Procédures modérées

Remplacer une hormone d'extraction dont l'approvisionnement devient difficile : 120 cochettes pré-pubères vont être utilisées pour tester une molécule qui déclenche l'ovulation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont abattues en fin de protocole pour prélever les ovaires et l'utérus et compter les embryons. Sur onze jours, chaque animal subit une prise de sang de 10 mL par jour, soit 110 mL au total, une injection intramusculaire, jusqu'à neuf échographies, l'introduction d'un verrat deux fois par jour pendant une semaine pour détecter les chaleurs, puis deux inséminations artificielles. Le porteur écrit que 120 cochettes "seront nécessaires", justifie l'espèce par le fait qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'état physiologique d'une cochette pré-pubère, et rattache l'enjeu à la production porcine.

Objectifs

Nous développons une molécule capable de remplacer les traitements actuels d'induction de l'ovulation chez les animaux de rente. L'efficacité et la toxicité de cette molécule ont déjà été testées dans différentes espèces, dont la cochette pubère. Nous souhaitons dans cette nouvelle saisine tester son efficacité chez la cochette pré-pubère. En effet, actuellement, la puberté est induite chez ces animaux par l'utilisation de PG600, qui est un mélange de hCG (human chorionic gonadotropin) et de eCG (equine chorionic gonadotropin), hormones extraites dont l'approvisionnement devient problématique. Au total, 120 cochettes pré-pubères seront nécessaires pour ce projet.

Bénéfices attendus

Cette expérience permettra de démontrer l'efficacité de RPV à induire l'ovulation chez les cochettes pré-pubères, et sa capacité à remplacer des hormones d'extraction telles que le PG600.

Procédures

Tous les actes se feront sur animal vigile. Prélèvements de sang : 10 ml de sang seront prélévés, 1 fois par jour, pendant 11 jours (J1, J2, de J4 à J10, J14 et J16), soit un volume total de 110 ml par animal. Injection de produit : 1 fois par animal, en intra-musculaire. Echographie transabdominale : 9 fois par animal maximum sur 10 jours. Détection des chaleurs par introduction du verrat dans la stabule : 2 fois par jour pendant une semaine. Insémination artificielle : 2 fois par animal, 12H et 24H après la détection des chaleurs.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendus sont le stress lié à la manipulation des animaux, la douleur et les hématomes liées aux prises de sang, la douleur liée à l'injection intra-musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront abattus en fin de protocole. Les ovaires et l'utérus seront prélevés comptage de corps jaunes, et du nombre d'embryons totaux et viables.

Remplacement

L'efficacité de cette molécule a déjà été démontré chez la vache et la cochette pubère. Cette expérimentation vise à démontrer son éfficacité chez la cochette pré-pubère qui représente un état physiologique particulier, pour induire la première ovulation. Un modèle in vitro ou un autre modèle animal ne peuvent donc refléter l'état physiologique d'une cochette pré-pubère.

Réduction

Le nombre de cochettes nécessaire à l'expérimentation a éré calculé en fonction des résultats précédemment obtenus chez la génisse et la cochette pubère.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, et non en loge individuelle afin de limiter le stress. Un système de récompense est utilisé : elles recevront un aliment appétent après chaque acte (type smarties® ou de l'aliment pour porcelet). Les interventions seront réalisées par du personnel compétent, dans le calme avec récompense alimentaire et un suivi de l’état de l’animal sera mis en place dans les heures qui suivent. Ainsi, pendant le jour de la prise de sang, et un jour après, les animaux feront l'objet d'une surveillance particulière sur les points suivants : - Surveillance de comportements anormaux tels que la prostration, ou l’agressivité. - Surveillance d'apparition d'hématome sur les lieux de prélèvements : mise en place du suivi de la résorption de l'hématome. - Hyperthermie dans les 24h qui suivent les prélèvements : en cas de fièvre (+2°C) par rapport à la température de référence, un antalgique sera administré à l’animal. Notre procédure sera raffinée en minimisant nos interventions et en favorisant les interactions positives avec les animaux. Les animaux voient plusieurs fois par jour les animaliers qui surveillent attentivement leur comportement. Une phase de simulation, durant plusieurs semaines, de prise de sang est réalisée à la porcherie afin d’entrainer l’animal à coopérer pendant l’acte. Pour ce faire, nous distribuons du jus de pomme à la seringue tout en appuyant avec le doigt sur la zone de prélèvement. Le but recherché est d’apprendre à l’animal à assimiler zone de prélèvement/prélèvement et récompense. Le prélèvement est réalisé en moins d’une minute. Les prises de sang seront chronométrées et toute prise de sang non terminée au bout de 1 minute sera abandonnée. En cas d'apparition de fièvre, l'animal sera traité.

Choix des espèces

L'efficacité de cette molécule a déjà été démontré chez la vache et la cochette pubère. Cette expérimentation vise à démontrer son éfficacité chez la cochette pré-pubère qui représente un état physiologique particulier, pour induire la première ovulation. Une autre espèce ne peut donc pas être utilisée. Cette expérimentation vise à démontrer l'efficacité de notre molécule RPV dans l'induction de l'ovulation chez la cochette pré-pubère, d'où l'utilisation de cochette entre 135 et 150 jours d'âge.

Pour mettre sur le marché des agents qui font entrer de l'ADN et de l'ARN dans les cellules, des souris de 6 semaines reçoivent jusqu'à trois injections de ces produits, par voie sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intranasale. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques de leurs organes, après une à quatre prises de sang. Les produits peuvent provoquer des thromboses, des réactions inflammatoires ou des troubles de la démarche, alors que le porteur dit vouloir "valider l'activité et l'absence de toxicité des produits". Il justifie le choix de la souris par l'usage majoritaire de cette espèce dans les phases de recherche, et parce qu'elle "permet d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.

Bénéfices attendus

Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un ou plusieurs prélèvements sanguins (maximum 4) (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections (sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou intranasale). De plus ils subiront un ou plusieurs prélèvements sanguins. Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.

Tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 120 souris rendues dépressives vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole les expose pendant trois semaines à deux stress modérés par jour, puis mesure leur "comportement de désespoir" en les suspendant par la queue, deux fois à un mois d'intervalle. Après une chirurgie du crâne de deux heures, chacune vit seule, reliée par un câble au système d'enregistrement du sommeil, et subit deux privations de sommeil paradoxal. Quatre tests comportementaux sont annoncés pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, sans que le porteur précise lesquels, et le bénéfice attendu reste au conditionnel, de nouveaux traitements pour les 30 % de patients qui résistent aux antidépresseurs actuels.

Objectifs

La dépression est un trouble de l’humeur très répandu, 1 personne sur 5 en souffrira dans sa vie. Les mécanismes à l’origine de cette pathologie restent mal connus. Le sommeil paradoxal (SP) jouerait un rôle clef dans sa mise en place et son maintien, les patients dépressifs montrant des augmentations de SP, sans que l’on sache pourquoi. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier le SP dans un modèle de dépression chez la souris. Dans une précédente étude ex vivo, nous avons montré qu’il y avait une zone du cerveau (cortex rétrosplénial) qui présentait moins d’activation pendant le SP chez les souris une fois dépressives comparés aux contrôles. L’idée de ce projet est d’abord de vérifier les résultats déjà obtenus en enregistrant directement in vivo l’activité des neurones du cortex rétrosplénial pendant l’installation de la dépression des souris. Ensuite, nous voulons activer artificiellement les neurones du rétrosplénial pendant le SP puisqu'ils diminuent leur activité à cause de la dépression. Pour ce faire, nous utiliserons de l'optogénétique pour grâce à des stimulations lumineuses tenter de rétablir un phénotype contrôle chez des animaux dépressifs.

Bénéfices attendus

Le lien entre SP et dépression a été établi depuis plus de quarante ans. Il a ainsi été rapporté chez les patients dépressifs une augmentation des quantités de SP au cours de la nuit et du nombre de mouvements rapides des yeux caractéristiques à ce stade. Ces résultats ont été confirmés sur les modèles rongeurs de dépression. Nos résultats pourraient ouvrir des perspectives nouvelles en remettant au gout du jour l’impact délétère du SP dans la dépression, ouvrant également la porte au développement de nouveaux traitements plus ciblés dans un contexte où 30% des patients résistent aux antidépresseurs actuels.

Procédures

Les animaux transgéniques subissent un prélèvement du bout de la queue à 6 jour pour vérifier leur fond génétique, ce qui génère une légère douleur de très courte durée. Chirurgie/anesthésie et récupération postopératoire : Les animaux sont anesthésiés et des prototoles avec traitement anti-douleur pré et post-chirurgie sont prévus (Durée de la chirurgie : 2 heures). Privation et rebond (hypersomnie) de sommeil paradoxal : Permet d’obtenir plus de sommeil paradoxal sur une période de 2/3 heures. Deux privations/rebond sont prévues à un mois d’intervalle. Tests comportementaux : Pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, 4 tests comportementaux sont réalisés. Isolement durant le protocole : Les souris étant reliées par un câble au système d’acquisition sur ordinateur pour enregistrement les signaux de sommeil elles devront être logées dans des cages individuels pendant la durée du protocole. Modèle de dépression : Le modèle de stress utilisé permettant d’induire un état dépressif consiste en l’exposition des animaux pendant 3 semaines à deux stress modérés par jour. Suspension Tail Test : Effet stressant de courte durée (5 min) pour pouvoir mesurer le comportement de désespoir des animaux, symptôme essentiel de la dépression. Les animaux sont testés deux fois à un mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Premier effet indésirable concernant la chirurgie. Nous observons dans de très rares cas une hémorragie, une hypothermie très sévère ou une absence de réveil après une demi-heure de fin d’anesthésie. Les animaux sont suivis ensuite en post-op tous les jours et une fiche de score est remplie et si un animal montre des douleurs trop importantes il est mis à mort. Ensuite, concernant le protocole de dépression, nous n’attendons pas de dégradation sévère de l’état général des animaux. Néanmoins, face à des signes de souffrance physique évidents (automutilation, stéréotypie sévère, anorexie) les animaux sont mis à mort immédiatement. Branchement et câblage des animaux : les animaux sont « branchés » pendant toute la durée de l’expérience, via un câble qui s’insère sans difficulté dans l’implant localisé sur leur tête. Les animaux ne ressentent aucune douleur et le branchement ne nécessite pas de contention, puisque les animaux seront habitués à la manipulation. Le câble est relié à une plaque tournante au sommet de la cage, ce qui permet de suivre les moindres mouvements des animaux et un peu de mou est laissé pour que l’animal ne ressentent pas le poids du fil. Rebond et privation : il a été mesuré que la privation sélective de sommeil paradoxal n’entraînait pas de changement du sommeil lent des animaux. De plus, les dosages de corticostérone ont montré que les animaux n’étaient pas stressés après 48 heures de privation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront l’euthanasie pour collecter les cerveaux afin de réaliser des études d’immunohistochimies.

Remplacement

Les alternatives actuelles telles que la modélisation sur culture cellulaire ne sont pas encore suffisamment développées pour permettre une analyse poussée des phases de sommeil et des mécanismes neuronaux. De plus, nous proposons ici d’induire volontairement la dépression chez des souris avant de tenter de réverser le phénotype dépressif via les stimulations lumineuses de neurones transfectés avec des virus. Par conséquent, nous utiliseront ici des souris génétiquement modifiées pour analyser ces processus neurobiologiques complexes

Réduction

La détermination de la taille de l’échantillon nécessaire est absolument cruciale pour assurer la reproductibilité et la véracité des résultats ainsi obtenus. Des données préalablement obtenues dans l’équipe ont été utilisées pour calculer la variabilité interindividuelle des phénotypes dépressifs ainsi obtenus par protocole de stress chronique. Ce qui donne un total de 90 animaux.

Raffinement

Les animaux avant expérimentation sont hébergés dans des conditions optimales, 3 ou 4 par cage pour permettre des interactions sociales normales. Des enrichissements environnementaux systématiques sont mis en place pour améliorer leur bien-être, tel que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des bâtonnets de bois à ronger. Les conditions d’élevages, les soins post-traitements et les différentes étapes de la procédure sont contrôlés pour réduire ou éliminer toute détresse potentielle. De plus, nous avons récemment substitué à l’injection intrapéritonéale classiquement utilisée une ingestion orale volontaire (sans gavage) des molécules d'intérrêt à donner aux souris qui sont dissoutes dans de la gelée aromatisée à la fraise. Une fiche de suivi est également tenue pour chaque animal, depuis la chirurgie implantatoire jusqu’à l’euthanasie. Pour le bien-être de l’animal et pour les besoins d’analyse de l’expérience, le poids et l’état du pelage sont mesurés quotidiennement. Un animal qui dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales est retiré des échantillons expérimentaux et euthanasié sans délai.

Choix des espèces

Notre projet repose sur l’utilisation d’une lignée de souris doublement transgénique. Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour modéliser la dépression humaine étant donné la pertinence et similitude des symptômes observés. Le phénotype dépressif ainsi créé chez les animaux sont sensibles aux mêmes antidépresseurs que ceux utilisés chez les patients dépressifs. Cette combinaison de modèle de souris dépressive et transgénique constitue une approche innovante et puissante pour étudier les mécanismes physio-pathologiques complexes sous-jacents de la dépression. Nous utiliserons des animaux âgés de 8-10 semaines, puisqu’il s’agit de l’âge de référence le plus communément utilisé pour le modèle de dépression et le cycle veille-sommeil est mature chez ces jeunes adultes.

Toutes tuées pour prélever leur tumeur, 78 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses au flanc gauche fait pousser une tumeur pancréatique, suivie de trois séances d'ultrasons sous anesthésie et de trois injections intrapéritonéales d'immunothérapie, à raison d'une par semaine. Le porteur prévoit des mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine pendant trois mois au plus, et signale que des métastases pulmonaires provoqueraient un affaiblissement et des difficultés respiratoires. Il justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est la plus petite espèce dont les tumeurs deviennent assez grosses pour être traitées par ultrasons.

Objectifs

Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie cavitation + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 3 injections intrapéritonéales à raison d’une par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 3 injections sous cutanée d’antidouleur (30 secondes) à raison d’une par semaine– Autant de pesées que nécessaires seront réalisées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de trois par semaines aussi longtemps que nécessaire (3 mois maximum si traitement efficace).

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Si le modèle métastase, il entraînera une perte de poids et un affaiblissement chez les souris avec notamment difficultés respiratoires (si métastases aux poumons). Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine. Les ultrasons peuvent induire des pétéchies (présence de petites taches rouges sur la peau) dues à la cavitation, résorbées entre 2 traitements. Le traitement par immunothérapie n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris.

Devenir

Tous les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs.

Remplacement

Plusieurs informations ont été données via des études sur des sphéroïdes : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons, ce qui a permis de designer cette étude sur animal et de l’affiner. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Dans cette étude 78 animaux seront utilisés. L’utilisation de l’outil de calcul d’effectif de l’EDA (Experimental Design Assistant, NC3R) nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaire afin de conclure quant à l’efficacité de notre traitement. De plus, nous collecterons un nombre maximal de données par animal afin de répondre aux différentes questions de notre étude en utilisant le nombre d’animaux minimal mais suffisant.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles douleurs les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute ulcération, irritation ou nécrose des tumeurs, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera une crème localement sur 7 jours. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de score et via la palpation on administrera un antidouleur sur 48h. Si la douleur est toujours présente alors on mettra à mort les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux seront mis à mort. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Dans notre étude, elle est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.

Jusqu'à deux chirurgies crâniennes de une à cinq heures par animal, cinq semaines de restriction hydrique et trois mois de restriction alimentaire, pour 800 souris utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des électrodes implantées dans le cerveau enregistrent l'activité neuronale pendant que les souris cherchent une récompense en eau ou en nourriture, la tête parfois maintenue fixe près d'une source d'odeur. Le porteur signale que les souris modèles de la maladie d'Alzheimer utilisées ici présentent parfois des crises d'épilepsie. L'arrêt des séances est fixé par la dégradation des signaux enregistrés, en général au bout de trois mois, le porteur expliquant vouloir maximiser les données obtenues par animal.

Objectifs

La capacité de former des associations entre des stimuli sensoriels spécifiques et des informations vitales constitue une fonction centrale de la mémoire : elle permet à l’organisme d’adapter ses comportements en fonction de son vécu. L’odorat est une modalité sensorielle majeure chez les rongeurs, nécessaire à l’établissement de comportements cruciaux pour la survie de l’individu (alimentation, reproduction, interactions sociales…). La signification associée aux odeurs rencontrées, qui permet la production de comportements adaptés, est très souvent apprise par expérience. Notre projet a pour but d’identifier les substrats neurophysiologiques qui permettent la formation de traces mnésiques olfactives en conditions physiologiques et pathologiques. Il vise notamment à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale. Ces deux types de mémoire étant fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer (chez qui des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs) notre étude présente un intérêt pour la santé humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet qui vise à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale ainsi que les mécanismes neuronaux impliqués. Ces deux types de mémoire sont fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer et il a été montré que des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs associés à cette maladie. Ce projet apportera donc des éléments essentiels pour la compréhension du fonctionnement du cerveau en conditions normales mais aussi pathologiques. Une telle compréhension contribuera ainsi, sur le long terme, à améliorer la santé humaine dans nos sociétés vieillissantes.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence d’odeurs. Elles seront notamment entraînées à associer une odeur et une récompense ou bien une odeur et une trajectoire dans une arène. L’apport en eau ou en nourriture des souris entraînées sera contrôlé pour garantir leur motivation à réaliser les tâches. Cependant, les souris seront pesées quotidiennement (

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certaines souris seront soumises à des tests comportementaux de mémoire dans lesquels elles devront trouver une récompense hydrique. Dans ce cas, pour les motiver à effectuer ces tâches, la totalité de l'apport hydrique quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux. Dans un autre type de tâches, un apport de nourriture contrôlé permettra également d’augmenter la motivation des souris qui devront alors trouver des sources de nourriture appétitives dans l’arène de comportement. Le fait de ne pas avoir un accès libre à la nourriture ou à la boisson pendant une partie de la journée peut légèrement incommoder les souris. Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. L’identification et l’étude du rôle de certains sous-types de neurones nécessitera de faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés aussi au préalable. Le placement des implants et les injections cérébrales seront réalisés lors de chirurgies qui pourraient entraîner des douleurs légères sans anesthésie, analgésie et soins post-opératoires adaptés. Les souris pourront ensuite être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La contention qui en résulte peut stresser légèrement les animaux mais n’induit pas de douleur. Enfin, les souris modèles de la maladie d’Alzheimer, nécessaires à l’étude de la pathologie humaine, présentent parfois des crises d’épilepsie qui seront surveillées attentivement.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Ceci concerne les souris adultes dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : la formation des traces mnésiques olfactives à l’échelle du cerveau entier. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est en train d’apprendre : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. Pour ces raisons, il nous est impossible de conduire cette étude in vitro sur des cultures de neurones dissociés. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux requis (800 sur 5 ans) sera restreint grâce aux méthodes d’enregistrement utilisées qui permettent de collecter des données extrêmement riches en information (> 100 neurones enregistrés simultanément par session), plusieurs jours durant. Nous utiliserons cependant des études pilotes pour raffiner nos protocoles et ainsi éviter de collecter des données inexploitables (mauvaises coordonnées stéréotaxiques, variabilité comportementale…) tout en limitant leur variance. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires ne peut se baser sur une étude de puissance statistique car notre étude ne vise pas à comparer des groupes d’animaux, mais des neurones individuels via de nombreux tests indépendants. Le nombre d’animaux dépendra du nombre de neurones que nous réussirons à enregistrer à chaque expérience. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux expériences qu’ils vont rencontrer (notamment la contention et l’interaction avec l’expérimentateur pour éviter le stress). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères et des points limites définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. Ce modèle est d’autant plus pertinent que l’olfaction est une modalité sensorielle essentielle chez les rongeurs qui joue un rôle fondamental pour leur survie. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.

Les souris dont la glycémie dépasse 500 mg/dl ou tombe sous 65 mg/dl sont mises à mort, comme celles qui cumulent plus de trois signes sur la grille de douleur du laboratoire. 2 928 souris vont être utilisées, toutes tuées pour examen du pancréas, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées et un régime riche en graisse destiné à provoquer un diabète, puis subissent un jeûne de cinq heures suivi de six ponctions sanguines à la queue étalées sur deux heures. Le porteur qualifie ce diabète de "très modéré" et attribue la nuisance principale aux piqûres, sans détailler le calcul qui aboutit à près de trois mille animaux.

Objectifs

Le diabète résulte de la destruction des cellules fabricant l'insuline dont le rôle est de diminuer le taux de sucre sanguin. Cela conduit une augmentation du taux de sucre sanguin qui peut avoir de graves conséquences. Les traitement actuels consistent en l'injection d'insuline mais le maintien du taux de sucre sanguin n'est pas optimal. Il faut donc développer de meilleurs thérapies. Dans ce but, nous avons identifié des gènes qui induisent la régénération des cellules productrices d'insuline, ce qui est d'intérêt pour les patients diabétiques. Cependant, ces résultats obtenus sur cellules doivent être validés sur l'animal en condition normale mais aussi en condition de diabète (induit par un régime riche en graisse).

Bénéfices attendus

Ce projet se propose de déterminer si nos gènes pourraient induire une augmentation du nombre de cellules beta pancréatiques chez l'animal. Il est clair qu'un tel résultat représenterait un bénéfice d'importance pour les personnes atteintes de diabète chez qui ces cellules sont manquantes (ce qui conduit au diabète).

Procédures

Les animaux recevront des injections (chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre le taux de sucre sanguin des animaux (1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures du taux de sucre sanguin) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer un diabète très modéré (légère hyperglycémie). La source principale de nuisance est reliée aux piqures des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie ayand plusieurs orgines (génétiques mais aussi environementales). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible (calculé grâce à des tests statistiques) mais permettant l’obtention de résultats exploitables sans besoin de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis afin d’évaluer d’éventuelles souffrances. L'expérience serait immédiatement arrétée en cas de souffrance mesurée comme suit: -Déplacement difficile -Diminution du comportement exploratoire Posture inhabituelle (dos vouté, prostration) -Agressivité -Amaigrissement > 10% du poids initial -Aspect du poil (piqué, hérissé, mal entretenu) -Déshydratation -Agressivité à la manipulation - Glycémie: >500 ou

Choix des espèces

Ce projet a pour but de déterminer les effets de plusieurs gènes dans le pancréas. Il est donc essentiel d'utiliser la souris comme modèle intégré. 3 ages seront évalués : 1, 3, 6 mois après la naissance. Ces âges furent sélectionnés afin de représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes, matures, âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter nos observations dans ces animaux.