Procédures modérées

Un score de grimaces faciales décide de la mise à mort des rats dont la douleur dépasse le seuil fixé. 70 rats, moitié mâles moitié femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur prévoit de les proposer ensuite à la réutilisation par d'autres équipes. Chacun reçoit sous anesthésie une injection de carraghénine dans le coussinet d'une patte arrière, qui déclenche un œdème douloureux culminant trois à cinq heures plus tard, puis subit neuf séances de contention pour mesurer le gonflement au pied à coulisse et au pléthysmographe. Le projet sert un fabricant qui a modifié la formulation de sa crème antihistaminique pour en réduire le coût et cherche à convaincre l'Agence du médicament de maintenir l'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Les crèmes anti histaminiques sont indiquées spécifiquement pour le traitement local des démangeaisons, notamment les piqûres d'insectes. Dans le cadre d'une évolution commerciale, un fabricant a modifié la formulation de sa crème et souhaite réaliser une étude pour la valider directement auprès de l’Agence du médicament sans refaire une demande d’autorisation de mise sur le marché complète (le principe actif étant le même). L'objectif est d’obtenir des preuves d’efficacité du produit nouvellement formulé et ainsi pouvoir convaincre les autorités de santé de maintenir la commercialisation du produit et demander une modification d'autorisation de mise sur le marché chez l'Homme. Le projet vise à comparer l'efficacité de la nouvelle formulation de cette crème avec celle de l'ancienne. Cette évaluation sera effectuée dans un modèle d'inflammation de la patte chez le rat, induisant un œdème, une rougeur et une démangeaison. Les critères d'évaluation incluent le développement de l'œdème au niveau de la patte, la présence de rougeur, ainsi que le comportement de l'animal (grattage, morsure, signes de douleur) qui ne peut être remplacer par d’autres études in vitro. Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 rats, 50%-50% de mâles et de femelles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à pouvoir maintenir la commercialisation d’une crème anti histaminique. En effet, l’ancienne formulation ne pourra perdurer du fait des couts élevés de ces composés et des difficultés associées d’approvisionnement. Le bénéfice de la validation d’une nouvelle formulation à laquelle participe cette étude est important. Ce bénéfice est de pouvoir maintenir un accès aux soins par un produit de nouveau manufacturable (sans limite d’approvisionnement) et moins onéreux dans sa nouvelle formulation. Cela passe par la diminution du tarif du produit pour le patient et un meilleur approvisionnement vis-à-vis des composants du produit. Au final, le médicament sera plus accessible aux populations précaires en particulier dans les pays en développement (ex : Afrique) dans lesquels ce produit est justement fortement utilisé au vue d’une susceptibilité accrue aux piqures d’insecte. Le second bénéfice est le maintien d’un traitement peu onéreux pour améliorer le confort des patients ne pouvant se procurer un soin plus couteux (corticoïdes par exemple qui engendreraient des problèmes sanitaires et effets secondaires).

Procédures

Les animaux (n=70) seront soumis à une injection sous cutanée de carraghénine dans une patte arrière, suivie d’une application de crème ou injection intrapéritonéale de solution injectable sur le site d’intérêt, le tout sous anesthésie générale. La durée de cette intervention sera de 10 minutes environ. Pour chaque mesure de l’œdème et prise de photographie de la patte (i.e. T0, T0+, T1h, T2h, T3h, T4h, T5h, T6h et T24h), chaque animal sera maintenu en contention le temps de la mesure du volume de l’œdème à l’aide du pied à coulisse et du pléthysmographe et la photo, soit environ 5 minutes par temps de mesure (soit 9 fois).

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation dans la patte arrière par injection de carraghénine entraîne une inflammation, des rougeurs et un œdème, pouvant être douloureux et induire un stress à l’animal. L’œdème induit par la carraghénine se développe en 2 phases ; la première 30 min après injection, la seconde commence à la fin de la première heure et dure jusqu’à 3h après injection. Le pic de l’œdème est entre 3 et 5 heures après injection. Les traitements pharmacologiques sont administrés en une seule application, juste après l’injection de carraghénine, par application locale de la crème sur la zone d’intérêt ou par injection intrapéritonéale.

Devenir

A la fin de la procédure (T24h après injection), les animaux feront l’objet d’une analyse clinique, seront immédiatement traités par analgésiques jusqu’à rétablissement total de leur état de santé et seront proposés à la réutilisation pour les expériences d’autres utilisateurs. Aux vues de ce qui est décrit dans la littérature pour ce modèle, l’ensemble des animaux seront sortis de l’étude en ayant pleinement recouvert leur état de bien-être et seront disponibles pour la réutilisation. Néanmoins, au cours de la procédure, si des signes de souffrance de l’animal apparaissent et si les points limites sont atteints, celui-ci sera mis à mort. Le niveau le plus élevé de sévérité sera considéré pour ces animaux (sur le score de comportement). Les mesures cinétiques de la taille et du volume de l’œdème s’arrêteront au moment du sacrifice mais les données précédentes seront intégrées aux résultats.

Remplacement

Le présent projet ne peut pas être réalisé en remplaçant l’animal par des méthodes alternatives (comme des cellules) puisqu’il s’agit ici de tester l’efficacité symptomatique d’un traitement pharmacologique par le biais de l’observation du comportement animal, du développement d’un œdème et d’un changement de couleur de peau en réponse à l’induction d’une inflammation. Aucun modèle cellulaire ne peut le remplacer. Une réflexion sur une étude de diffusion de la nouvelle formulation a été réalisée mais ne pourra pas suffire à elle seule à convaincre les autorités de santé. Aussi l’objectif visant à évaluer l’effet anti-démangeaison du produit par modification du comportement des animaux ne peut pas se faire par ces modèles alternatifs, or c’est le mode d’action principal du produit et l’objectif principal.

Réduction

Un petit nombre d’animaux seront d’abord utilisés pour mettre au point et vérifier les protocoles : qualité/efficacité de la molécule inflammatoire, volumes de crème applicable, prise en main des dispositifs de mesure de volume, réaction des animaux. Selon les résultats obtenus, l’étude pourra s’arrêter à cette étape. Si l’étude se poursuit, le modèle et la formulation actuellement commercialisée seront validés en première intention. Si, et seulement si, les résultats sont concordants avec les connaissances actuelles la nouvelle formulation et son efficacité seront mesurés. S’assurer de l’efficacité de la nouvelle formulation lors de cette étude permet de s’affranchir d’une nouvelle demande d’autorisation de mise sur le marché chez l’Homme, nécessitant un nombre beaucoup plus important d’animaux.

Raffinement

Pendant la période de stabulation, les animaux seront hébergés en groupes (2/cage), dans un environnement enrichi et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Pendant le protocole expérimental, les rats seront toujours répartis 2 par cage, leur litière sera remplacée par de la litière douce non abrasive, et seront identifiés pour les besoins de l’expérimentation par une marque au feutre sur la queue différente entre les 2 animaux d’une même cage au moment de la procédure (soit pendant 24h). L’induction de l’inflammation dans les coussinets de la patte et l’application locale de la crème ou l’injection de la molécule seront réalisées sur animaux anesthésiés afin de limiter la douleur et le stress. Aussi, durant toute la durée de la procédure, à savoir 24h, une surveillance accrue sera réalisée pendant les 6 premières heures après induction de l’inflammation, intervalle le plus critique dans ce modèle, avec la présence permanente d’une personne les observant. L’apparition de signes de douleur et l’atteinte des points limites (score de comportement et de grimaces faciales) seront particulièrement surveillés. Les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet en quelques minutes puisqu’il sera présent lors de l’expérimentation. Le modèle utilisé peut paraitre douloureux vis-à-vis de la zone d’injection mais une autre partie du corps n’est pas envisageable pour mesurer précisément la taille de l’œdème par des mesures de volumes d’eau déplacés (rendu possible ici en plongeant la patte dans un pléthysmographe). Finalement, si nous ne mesurons pas le volume, nous perdrions en précision de mesure et donc en puissance statistique.

Choix des espèces

La majeure partie des études expérimentales utilisant un modèle d’inflammation à la carraghénine pour tester l’effet de différents traitements pharmacologiques est réalisée chez le rat. En effet, le rat répond très bien à cette procédure expérimentale et développe un œdème inflammatoire quantifiable et dont l’effet des traitements peut être significativement démontré. C’est le modèle de référence dans les publications. L’utilisation du rat, de par sa taille bien plus grosse que la souris, rend l’induction de carraghénine au centre du coussinet de la patte arrière plus facilement reproductible, et la quantification de la taille de l’œdème au pied à coulisse et au pléthysmographe est beaucoup plus précise et fiable. Les animaux seront commandés à l’âge de 8 semaines (env 300g) et utilisés après 1 semaine de stabulation afin d’utiliser des animaux adultes.

Injectées de cellules tumorales puis traitées tous les deux jours, une partie des souris subit aussi deux irradiations à trois jours d'intervalle, calibrées pour détruire leur moelle osseuse. 4 871 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi les immunothérapies échouent chez une partie des patients. Toutes sont tuées, y compris les témoins sans tumeur, parce que l'étude porte sur les cellules contenues dans leurs organes. Le porteur écrit que ses procédures n'impliquent pas l'arrivée des animaux aux points limites, après avoir décrit une gêne respiratoire, une nécrose tumorale et une baisse de tonicité dans les derniers stades de la maladie.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier le mode d’action des immunothérapies (IT) afin de mieux appréhender les échecs de ces traitements chez les patients/cancers non répondeurs. Dans cet objectif, il est dans un premier temps nécessaire de mieux comprendre les réactions immunitaires ayant cours durant les cancers et la façon dont elles sont modifiées par les IT. Cela devrait permettre de mettre en évidence les types cellulaires qui sont impliqués dans l’élimination de la tumeur et la façon dont ces cellules immunitaires tuent les cellules tumorales. En particulier, ce projet s’articule autour de 4 objectifs principaux : - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient les cellules immunitaires infiltrant la tumeur - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient la génération des cellules du SI à distance dans la moelle osseuse - Identifier les types cellulaires essentiels au fonctionnement des IT - Identifier les mécanismes d’action utilisés par le système immunitaire (SI) et activés par les IT pour lutter contre la tumeur Ce projet nécessite l'utilisation de plusieurs procédures censées reproduire a minima la diversité des cancers observés chez l’être humain. Nous nous focalisons sur trois types principaux de cancer à savoir le cancer du poumon, le cancer de la peau et les lymphomes. Ces cancers sont bien modélisés chez le petit animal et les traitements utilisés chez l'être humain fonctionnent sur les animaux. Cela permet de modéliser avec précision le contexte immunitaire de l’animal avec une certitude convenable que les effets puissent être, au moins en partie, similaires chez l’humain. Hautement translationnel, ce projet permet de tester rapidement la cohérence des résultats obtenus sur les modèles murins avec les observations réalisées sur deux cohortes de patients atteints de cancers et traités par IT. Ainsi, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi une fraction significative de patients/cancer ne répondent pas aux IT, malgré les résultats très prometteurs observés chez les patients répondeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Premièrement, la description de nouvelles cellules dans le cancer du poumon permettra d’établir de nouvelles pistes pour le ciblage thérapeutique des immunothérapies dans cette pathologie. Deuxièmement, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des immunothérapies permettra de mieux comprendre la réponse des patients au traitement. Ici, nous estimons qu’il est probable que nous puissions proposer un biomarqueur circulant chez les patients permettant d’évaluer rapidement leur réponse au traitement (en 1 à 2 semaines) contrairement à 2 à 3 mois actuellement. Troisièmement, la description de nouvelles molécules et mécanismes des cellules myéloïdes impliquées dans la lutte contre les cancers permettra de proposer des traitements de synergie avec les immunothérapies visant spécifiquement les cellules myéloïdes. Ces traitements pourraient grandement améliorer la réponse des patients aux immunothérapies. Dans l’ensemble, ce projet tire sa cohérence de l’approche globale qu’il propose vis-à-vis du fonctionnement des immunothérapies. Ce projet est suffisamment diversifié pour résister à l’échec potentiel d’une sous-partie.

Procédures

Les animaux anesthésiés ou vigiles pourront être injectés une fois en sous-cutané, intra-péritonéal, ou intra-veineux d’une solution de cellules tumorales. L’anesthésie prend quelques minutes à agir et l’injection quelques secondes. Les animaux pourront subir des injections intra-péritonéales (animaux vigiles ou anesthésiés) ou intra-veineuses de traitement tous les deux jours. Du sang pourra être prélevé une fois sur les animaux anesthésiés avant leur mise à mort. Ce prélèvement se fera en quelques secondes. Les animaux ne se réveilleront pas entre le prélèvement et la mise à mort. Dans certains cas, une goutte de sang pourra être prélevée deux fois à huit jours d’intervalle. Pour certaines procédures, les animaux seront irradiés (deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle; leur durée sera mise au point durant le projet, elle doit pouvoir conduire à une myélosuppression).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Néanmoins, la fréquence des injections peut tout de même entraîner une nuisance, de même que les prélèvements. Nous n’utilisons pas d’animaux ayant un phénotype dommageable, hormis une lignée qui sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux sains, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie selon un tableau de suivi des points limites. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales sont comme suit : - Pour les tumeurs pulmonaires : gène à la respiration, baisse de la tonicité générale et perte de poids dans les derniers stades du cancer. - Pour les tumeurs sous cutanées : Nécrose de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie. Les procédures que nous utilisons, hormis l’étude de la survie, n’impliquent pas l’arrivée des animaux aux points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et devons nécessairement mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous le ferons, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Cependant, ni la modélisation mathématique, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier les effets du développement tumoral et les réponses immunitaires anti-tumorales induites par les tumeurs ou la vaccination. Nous nous intéressons à des cellules nouvelles non encore décrites et dont nous ne connaissons par les progéniteurs ni l’origine. Il est donc impossible de ne pas travailler sur l’animal. Dès que les cellules auront été décrites et les progéniteurs identifiés, nous tâcherons de mettre au point des méthodes de cultures in vitro pour en étudier la fonctionnalité au plus près sans impliquer les animaux dans des procédures expérimentales.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animal. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistique. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques. En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées. Deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle.

Raffinement

Dans la mesure du possible, les animaux ne seront pas laissés seuls dans leur cage. Les expériences impliquant le développement de tumeurs seront pratiquées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Afin de minimiser l'impact des procédures, nous allons anesthésier les souris avant d'injecter les tumeurs. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués tous les 3 jours afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Gel hydrique et/ou des réhydratations en sous-cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Si les animaux présentent des signes d’hypothermie, les cages seront chauffées. Des maisonnettes en carton ou des tubes (carton ou plastique) pourront être introduits dans les cages de stabulation en guise d’enrichissement. La lignée immunodéprimée à phénotype dommageable sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’être humain. Cette espèce a une reproduction facilement manipulable avec un temps de gestation court et plusieurs individus par portée, donc des conditions d’élevage optimales. De plus, ce modèle étant très étudié, il y a une vaste expertise technique et scientifique autour de son utilisation et de nombreux outils sont déjà disponibles (anticorps, molécules inhibitrices/activatrices, modèles de souris génétiquement modifiées…). La souris est donc le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux seront mis en expérimentation à l'âge adulte à partir de 8 semaines après leur naissance et jusqu’à 25 semaines environ. Cela permettra d’étudier un système immunitaire mature proche de celui de l’être humain.

Deux à trois cents ovocytes prélevés chaque semaine sur un même animal, six prélèvements par an pendant cinq ans : 30 xénopes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque prélèvement passe par une immersion de quarante à quarante-cinq minutes dans un bain anesthésiant, une incision abdominale d'un centimètre et demi et une suture. Le porteur qualifie la technique de méthode alternative permettant de s'affranchir de manipulations in vivo, alors que ces manipulations sont exactement ce qu'il décrit, l'ovocyte servant de support pour étudier des canaux ioniques humains. Le champ structuré du devenir ne déclare aucun animal maintenu en vie, quand le texte indique que les xénopes sont réutilisées d'un projet à l'autre et gardées jusqu'à leur mort naturelle.

Objectifs

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est centrale dans nos thématiques de recherche dont les objectifs principaux sont les suivants : ​études pharmacologiques cellulaires et moléculaires, caractérisation du mode d’action de ligands naturels ou synthétiquec des canaux ioniques, étude du mode d’action de médicaments ou de toxines, caractérisation de l’impact fonctionnel par approche in vitro de variants de gènes de canaux ioniques, suspectés associés à des pathologies humaines ,​ études des relations structure-fonction des canaux ioniques (caractérisation des domaines fonctionnels), études toxicologiques (évaluation de l‘activité de certaines substances ou molécules sur des canaux ioniques, reflétant leur toxicité au niveau cellulaire, neurotoxicité, cardiotoxicité...).​

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter des connaissances scientifiques dans différents domaines, tels que : 1) mieux comprendre les effets bénéfiques ou averses d'agents pharmacologiques actifs sur les canaux ioniques (médicaments, toxines, toxiques...), 2) caractériser les impacts fonctionnels par une approche alternative, de mutations desgènes de canaux ioniques causant des pathologies parfois graves. La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Procédures

Les xénopes sont anesthésiés par immersion dans un bain d'anesthésie pendant 40 à 45 minutes. Après induction de l’anesthésie, une incision de 1,5 cm maximum est réalisée pour accéder aux sacs ovariens. Après prélèvement, la plaie est suturée immédiatement; cette étape durant environ 10 minutes. Pour préserver la bonne santé des animaux, chaque prélèvement sur un même animal doit être espacé de 2 mois.

Impact sur les animaux

La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Devenir

200-300 ovocytes prélevés sur un animal par semaine. Après prélèvement, les xénopes sont mis au repos pendant 2 mois. Nous avons une utilisation continue des xénopes : avec 6 prélèvements annuels, durant 5 ans . Les xénopes ont une longévité de 15 ans en moyenne.

Remplacement

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est incontournable pour l’investigation au niveau cellulaire et moléculaire des effets toxiques, du mode d’action de médicaments, voire de l’impact de certains variants sur la fonction des canaux ioniques. ​Cette technique permet également de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Cette approche constitue une méthode alternative à l’utilisation des rongeurs pour réaliser des cultures primaires de neurones, par exemple. ​

Réduction

​Pour un projet visant à caractériser l’impact fonctionnel d’une mutation ou l’effet d’une molécule, les analyses statistiques nécessitent l’utilisation de 10 ovocytes par mutation ou concentration de molécule, provenant de 3 animaux différents. Etant données nos activités de recherche, ceci implique l'utilisation de 30 xénopes pour 5 ans au maximum. Les animaux sont préservés jusqu‘à leur mort naturelle. Ils sont utilisés ou réutilisés dans plusieurs projets. Un vétérinaire les examine 1 fois par an au minimum pour vérifier leur état de santé.

Raffinement

​​Le prélèvement est réalisé sur des animaux anesthésiés. Les sutures sont réalisées avec un fil résorbable. Les animaux sont ensuite réveillés progressivement par rinçage à l’eau claire, et surveillés avant d’être replacés avec leurs congénères. Les aquariums sont enrichis avec des pots en terre cuite qui leurs servent de cachettes.

Choix des espèces

Les xénopes produisent des ovocytes de grande taille (1-1,5 mm) qui facilitent leur transfection par injection intracellulaire de matériel génétique. L’ovocyte de xénope constitue un système d’expression hétérologue incontournable pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques des récepteurs et des canaux ioniques, depuis 1990. L’utilisation de ce modèle cellulaire est très pratique pour des études pharmacologiques in vitro, assez simple à réaliser, et permet de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (1-5 ans) correspondant à un stade où les femelles produisent de nombreux ovocytes.

Toutes tuées pour prélever tissus et sang, 1 500 souris rendues obèses et diabétiques par une mutation du récepteur à la leptine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une à deux fois par jour, elles reçoivent des composés par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, et subissent cinq prélèvements sanguins, des jeûnes de quatre à quatorze heures, des épilations sous anesthésie et des séjours de vingt heures en cage métabolique. Le porteur reconnaît que la contention répétée peut créer des lésions cutanées et que la surcharge en glucose empêche ces souris diabétiques de revenir à une glycémie normale. Il affirme que les cultures cellulaires ne sont pas un miroir suffisamment fiable de l'organisme et que les dysfonctions métaboliques ne peuvent être reproduites qu'in vivo.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline et au diabète de type 2. Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Le modèle murin utilisé au cours de cette étude est un modèle dont la mutation spontanée touchant le récepteur à la leptine rend la souris hyperphagique dès la naissance et donc obèse, et ce, même sous régime standard. Son obésité s’accompagne de diabète de type 2 et constitue un modèle classique et standard utilisé lors des études précliniques pour démontrer l’efficacité des molécules thérapeutiques à la fois sur l’obésité et le diabète. Au cours du temps, d’autres comorbidités associées au diabète sont observées chez ces souris tels que la néphropathie diabétique et certaines cardiomyopathies.

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant l’obésité, ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète, ou ciblant l’insulinopénie, phase tardive du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 5 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué en milieu et fin de projet. Le test de tolérance au glucose nécessite une mise à jeun de 14h qui implique une individualisation des animaux. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse après 2h de jeun (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 20h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

1) Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Les contentions répétées peuvent créer des lésions cutanées sur les souris diabétiques. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 2) Les mises à jeun (4h ou jeun complet sur la nuit) lors des prélèvements de sang et tests de tolérance peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques et hyperphagiques. Pour éviter tout risque de cannibalisme lors de la période de jeun de 14h, les animaux seront mis en cage individuelle. 3) La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 4) Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. 5) Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 6) Plus les souris vieillissent, plus le risque de complications liées à la maladie augmente.

Devenir

Tous les animaux (1500 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études précoces de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra de d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en assurant la robustesse des résultats

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : du coton en vrac sera systématiquement ajouté pour permettre aux souris de se réchauffer. La litière sera changée régulièrement car ces souris urinent beaucoup. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé au cours de cette étude est un modèle dont la mutation spontanée touchant le récepteur à la leptine rend la souris hyperphagique dès la naissance et donc obèse, et ce, même sous régime standard. Son obésité s’accompagne de diabète de type 2 et constitue un modèle classique et standard utilisé lors des études précliniques pour démontrer l’efficacité des molécules thérapeutiques à la fois sur l’obésité et le diabète. Au cours du temps, d’autres comorbidités associées au diabète sont observées chez ces souris tels que la néphropathie diabétique et certaines cardiomyopathies. Les souris diabétiques sont hyperphagiques depuis la naissance, l’obésité apparaît très précocement dès le plus jeune âge (4 semaines d’âges). Ainsi le diabète apparait très précocement avec des niveaux de glycémies et d’insulinémies très élevés dès les premières semaines de vie (stade d’insulinorésistance) puis une phase d’insulinopénie à l’âge adulte (insuffisance des cellules béta qui n’est pas observée chez des souris rendues obèses sous régime gras). Les comorbidités touchant le rein et le cœur apparaissent dès 12-15 semaines d’âges. Ainsi, en les prenant à 6 semaines d’âges nous garantissons d’agir lorsque la diabète s’installe et nous permet d’étudier l’efficacité des thérapies sur l’avancée du diabète et des comorbidités.

Pour comparer deux méthodes de fabrication de cellules CAR-T anti-CD19, l'une en deux jours, l'autre en onze, 120 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques, jusqu'à trois injections intraveineuses en contention, trois prélèvements sanguins submandibulaires et un prélèvement de moelle osseuse au fémur, avec un suivi des tumeurs par imagerie. Le porteur écrit que ces gestes n'induiront aucune nuisance, tout en décrivant chez les souris témoins une leucémie qui restreint les mouvements des pattes arrière et fait perdre l'appétit et le poids. La réaction du greffon contre l'hôte, qui peut survenir plusieurs semaines après l'injection des CAR-T, figure parmi les points limites qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier l'efficacité de 2 modes de production de cellules dites CAR-T qui sont des cellules du système immunitaire qui ont été génétiquement modifiées dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses. La thérapie par cellules CAR-T consiste en l'injection au patient de ses propres cellules T après leur amplification ex vivo et leur modification pour leur faire exprimer un récepteur capable de reconnaitre une protéine exprimée à la surface d'une cellule tumorale et ainsi de pouvoir la détruire. La thérapie cellulaire CAR-T ciblant la molécule CD19 a montré une efficacité remarquable dans le traitement des hémopathies malignes-B, cependant, des essais cliniques ont rapporté que 30 % des patients n'ont pas pas pu recevoir de perfusion de cellules CAR-T en raison de leur décès (dû à une progression trop rapide de la maladie) et en lien avec un processus long de fabrication de ces cellules qui est actuellement de 7 à 14 jours. Il est donc essentiel de réduire la durée de production des cellules CAR-T pour une utilisation à plus grande échelle. Une étude préclinique a montré que les cellules CAR-T produites avant 3 jours avaient une capacité proliférative accrue et un effet antitumoral plus important que celles produites dans les 9 jours, néanmoins, la faisabilité de la production accélérée de CAR-T ainsi que son efficacité n'ont pas été suffisament testées. Dans ce projet nous allons comparer l'efficacité antitumorale de cellules CAR-T anti-CD19 produites au laboratoire en 2 jours (appelées FASTCAR) à celles de cellules de CAR-T (dites conventionnelles) produites en 11 jours. Ces cellules CAR-T seront injectées et testées dans 2 modèles murins de cancer du sang [Leucémie Aigue Lymphoblastique de type-B (LAL-B) ou Leucémie Aigue Myéloïde (LAM)] qui expriment la cible CD19.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi du développement des tumeurs sur souris anesthésiée par utilisation d'un bioimageur, acquistion du signal durant 2 minutes. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les interventions : injections en intra-veineuse, les prélèvements et le suivi par imagerie sont réalisés dans des conditions maitrisées qui n'induiront pas de nuisance sur les animaux. Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CART à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF (Specific Pathogen Free) : ce statut SPF considère les principaux pathogènes chez les rongeurs et permet donc d’établir un état sanitaire pour des animaux « en bonne santé » et indemnes des principaux pathogènes. Les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse en respiration spontanée. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront réduit au strict minimum. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) sera mise en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un analgésique sera utilisé le temps nécessaire.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

Jusqu'à cinq injections dans un muscle, dans l'abdomen ou dans le sang, espacées de vingt-quatre heures, et pour une partie des souris six jours de tapis de course à dix minutes par jour : 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines jeûnent jusqu'à douze heures et perdent du poids. Toutes sont tuées pour prélever leurs muscles et analyser les protéines des membranes qui déclenchent la contraction, structures défectueuses dans des maladies génétiques du muscle et dans le diabète de type 2. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet ce travail, les cultures de cellules musculaires n'atteignant pas selon lui un stade assez mature, et ne donne aucun élément sur le calcul qui aboutit à 422 souris.

Objectifs

Les muscles se contractent grâce à des connexions avec le cerveau via des neurones. Les signaux émis par les neurones se propagent à la surface des fibres musculaires, le long de leurs membranes, ce qui déclenche d’autres signaux au sein des fibres et entraîne leur contraction synchronisée. Les structures membranaires des fibres musculaires impliquées dans la transmission de ces signaux sont défectueuses dans certaines maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2. Elles ont été peu étudiées et des données de la littérature suggèrent qu’elles sont impliquées dans d’autres fonctions que la contraction comme le stockage de glucose. L’objectif de ce projet est d’étudier ces structures membranaires pour mieux comprendre leur implication dans des pathologies. Les études seront réalisées avec le modèle souris qui présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de comprendre le fonctionnement et toutes les fonctions associées aux membranes des fibres musculaires impliquées dans leur contraction. C’est une étape essentielle pour connaître les défauts responsables de 2 types de maladies associées à ces structures : des maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2, et pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques pour ces pathologies.

Procédures

Les souris seront injectées au maximum 5 fois dans un muscle, l’abdomen ou la circulation sanguine pendant moins de 30 secondes. Les injections seront séparées d’au moins 24h. Certaines de ces souris seront entraînées sur un tapis de course à raison de 10 min par jour pendant 6 jours.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur tous les animaux sont la douleur due aux piqûres d’aiguilles avec un faible risque d’hématome au point d’injection. Certains animaux auront une perte légère de poids corporel dû à un jeûne de 12h maximum. Le protocole d’entraînement à la course peut entraîner une fatigue passagère mais ne conduit pas à l’épuisement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant la réalisation du projet. Les cultures in vitro de cellules musculaires ne se développent pas suffisamment pour atteindre un stade mature des structures étudiées. Elles ont cependant permis de faire un premier tri des réactifs pour réduire le nombre de ceux qui seront testés chez les animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à des tests statistiques afin d'obtenir des résultats standardisés et reproductibles en réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles fines et sous anesthésie générale pour les injections dans la circulation veineuse pour réduire la douleur de l’injection. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par un personnel formé et évalué grâce à des signes cliniques codifiant le niveau de bien-être pour intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent, notamment par la délivrance d’anti-douleurs. Les souris qui réaliseront l’exercice de course seront entraînées les 5 jours précédents pour réduire le stress de la nouveauté.

Choix des espèces

La souris présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles. Des animaux âgés d'au moins 2 mois seront étudiés car les muscles sont matures à cet âge.

Fournir aux chercheurs des lots d'animaux au génotype vérifié : c'est l'objet déclaré d'un projet qui porte sur 119 170 souris et 660 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un seul prélèvement, un poinçon dans l'oreille en routine, parfois un morceau de queue entre quatorze et dix-sept jours de vie, très rarement une prise de sang. Le porteur décrit des nuisances "légères et brèves" tout en listant inflammation, œdème, hématome et saignement au point de prélèvement, et l'effectif de 119 830 animaux n'est appuyé par aucun calcul. Une partie part vers d'autres établissements pour y être expérimentée, une autre sert à l'élevage, et les animaux dont le génotype ne convient pas aux croisements ou dont la fécondité baisse sont tués.

Objectifs

Notre établissement héberge dans ces animaleries différentes lignées de souris et de rats génétiquement altérées pour le compte de chercheurs externes au laboratoire. Ce projet a pour objectif de décrire les méthodes de prélèvement d’échantillons biologiques (tissu, sang) pour les contrôles génétique (génotype) d’animaux en élevage. Ces analyses permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre unité afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec divers enrichissements. Le prélèvement invasif pour le génotypage est dissocié de l’intervention d’identification. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront suivis tous les jours et, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage).

Bénéfices attendus

Les prélèvements décrits sont effectués pour les analyses qui permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre établissement afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés.

Procédures

Un seul prélèvement par animal sera réalisé pour génotypage : - de tissu par poinçon (oreille, en routine) ou à l’aide d’un ciseau (oreille en routine, queue exceptionnellement), ou - de sang, très rarement (par la veine en sub-mandibulaire). Si les résultats obtenus ne sont pas clairs pour interprétation, nous referons l’analyse sur l'échantillon prélevé qui sera conservé. Si les résultats ne sont pas concluants après ce deuxième test, un échantillonnage supplémentaire (oreille ou sang) sera exceptionnellement effectué sur le même animal. Dans ce cas, il y aura a minima une semaine d’écart entre les deux prélèvements sur le même animal. Ces interventions durent moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

La manipulation pour les prélèvements peut provoquer un léger stress chez l'animal. Les signes cliniques (inflammation, œdème, hématome, saignement) sur le site de prélèvement sont possibles mais le plus souvent évités si la biopsie est bien exécutée. La biopsie de l’oreille (réalisée en routine) provoque moins d’inconfort que celle de la queue parce qu’elle ne touche pas un tissu osseux. La biopsie de l'oreille ne sera jamais effectuée chez les souris âgées de moins de 2 semaines compte tenu de la petite taille de leurs oreilles. La biopsie de la queue sera effectuée seulement si la biopsie de l'oreille ne convient pas à l'étude (justification scientifique) et après l'avis favorable de la SBEA. Cette technique pourra être effectuée seulement chez les jeunes souris (âgées de 14 à 17 jours) pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité, et la taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible pour permettre le génotypage. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment et sera réalisé pour des analyses particulières. Le volume prélevé dépendra du poids de l'animal et, compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux, sera réalisé uniquement sur des animaux âgés de 2 mois ou plus. Les prélèvements ne sont réalisés qu’une fois par animal et durent moins de 30 secondes. Les nuisances liées à ces techniques seront légères et brèves. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal.

Devenir

Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt sera expédiée dans d’autres établissements utilisateurs pour expérimentation. Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage ou l’expérimentation dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g. si génotype sans intérêt pour les schémas de croisements, surplus, ou si leur fécondité est réduite du fait de leur âge). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation seront mis à mort.

Remplacement

Les modèles de souris et de rats concernés par ce projet générique sont inscrits dans différents projets scientifiques extérieurs à notre laboratoire. Les porteurs de projets apporteront dans chacune de leurs DAP d'utilisation des précisions sur les alternatives non animales disponibles et expliqueront pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.

Réduction

Le prélèvement pour génotypage sera réalisé uniquement sur les animaux reproducteurs lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote et ne sera pas systématique pour les autres lignées, mais limité aux besoins de l’élevage ou de l’expérimentation pour les EU destinataires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire avec divers enrichissements (tunnel et/ou dômes en polycarbonate transparent rouge, frisure de papier kraft et/ou du celluron et/ou des granulés ou bois de rongeage). Les animaleries de notre unité ont un contrôle sanitaire périodique. Les prélèvements pour les analyses durent moins de 30 secondes. Nous réaliserons en routine uniquement le prélèvement à l’oreille. Le prélèvement de la queue et du sang n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser les techniques de prélèvements rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage, soin sur le site du prélèvement).

Choix des espèces

La souris et le rat sont parmi des modèles d'animaux les plus utilisés dans la recherche en raison de leurs nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, le choix de ces modèles est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature permettant ainsi des échanges internationaux au sein de la communauté scientifique. Les justifications techniques et scientifiques détaillées pour chaque lignée utilisée seront apportées dans les projets « utilisateurs » (DAP spécifique). Une partie des animaux sera utilisée pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable selon la souche. Une autre partie sera utilisée dans notre établissement ou envoyée dans d’autres établissements pour expérimentation selon l’âge d’utilisation dans de différents projets scientifiques. Les animaux en élevage pourront être prélevés pour les analyses à différents âges selon la technique utilisée : - 15 jours ou plus pour le prélèvement à l'oreille (ne sera jamais effectué avant cet âge compte tenu de la petite taille des oreilles) - entre 14 et 17 jours pour le prélèvement de la queue (pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité) - 2 mois ou plus pour le prélèvement de sang (compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux).

Les tremblements sont retenus comme point limite déclenchant la mise à mort. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent une injection de Shiga-toxine qui reproduit un syndrome hémolytique et urémique, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur écrit que ces injections n'induisent "pas de traumatisme ou de douleur" tout en décrivant des yeux mi-clos, des diarrhées, un poil piqué et des tremblements, et présente l'utilisation des animaux comme "indispensable" pour comparer deux traitements.

Objectifs

La Shiga-toxine (STx2) est produite par une bactérie de la famille Escherichia coli et est la cause d’une maladie infectieuse grave (SHU) le plus souvent d’origine alimentaire. Le SHU appartient à une famille de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. La STx2 entraîne d’une part l’inflammation et la mort cellulaire massive, et d’autre part l’activation du système du complément, qui participe aux mécanismes de défense naturels. Le traitement de ces pathologies comprend des traitements non spécifiques et des traitements spécifiques ciblant système du complément, comme l'anticorps anti-C5, le premier traitement approuvé pour le SHU chez les patients pédiatriques et adultes. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires dans les cellules et dans des modèles de souris infectées. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de la clusterine et de l’anticorps anti-C5a dans le SHU afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance rénale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale sera utilisée pour les 4 lots de souris. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 2/ L’Injection intra veineuse sera utilisée pour 2 lots de souris. Elle concerne 40 au total, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 3/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée pour les 4 lots de souris. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 4/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée pour les 4 lots de souris. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner les 80 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. Le poil pourra présenter un aspect piqué, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (80) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Les souris seront placées par nombre de 4 par cage. L’alimentation et l’abreuvement seront fournies ad libitum tout le long de l’hébergement. Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro- orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.