinfection, préparation du matériel). Le lendemain, la pose d'un cathéter à la veine jugulaire (temps chirurgical 1/2h-1h max) sous anesthésie générale et analgésie appropriée est réalisée sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension et contention d'un animal et une injection IP pour l'administration de l'anesthésie Les effets indésirables attendus sur les animaux sont légers et liés à la biopsie cutanée. Le choix des gestes mis en oeuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) et en minimisant l'impact pour les animaux. C'est pour cela qu'une biopsie cutanée est proposée (degré de contrainte léger attendu, pas d'ouverture de cavité abdominale ou thoracique) avec réveil des animaux puis le lendemain réalisation d'intervention, toujours sans ouverture de cavité, avec suivi de l'anesthésie et analgésie adaptée et sans réveil des animaux après pose du cathéter et suture cutanée. Les effets indésirables attendus sont donc très limités et pourraient correspondre à l'inconfort d'une éventuelle plaie cutanée de petite taille (4 mm de diamètre) si les 2 points de sutures réalisés par les stagiaires lâchaient dans les 12h suivant l'intervention. Le protocole anesthésie pour la mise en place du cathéter comporte un antalgique et la dose d'anesthésique est adaptée pour la durée de l'intervention attendue.

Devenir

Les interventions réalisées sur les animaux (biopsie cutanée et cathéterisme) par des personnels en formation ne permet pas de garantir un confort de vie aux animaux. Le choix d'administrer un euthanasique aux animaux encore anesthésié à la suite du cathétérisme de la veine jugulaire est donc fait pour éviter un inconfort post-chirurgical. De plus, les animaux utilisés dans cette formation sont des animaux de réforme de l'animalerie. C'est-a-dire ne pouvant pas être utilisés dans un projet ou replacés.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour la formation à la chirurgie expérimentale permet la mise en situation des participants afin de les former aux bonnes pratiques face à un animal et de gérer notamment le suivi post-opératoire. Au préalable, ils réaliseront les gestes chirurgicaux sur de la matière inerte. Sur l'animal les gestes réalisés avec réveil sont mineurs (biopsie de peau sur 1à 4mm2 et suture). Les gestes plus invasifs sont limités, effectués sous anesthésie générale et analgésie et sans réveil. Il n'y a pas ouverture de cavité (thoracique ou abdominale) même sous anesthésie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre au strict nécessaire dans le cadre de la formation, à savoir les animaux sur lesquels les participants auront pratiqué une biopsie cutanée suivie d'une suture seront reutilisés après leur réveil 24h plus tard pour la réalisation du catheterisme de la veine jugulaire avant l'injection d'un sous anesthésie. Un seul animal par expérimentateur sera utilisé, sachant que les animaux utilisés sont des animaux de réforme de l’animalerie n’ayant subi aucune procédure.

Raffinement

Comme tous les autres animaux de l’animalerie ils sont suivis quotidiennement pour évaluer leur comportement général (prostration, perte de fourrure, auto-aggression) et s’assurer de leur bien-être. Les souris sont utilisées dans cette formation sous anesthésie générale avec un antalgique. Seules les souris subissant une biopsie cutanée et des points de suture seront réveillées, chauffées et surveillées pendant le réveil. Tout comportement anormal des souris au réveil, même s'il est rare chez des souris ayant subi une biopsie cutanée et des points de suture, conduira à leur mise à mort sans réalisation de la deuxième procédureLa pose d'une voie d'abord au niveau de la veine jugulaire avec un est réalisée sous anesthésie générale et antalgique et les animaux reçoivent une injection létale à la fin de la procédure, en étant toujours anesthésiés.

Choix des espèces

Les souris sont largement utilisées à des fins scientifiques (statistiques MESR). Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé dans la recherche préclinique et la littérature à son sujet est donc abondante. Nous utiliserons des souris adultes de 6 à 8 semaines d'âge. Le stade de développement de ces animaux est largement utilisé dans la recherche in vivo et leur taille, à ce stade, est optimale pour la réalisation des gestes chirurgicaux décrits dans les procédures de ce projet.

Pour vérifier si la caille peut remplacer le poulet de chair comme modèle d'infection, 96 cailles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La bactérie Enterococcus cecorum, d'origine clinique ou intestinale, est vaporisée trente secondes sur la coquille des œufs ou sur le duvet des cailleteaux à la naissance, puis les oiseaux sont observés jusqu'à quatre semaines de vie avant d'être tués pour dénombrement bactérien. L'enjeu déclaré est sanitaire et économique pour une filière produisant 1,2 million de tonnes de poulet par an, la bactérie provoquant des lésions osseuses et articulaires et jusqu'à 10 % de mortalité en élevage. Le porteur annonce la boiterie comme seule nuisance attendue et indique que les points limites seront "affinés" après la première partie de l'expérience, donc fixés une fois l'infection déjà provoquée.

Objectifs

En moins de 20 ans, Enterococcus cecorum est devenu l’un des agents pathogènes majeurs dans les élevages de poulets de chair au niveau mondial. Cette bactérie du système digestif (microbiote intestinal) des volailles est responsable de pathologies locomotrices pouvant entrainer jusqu’à 10% de la mortalité dans les élevages. Elle est à l’origine d’une dégradation du bien-être animal, d’une utilisation accrue d’antibiotiques et de pertes économiques. Actuellement, aucun modèle d'infection ne permet de distinguer les bactéries cliniques des non cliniques ni d'étudier le processus de la maladie. Le développement de solutions préventives contre E. cecorum est donc conditionné à l’accès d’un modèle pré-clinique plus accessible. La caille est un modèle expérimental pour de nombreux travaux sur le développement, la toxicité, le comportement mais aussi sur les conséquences des modifications du microbiote intestinal sur la susceptibilité aux infections. Sa petite taille permet de l’élever en isolateur et ainsi de contrôler son microbiote. La caille et le poulet d’élevage appartenant à la même famille, notre objectif est d’évaluer si la caille est un hôte adapté pour reproduire le processus infectieux de E. cecorum. L’objet de ce projet est de déterminer la sensibilité de la caille à l’infection par E. cecorum et de déterminer l’effet du microbiote intestinal sur cette sensibilité. Pour ce faire nous comparerons le potentiel infectieux d’un groupe de bactérie d’origine clinique et d’un groupe d’origine commensal provenant d’un élevage non infecté chez la caille en présence ou non d’un microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

En France, la production annuelle de poulet de chair s’élève à 1,2 millions de tonnes équivalent carcasses. E. cecorum est décrit aujourd’hui dans les trois premières maladies infectieuses les plus problématiques dans cette production. Les connaissances zootechniques (rendre les animaux plus résistants), épidémiologiques et fondamentales sur la physiologie et la pathogénèse de E. cecorum doivent impérativement être renforcées pour à terme proposer des mesures de prévention et de maitrise de la maladie. La compréhension des voies de transmission et de contamination des élevages implique de disposer d’outils de détection rapide permettant de différencier les bactéries cliniques et non-cliniques. Le développement d’un modèle animal robuste reproduisant au moins la phase précoce de l’infection est nécessaire pour comprendre l’interaction de E. cecorum avec les bactéries du système digestif et son hôte.

Procédures

Toutes les cailles seront colonisées avec la bactérie E. cecorum d’origine clinique ou du système digestif par vaporisation sur la coquille d’œuf ou sur le pelage des cailleteaux à la naissance pendant 30 secondes. Les cailles seront ensuite observées jusqu’à 4 semaines de vie des animaux.

Impact sur les animaux

Si la caille s’avère sensible à Enterococcus cecorum, la bactérie pourrait provoquer une infection osseuse ou articulaire générant des troubles locomoteurs. Les nuisances attendues sont éventuellement la présence de boiterie. Les points limites et les nuisances seront affinés après la réalisation de la première partie de la procédure qui concerne l’évaluation de la sensibilité de la caille à l’infection par E. cecorum.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses pour dénombrement bactérien et études histologiques.

Remplacement

Les animaux sont des modèles expérimentaux permettant d’étudier des questions d’intérêt biologique très variées. Ils représentent des outils expérimentaux intégrant la multitude des interactions cellulaires et des processus physiologiques qui se produisent dans leur organisme. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites en totalité dans un modèle in vitro. Pour suivre l’évolution de l’infection par la bactérie E. cecorum et déterminer les interactions hôtes-microbiote (bactéries du système digestif), il est indispensable d’utiliser le modèle animal.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (ajout de copeaux sur le caillebotis etc…) et de la pesée, et une observation quotidienne accrue de l’état général de l’animal afin de surveiller l’apparition d’éventuels symptômes de lésions squelettiques entrainant des troubles locomoteurs. Des points limites adaptés à la pathologie sont mis en place. De plus, les animaux seront manipulés dès leur naissance afin de les habituer aux manipulateurs. Les cailles sont hébergées dans des isolateurs pour préserver leur statut microbien. Elles sont hébergées en groupe, en liberté dans l'isolateur, sur un caillebotis recouvert de litière. Nourriture et eau stériles sont distribuées à volonté. Ces conditions laissent une liberté de mouvement aux animaux, la litière leur permet d'exprimer leur comportement fouisseur et améliore le confort par rapport à un caillebotis nu. Des boites en plastiques retournées sont placées dans l’isolateur afin de leur servir de perchoir.

Choix des espèces

La caille est un bon modèle expérimental pour de nombreux travaux sur les conséquences des modifications du microbiote intestinal (ensemble des bactéries du système digestif) sur la susceptibilité aux infections. Pour notre projet, la caille est un modèle adéquat car elle fait partie de la même famille que le poulet d’élevage qui est l’objet de l’étude. Les cailles sont utilisées de la naissance jusqu’à 4 semaine de vie afin de suivre l’évolution de l’infection par E. cecorum.

Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature

792 souris vont être utilisées, toutes tuées au quatorzième jour pour examens histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sept injections intrapéritonéales d'anticorps humains, subit un test d'effort, deux microprélèvements sanguins sous anesthésie et une opération du mollet destinée à mesurer la perte de tonus musculaire. La maladie est provoquée par transfert d'autoanticorps prélevés chez des patients atteints de myopathie nécrosante auto-immune, et le porteur souligne que les souris malades ne montrent aucun signe visible, la faiblesse n'étant détectable qu'à l'appareil de mesure. Le compte de 792 découle du protocole retenu, 22 souris rendues malades et 22 témoins par modèle, appliqué aux neuf molécules candidates.

Objectifs

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux anticorps thérapeutiques permettant de soigner des pathologies autoimmunes du muscle. Celles-ci sont dues à un dérèglement du système de défense du corps impliquant des protéines . Il est donc important de neutraliser l'attaque du système immunitaire contre ces deux constituants pour relancer la fabrication de fibres musculaires solides et saines. Dans le cadre du remplacement, les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans cette maladie. Aujourd’hui, nous devons confirmer l’aspect préventif et/ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de la pathologie. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux bio-médicaments permettant de soigner les pathologies autoimmunes du muscle.

Procédures

Chaque animal subira : 7 Injections intra-péritonéales d'anticorps humain d’une durée de 30 secondes chacune, 1 test d'effort d’une durée de 1 à 2 minutes et enfin 1 intervention chirurgicale pour l'évaluation de la perte du tonus musculaire au niveau du gastrocnémien d’une durée maximum de 10 minutes. Les animaux seront soumis à 2 microprélèvements de sang (J0 et J7), prélèvements sous anesthésie, durée de l'acte moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront une perte de force musculaire symptomatique de la maladie. Dans de rare cas une fonte musculaire et donc une perte de poids seront observées.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie jusqu'à j14 où ils seront mis à mort pour examens histologiques.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro de fibres isolées, d’organoïdes ou de myoblastes en culture. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans les MNAI. Aujourd’hui nous devons confirmer l’aspect préventif et ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de MNAI. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Réduction

Nos modèles de maladies du muscle expérimentales chez la souris ont été optimisés et calibrés. Par expérience nous savons qu’il faut utiliser 22 animaux induits et 22 animaux témoins pour obtenir un résultat significatif et fiable pour chaque modèle de maladies du muscle. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement . Dans le but de réduire au maximum les animaux utilisés pour chacune de nos 9 molécules d’intérêt thérapeutique nous commencerons le test par le pouvoir préventif dans l’induction de maladies du muscle. En cas d’échec la capacité curative ne sera pas testée. En effet, selon le principe de fonctionnement de nos molécules, notre expertise nous permet de prévoir qu'il n'y aura pas d'effet thérapeutique.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement, notre unité a développé deux modèles de maladies du muscle expérimentales modérées en utilisant des autoanticorps issus de patients . La maladie se développe en 7 jours et présente des atteintes modérées au niveau des muscles squelettiques. Les animaux malades ne présentent aucun signe visible de la maladie et nécessite l’utilisation d’appareils de mesure de force non invasif pour détecter la maladie . Pour étudier l’aspect préventif de nos molécules les animaux seront traités à J-1 avant l’induction et la perte de force musculaire sera évaluée à J7 et J14. Pour l’effet curatif les animaux seront traités à J7 post induction et la force sera évaluée à J7 post traitement. La durée de la pathologie ne sera donc que de 7 jours afin de limiter au maximum tout inconfort de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées avec un enrichissement à base de nids cartonnés et de tampons de ouate. De la nourriture sous forme de bouillie sera distribuée en plus des granulés afin de soulager toute atteinte des muscles masticateurs. Une surveillance quotidienne basée sur le grimace scale sera effectuée du début à la fin de l’expérimentation. Le grimace scale est un système d’évaluation de l’état de stress d’inconfort et de la douleur ressentie pour chaque espèce animale. Il est basé sur l’observation de 5 critères : Contraction orbitaire, gonflement du nez, gonflement des joues, position des oreilles et position des moustaches. Pour chaque item un score de 0 à deux est appliqué en fonction de l’état. Il permet d’obtenir des scores cliniques chiffrés. Au delà de 4 les animaux concernés seront sortis de l'étude et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en sous-cutané).

Choix des espèces

La souris est un animal de choix pour l’étude des maladies auto-immunes. Les lignées établies en consanguinités permettent d’obtenir des modèles de pathologies calibrées et reproductibles. De plus un nombre important d’outils tel que les anticorps dirigés contre les différents marqueurs de populations hématopoïétiques nous permettent de « décortiquer » les phénomènes immunologiques qui interviennent dans la maladie. De plus nous avons développé depuis peu un modèle murin standardisé et optimisé de maladies du muscle par transfère d’autoanticorps issus de patients. Les souris seront agées de 8 à 10 semaines (en début de protocole) pour posséder un systême immunitaire complet et pleinement actif.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids de départ ou qui présentent des lésions cutanées sont retirées de l'étude. 978 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de peptide directement dans le cerveau sous anesthésie, un jeûne de seize heures par semaine pendant quatre semaines, des incisions de la queue pour des prélèvements sanguins étalés sur trois heures, et un test d'évitement passif qui délivre un stimulus aversif dans les pattes. L'objet réel est de mesurer chez des souris rendues amnésiques et diabétiques l'effet d'une molécule tirée d'une plante, dont le passage en clinique reste une perspective annoncée.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative liée au grand âge et est souvent compliquée de pathologies associées. Parmi celles-ci, le diabète est un facteur de risque et de complication de la maladie. Des processus neurodégénératifs communs s'expriment dans les cellules nerveuses (neurone, glie) et dans les cellules du pancréas. Parmi les cibles communes,nous étudions au laboratoire de nouvelles molécules, qui s'avèrent d'excellents neuroprotecteurs. Le but de notre projet est de caractériser ces nouvelles molécules dans des modèles de souris présentant des symptomes Alzheimer compliqués de diabète.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mesurer l'efficacité d'une molécule neuroprotectrice d'origine naturelle sur des modèles murins de maladie d'Alzheimer compliquée de diabète et permettre un développement clinique. Le projet permettra également d'établir des modèles complémentaires de comorbidité Alzheimer-diabète afin d'explorer des pistes thérapeutiques spécifiques, notamment reposant sur un molécule issue de plante.

Procédures

Les injections des molécules à tester seront faites en intrapéritonéal sur animal vigile quotidiennement pendant deux semaines (moins d'une minute). Les animaux subiront un jeûne (durée 16 h) chaque semaine durant 4 semaines. Une incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale par une crème anesthésiante) sera faite pour prélèvements sanguins (6 gouttes de sang sur une durée de 3h avec un animal remis dans sa cage entre chaque prélèvement) une fois par semaine et durant 6 semaines pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique. Les autres animaux auront une chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 2 minutes maximum entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du peptide. Ensuite, durant une semaine, les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale des molécules à tester une fois par jour (moins d'une minute) pendant 1 ou 7 jours. Suite à ces traitements, les capacités de mémoire des animaux seront analysées, en effectuant des tests comportementaux (entre 90 secondes et 10 minutes selon les tests).

Impact sur les animaux

La chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer se fait sous anesthésie. Cette procédure sera suivie par 7 jours d'injections intrapéritonéales qui pourra engendrer une légère douleur de courte durée et du stress chez l'animal. Le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme va délivrer un stimulus aversif au niveau des pattes de la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer tous les tissus d'intérêt et procéder à des tests biochimiques post- mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la maladie d'Alzheimer pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la toxicité touchant le cerveau dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite (4 doses seulement). Les animaux subiront différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire . Enfin, les analyses statistiques sont optimisées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (généralement 15 souris/groupe pour les tests comportementaux). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé en tenant compte de la force des tests statistiques appliqués aux réponses comportementales.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi quotidiennement en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait immédiatement interrompu et, si nécessaire, l'animal serait retiré de l'étude. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Les modèles de souris utilisées dans cette étude présentent rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et permettent d'obtenir des données préliminaires transférables en essai clinique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisés dans les projets antérieurs