Procédures modérées

Un peptide est injecté directement dans le cerveau de 9 360 souris sous anesthésie gazeuse pour y induire des symptômes de la maladie d'Alzheimer, suivi d'injections quotidiennes pendant un à sept jours. Ces souris passent ensuite dix-huit jours de tests de mémoire, dont un ou deux tests d'évitement passif reposant sur une stimulation électrique appliquée aux pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le cerveau et procéder à des analyses biochimiques. Le résumé décrit pourtant ces souris comme ayant "des pertes de mémoire mais qui n'impactent pas la qualité de vie des animaux dans leur lieu d'hébergement".

Objectifs

La mise au point d’un traitement contre la maladie d’Alzheimer constitue aujourd’hui un enjeu majeur. Toutefois, en raison de la complexité de cette pathologie, il est largement admis qu’une approche thérapeutique ciblant un seul mécanisme ne suffira pas. Dans ce contexte, nous nous attachons à identifier de nouvelles molécules présentant un fort potentiel neuroprotecteur. Il est donc essentiel d’évaluer l’efficacité de ces molécules dans un modèle in vivo de la maladie d’Alzheimer, en vue d’une future application clinique. Pour ce faire, un modèle murin pharmacologique sera utilisé : les animaux recevront les molécules, seules ou en association, pendant une durée de sept jours. Leur mémoire sera ensuite analysée à l’aide de tests comportementaux adaptés.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur un modèle aigu prédictif de la MA, avant de plus longues expérimentations sur un modèle transgénique, pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules de nouvelle génération active seule ou en combinaison pour une action modifiant de façon durable le décours de la maladie.

Procédures

Les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection intracérébroventriculaire du peptide. Cette procédure dure environ 7 minutes entre le début de l’anesthésie et la fin de l’injection. Pendant une durée de 1 à 7 jours, les animaux recevront ensuite une administration quotidienne des molécules à tester par injection intrapéritonéale ou par voie orale. À l’issue du traitement, les fonctions de mémoire seront évaluées au moyen de tests comportementaux (10 jours). Les animaux réaliseront notamment 1 à 2 tests d’évitement passif, d’une durée de 5 minutes maximum chacun. D’autres tests comportementaux complémentaires pourront également être réalisés afin d’évaluer la mémoire à court et long terme (18 jours au total).

Impact sur les animaux

Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer (MA). Cette procédure sera suivie par une ou plusieurs injections systémiques, ce qui pourra engendrer du stress chez l'animal. Par ailleurs, le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'une stimulation électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris. Ces animaux ont des pertes de mémoire mais qui n'impactent pas la qualité de vie des animaux dans leur lieu d'hébergement. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés pour prélèvement des tissus d'intérêt.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

Les molécules sont d'abord testées (et donc sélectionnées) in vitro sur des modèles de culture cellulaire ou sur des larves de poisson zèbre. Seules les moléculesayant montré une efficacité sont ensuite sélectionnées pourune évaluation in vivo. L’utilisation de modèles murins de la Maladie d'Alzheimer reste néanmoins indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la maladie dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les molécules sont testées sur une gamme limitée de doses définie selon les résultats antérieurs du laboratoire pour chaque type de composé. Les animaux passent plusieurs tests comportementaux afin d’évaluer différentes formes de mémoire chez un même individu . Les tests sont organisés du plus simples au plus contraignant. Les analyses statistiques validées par un logiciel de calcul de puissance sont ajustées pour limiter le nombre d’animaux, avec en général 12 souris par groupe.

Raffinement

Nous procéderons à un enrichissement limité du milieu, car un enrichissement trop important peut interférer avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront uniquement accès à des copeaux de carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la construction d’un nid. Les animaux seront également manipulés quotidiennement afin de favoriser leur habituation à la présence de l’expérimentateur et de diminuer le stress lié aux manipulations. Leur état de santé et leur bien-être feront l’objet d’un suivi quotidien tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le modèle utilisé chez la souris permet de reproduire rapidement certains troubles de la mémoire observés dans la maladie d’Alzheimer et d’obtenir des résultats préliminaires utiles avant des études plus approfondies sur d’autres modèles de recherche. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, âge auquel les troubles de la mémoire et les modifications biologiques recherchées sont les mieux caractérisés dans ce modèle.

688 souris sont hébergées à des températures dérogatoires, 344 pendant 24 heures et 344 pendant sept jours, la moitié d'entre elles seules dans leur cage. 864 subissent en plus un prélèvement sanguin éveillées, dans un ensemble de 1 032 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur graisse brune, l'objectif déclaré étant de savoir si une protéine des macrophages, TRPV4, leur permet de détecter la chaleur produite par ce tissu. Sur le remplacement, le porteur écrit que les cultures cellulaires ne reproduisent pas "les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune", et en conclut que seul le recours à des souris vivantes répond à la question.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présentes partout dans notre corps. On les connaît surtout pour leur rôle de « nettoyeurs » : ils éliminent les microbes, les cellules mortes et les déchets. Mais, ils ont aussi des fonctions beaucoup plus spécialisées selon l’endroit où ils se trouvent dans l’organisme. Dans la graisse brune (un type de graisse qui sert à produire de la chaleur et à brûler de l’énergie, surtout quand il fait froid) les macrophages jouent un rôle important. Ils aident à contrôler les nerfs qui activent cette graisse et influencent ainsi la capacité du corps à produire de la chaleur et à gérer son énergie. Cependant, une question reste ouverte : ces macrophages sont-ils capables de détecter eux-mêmes la chaleur produite par la graisse brune ? Des analyses ont montré qu'ils possèdent une protéine appelée TRPV4, connue pour être sensible à la chaleur. Le but de ce projet est donc de comprendre si cette protéine permet aux macrophages de « sentir » la chaleur produite par la graisse brune et d’influencer la capacité du corps à gérer son énergie et à maintenir sa température lorsque l’organisme est exposé au froid.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre des fonctions encore peu connues des macrophages, au-delà de leur rôle habituel de "nettoyeurs". Il aidera aussi à mieux comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement de la graisse et la gestion de l’énergie par le corps. À plus long terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches pour améliorer la santé métabolique et lutter contre certaines maladies comme l’obésité ou le diabète.

Procédures

688 animaux seront hébergés à des températures dérogatoires pendant 24h (344 souris) ou 7 jours (344 souris) dont la moitié sera hébergée individuellement (172 souris pendant 24h et 172 souris pendant 7 jours). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur 864 animaux vigiles.

Impact sur les animaux

L’exposition au froid induit un stress physiologique et une augmentation de la dépense énergétique qui entraîne une hausse de la prise alimentaire. L’isolement social peut induire un stress. Les prises de température peuvent induire un stress léger et un inconfort transitoires. Le prélèvement sanguin provoque une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever la graisse brune dans le but de l’analyser.

Remplacement

Les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre le rôle des macrophages dans la régulation de la production de chaleur par la graisse brune, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune et entre les différents organes.

Réduction

Nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Nos visites quotidiennes permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le rôle des macrophages dans le tissu adipeux et nous disposons déjà du modèle de souris permettant d’enlever TRPV4 dans les macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Il s’agit donc de l’espèce la plus appropriée pour ce projet. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).

Injectées une fois par jour pendant dix jours, contenues à chaque administration, pesées deux fois par semaine, 6 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite les tests moteurs, poutre, rotarod jusqu'à 40 tours par minute et agrippement, puis l'open field pendant trente minutes et cinq minutes de nage forcée, chacun précédé d'une nouvelle injection. Sept jours d'hébergement individuel en cage calorimétrique, sans enrichissement, closent le protocole avant la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur écrit que le nombre de souris "est réduit à son minimum" et le rattache à la littérature et à sa propre expérience, sans donner de calcul pour ces 6 780 individus.

Objectifs

La perte d’appétit, pouvant aller jusqu’à l’anorexie, est un problème fréquent dans de nombreuses situations de maladie ou après des épisodes de stress physique ou psychologique importants. Elle peut entraîner une perte de poids, une fatigue marquée et une dégradation de l’état général, rendant le rétablissement plus difficile. Ce phénomène constitue aujourd’hui un enjeu important pour la santé. Le projet vise à étudier l’effet de différentes substances capables d’agir sur ces mécanismes biologiques de faim, afin de mieux comprendre comment l’appétit et l’équilibre énergétique peuvent être influencés. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour limiter la perte d’appétit et améliorer l’état nutritionnel dans des situations de maladie sévère.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Il permettra d’identifier et de comparer des substances susceptibles de moduler ces paramètres, et de sélectionner les candidats présentant les profils d’efficacité et de tolérance les plus favorables.

Procédures

Injections (10 max par souris; 1 fois par jour pendant 10 jours; durée

Impact sur les animaux

Administrations (injections et contention quotidienne) : peuvent provoquer une douleur légère au point d’injection et un stress transitoire lié à la manipulation, sans chirurgie ni anesthésie générale. Variations de prise alimentaire induites par les composés : peuvent entraîner des fluctuations du poids corporel (jusqu’à une perte de poids significative) avec possible altération transitoire de l’état général (baisse d’activité, pelage altéré, posture inhabituelle). Tests locomoteurs, moteurs et comportementaux : peuvent induire un stress aigu et transitoire lié à l’environnement nouveau et à l’effort demandé. Calorimétrie indirecte : l’hébergement individuel et l’absence d’enrichissement pendant l’enregistrement peuvent générer une gêne/anxiété transitoire liée à l’isolement.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Pour étudier de manière intégrée la prise alimentaire, le poids corporel, le comportement et le métabolisme énergétique, un modèle souris est indispensable. La souris est le modèle le plus pertinent pour cette étude, car elle présente des similitudes avec la physiologie humaine et constitue une référence largement utilisée dans les travaux sur la régulation métabolique.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et aux bonnes pratiques de l’établissement utilisateur. Ils sont maintenus en cages collectives de même sexe, avec un accès ad libitum à une alimentation standard et à l’eau, en dehors des contraintes strictement nécessaires à certaines procédures expérimentales. L’environnement est systématiquement enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, favorisant l’expression des comportements naturels et contribuant à la réduction du stress. Une période d’acclimatation est respectée avant toute intervention expérimentale. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des procédures, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Les critères surveillés incluent le comportement, l’activité spontanée, l’aspect du pelage, la posture, la mobilité et la respiration. Des points limites précoces et prédictifs, spécifiques à chaque procédure, ont été définis et appliqués de manière stricte afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique, en raison des similitudes fonctionnelles avec la physiologie humaine et de la sensibilité de la souche C57BL/6 aux variations nutritionnelles. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge. À ce stade, ils ont atteint la maturité physiologique et métabolique, garantissant la robustesse des mesures expérimentales et limitant l’impact de la croissance sur l’interprétation des résultats.

Les molécules testées sont celles de clients, administrées aux doses que ces clients ont fixées : 2 100 souris et 2 800 rats, 4 900 au total, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang. Une hypertension et une hypertrophie cardiaque leur sont provoquées par un régime gras et salé ou par perfusion de substances, puis les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre mois au plus. Des pompes et des capteurs de pression sont implantés au cours de chirurgies de dix à vingt minutes, souris et rats passent 40 heures en cage individuelle sans enrichissement puis 24 heures en cage à métabolisme sur grille, et courent sur tapis roulant sous stimulation électrique. Les mesures terminales se font par pose d'un cathéter dans la carotide, sous anesthésie et sans réveil, au service d'une prestation préclinique vendue à des commanditaires extérieurs.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité mondiale, il est primordial de poursuivre la recherche dans ce domaine afin d’identifier et d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. Les atteintes cardiovasculaires peuvent se présenter sous de nombreuses formes (anomalies de la fonction cardiaque, de la structure du cœur) et sont dépendantes de nombreux facteur de risque : l’âge, le sexe, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, le tabagisme, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.

Bénéfices attendus

Pour l’essentiel, la prise en charge des patients consiste à traiter les symptômes et les complications associées ainsi que la mise en œuvre de mesures concernant l’hygiène de vie des patients (alimentation, arrêt du tabac, activité physique). Malheureusement, cela peut s’avérer inefficace. Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, afin de comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.

Procédures

L’hypertension et de l’hypertrophie cardiaque seront induites chez des rats hypertendus avec ou sans régime spécifique (gras, riche en sel) ou par infusion de molécules pharmacologiques. Les composés à tester seront administrés, sur une durée maximum de 4 mois, une à deux fois par jour. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 minutes sous couverture analgésique). Si le projet requiert des mesures de pressions sur animaux vigiles et/ou sur des périodes de plusieurs heures, des capteurs de pressions seront chirurgicalement implantés (chirurgie de 15-20 minutes sous couverture analgésiques) et un suivi post-opératoire sera mis en place. Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés à maximum 4 reprises (2 minutes). Les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (7 mesures du taux de sucre dans le sang après administration de sucre et ce à 4 reprises pendant le projet). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement (contact visuel mais pas olfactif et auditif). Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis le test sera effectué sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures, isolé sur grille). Au maximum, ces examens seront effectués avant la phase d’induction, à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements soit 4 fois. Il aura 2 examens sous anesthésie par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.

Impact sur les animaux

Selon le modèle, une dysfonction cardiovasculaire sera induite plus ou moins rapidement et va engendrer chez les animaux des nuisances. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), modification des prises hydriques et alimentaires (perte de poids et déshydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Dans certains cas, les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse et ou en sel. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : hypertension artérielle, obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 4 mois, 1 à 2 fois par jours) et les prélèvements de sangs peuvent engendrer un stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère (stimulation électrique). Les mesures de dépense énergétique et télémétrique imposent un isolement qui engendre un stress. L’induction par infusion d’agents pharmacologiques (pour l’induction de la pathologie ou du traitement) nécessite l’implantation sous-cutanée d’une mini-pompe ; les mesures de pressions sur animaux vigiles requièrent la mise en place d’un capteur et d’un émetteur. Dans les 2 cas, la mise en place de ces 2 dispositifs se fera au cours d’une intervention chirurgicale et entrainera une convalescence des animaux les jours suivant les interventions.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés grâce à des marquages histologiques, des analyses d’expression de gènes ou protéines dans le coeur, de paramètres cardiovasculaires et de la fonction rénale dans le sang...).

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause de sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après répartition à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime ou par agents pharmacologiques, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.

Raffinement

Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), nous nous scorerons son état selon la grille de score spécifique (en pièce jointe). Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une blessures cutanées un protocole de soin sera effectué (désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Lors de la procédure, des mesures non invasives de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques d'imagerie. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles, une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré, per et post-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe, doppler, …). Le choix de l'espèce se fera en fonction des physiopathologies développées dans chacune des 2 espèces, des caractéristiques connues (publications, projets ultérieurs), des cibles thérapeutiques et des validations pharmacocinétiques, de la nature du traitement testé. L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.

Quarante-cinq minutes de neurochirurgie pour 800 souris, quatorze injections directement dans le cerveau pour 480 d'entre elles : 2 980 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Un régime gras leur est imposé, avec une prise de poids que le porteur estime ne pas devoir dépasser le double du poids initial, alternée avec des jeûnes de 4 ou 24 heures et un hébergement individuel quand la prise alimentaire doit être mesurée souris par souris. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans l'obésité, les pistes thérapeutiques étant renvoyées au long terme et "si les résultats obtenus vont dans ce sens". 1 200 souris passent des tests comportementaux de mesure de l'anxiété, de dix à quarante minutes, dont le résumé ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés du cerveau. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime qui déclenche l’obésité.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire présentes dans le cerveau participent au développement de l’obésité et des troubles du métabolisme en réponse à une alimentation riche en calories. Ils aideront également à mieux caractériser les phénomènes d’inflammation dans cette région du cerveau. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour agir sur ces cellules et ainsi limiter ou prévenir les troubles métaboliques, si les résultats obtenus vont dans ce sens.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 3220. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 800. 3) Test de tolérance au glucose sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min, répétée 2 fois. Nombre d’animaux : 800. 4) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : 1 ou 14. Nombre d’animaux : 480 pour le groupe « 14 fois » et 160 pour le groupe « 1 fois ». 5) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1280. 6) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 1200.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques sur le poids, et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro afin de tester les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. La production d’animaux transgéniques est rationalisée en choisissant un schéma d’accouplement permettant de n’obtenir que des animaux dont les génotypes ont un intérêt pour le projet. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec de tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat de dégradation du bien-être /souffrance des animaux. 2) L’evaluation de la prise alimentaire necessite parfois l’hébergement des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochees au maximum les unes des autres. 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal. 4) Des points limites appropries ont ete definis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée, anatomique, physiologique, comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, il sera mis en place des mesures conservatoires et des critères d’arrêt des souffrances, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le metabolisme glucidique sont depuis longtemps etudies chez la souris, qui represente donc une espece adaptee a ce type d’etudes. De tres nombreux modeles d’obesites ont ete developpes chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximite biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modele predictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, la neuroinflammation hypothalamique induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes lors des procédures. Elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie (3-4 semaines pour les souris transgéniques ; 7 semaines pour les autres), mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Les souris seront à un stade post- puberté (hormones sexuelles stables). De plus, cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance.

Pour tester si un chélateur pris par voie orale élimine mieux le plutonium que le traitement actuel par injection, 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour mesurer le plutonium retenu dans leurs tissus. 112 d'entre eux reçoivent le plutonium par instillation dans la trachée sous anesthésie, 70 par injection, et 16 subissent dix-huit gavages, trois fois par semaine pendant six semaines. 142 rats séjournent seuls en cage à métabolisme, sur grille et sans litière, de un à trois jours par séjour et jusqu'à trois séjours pour certains, pour la collecte de leurs urines et de leurs selles. Le porteur attend une irritation de la trachée et une altération des cordes vocales après l'instillation, et écrit que le bénéfice pour les travailleurs du nucléaire contaminés "pourrait être à moyen terme".

Objectifs

En France, le plutonium (Pu) formé au sein d’un réacteur nucléaire est extrait du combustible d’uranium (U) usagé, pour le recycler dans un nouveau combustible mêlant U et Pu. Lors du procédé, des travailleurs peuvent accidentellement inhaler ce Pu en cas de rupture de confinement. La rétention corporelle d’un tel métal radiotoxique conduit alors à un risque sanitaire, comme le développement d’un cancer pulmonaire à long terme. Afin de limiter celui-ci, la seule stratégie est de stimuler la décorporation du Pu, c’est-à-dire de limiter ses dépôts tissulaires et favoriser son élimination corporelle. Pour cela, le complexant DTPA est administré chez le patient contaminé, afin qu’il se lie au Pu et l’élimine facilement et rapidement par les voies naturelles. Néanmoins, un tel traitement est perfectible : le DTPA a une action limitée, et son mode d’administration par intraveineuse est souvent incompatible avec un traitement répété au long cours qui s’avère parfois nécessaire. L’objectif général des études est d’améliorer ce traitement de décorporation des travailleurs du nucléaire ayant accidentellement été exposés à des composés de Pu. Aux Etats-Unis, une forme orale du complexant LiHOPO est en cours d’essais cliniques. Précisons qu’une autorisation de mise sur le marché américain d’un tel médicament prouvera son potentiel intérêt, mais ne permettra pas d’obtenir son autorisation ou sa disponibilité sur le marché français. Par ailleurs, alors que l’exposition pulmonaire au Pu est l’une des deux voies principales rencontrées chez le travailleur du nucléaire, les études pré-cliniques américaines n’ont pas testé l’efficacité du LiHOPO dans ce contexte. L’objectif du présent projet est d’évaluer l’intérêt d’une prise orale de LiHOPO dans le traitement de décorporation d’une exposition pulmonaire au Pu, en comparaison du traitement actuel par le DTPA. Différents protocoles de traitements devront être testés pour simuler des situations de prise en charge médicale ou des protocoles décorporants déjà appliqués chez l’être humain, et pour aider à interpréter les observations faites chez les travailleurs traités suite à ces protocoles. Les expérimentations seront menées chez le rat, un modèle animal pertinent qui a alimenté une grande part des précédentes études de décorporation du Pu menées depuis des dizaines d’années. De plus, il est désormais connu que les observations faites chez le rat le sont également chez l’être humain traité au DTPA après exposition au Pu.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de savoir si la prise orale de LiHOPO peut être envisagée pour améliorer le traitement de décorporation de travailleurs du nucléaire exposés au Puou pour la population générale en cas d’exposition suite à un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Dans le premier cas, le bénéfice pourrait être à moyen terme. Ils permettront également de mieux définir les compartiments biologiques, i.e. extra- ou intracellulaires, où a lieu la chélation du Pu par le LiHOPO.

Procédures

-70 rats seront exposés au plutonium en systémique par injection, sous anesthésie gazeuse (1X,

Impact sur les animaux

Après l’exposition pulmonaire des rats au plutonium en passant par la trachée, une irritation de la trachée, une altération des cordes vocales, une perturbation passagère de la ventilation pulmonaire le temps que le liquide soit absorbé par le tissu pulmonaire peuvent être observées. Il est possible que les sites d’injection soient transitoirement et légèrement douloureux après le réveil des animaux. Néanmoins, cela n’a pas d’impact visible sur leur comportement, prise alimentaire, etc. Les rats hébergés en cage à métabolisme comme en cage conventionnelle évoluent sur une grille et non sur une litière traditionnelle pour rongeurs, pouvant entrainer un inconfort de la marche voire des lésions aux pattes, ce qui n’a jamais été observé jusqu’alors. Un stress des animaux est attendu lors de : -leur manipulation lorsqu’ils sont conscients et vigiles, -leur anesthésie (manipulation + hypothermie) préalable aux actes réalisés lors de leur phase d’inconscience, -leur changement de condition d’hébergement

Devenir

Afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur la rétention en plutonium dans les différents tissus, un prélèvement de ces tissus est prévu ; nécessitant l’euthanasie des rats.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sont très utiles pour sélectionner et comparer des complexants qui ont un potentiel d’efficacité pour complexer le plutonium. Des études préliminaires au présent projet seront effectuées sur du sérum commercial pour choisir les doses en LiHOPO à tester, comparativement à la dose en DTPA recommandée chez l’être humain, avant les essais chez l’animal. Néanmoins, une expérimentation in vivo est la seule qui puisse apporter une réponse quant au potentiel décorporant des complexants. En effet, les modèles in vitro ne miment pas la complexité des milieux biologiques, etl’élimination corporelle. Par ailleurs, la biodisponibilité orale du complexant, c’est-à-dire son passage dans le sang, aura une grande importance, ce qui implique le besoin d’une système digestif entier. Le projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal .

Réduction

Les précédentes études du laboratoire montrent que des groupes de 8 rats sont nécessaires pour prouver l’efficacité d’un traitement sur la charge pulmonaire en un métal, après exposition pulmonaire à ce métal. avec des résultats statistiquement valables. Concernant les rats exposés au plutonium puis traités par la même voie d’administration intraveineuse, l’effet du traitement se mesurera essentiellement sur la prévention de la charge osseuse en plutonium. Une analyse statistique détermine que des groupes de 5 animaux permettront de révéler une diminution de la charge osseuse en plutonium.

Raffinement

L’instillation intratrachéale (pour administration pulmonaire) et le gavage gastrique (pour administration orale) seront effectués chez des rats pendant leur phase d’inconscience suite à leur exposition à un gaz anesthésiant pour : i) prévenir leur inconfort/sensibilité à la douleur, ii) assurer la reproductibilité de la localisation et de la dose délivrée en cobalt ou expectorant, iii) pour la radioprotection des opérateurs. Ces gestes sont maitrisés au laboratoire et ont apporté leurs preuves pour le confort des rats, comme pour la qualité des résultats. Avant de privilégier le gavage gastrique pour la prise orale des expectorants, des tests d’habituation pour une prise orale volontaire en usant d’un composé appétant ont été effectués. Lors d’un essai dans notre laboratoire, il a été constaté que cette technique était efficace tant que le complexant n’était pas mélangé au composé appétant considéré (sirop de banane). Le gavage gastrique a donc été retenu et sera employé. Il n’est pas traumatique pour l’appareil digestif. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme pendant 3 jours consécutifs maximum, ceux-ci pouvant se voir (cage de plastique transparent), s’entendre et se sentir. Une observation quotidienne et une pesée régulière (2X par semaine) des rats seront effectuées pour soulager au plus tôt une éventuelle souffrance avec traitements analgésiques/anti-inflammatoires. Pour estimer objectivement le niveau de souffrance, différents critères seront considérés et évalués selon une grille de scores qui est « ouverte » dès l’apparition d’un premier signe d’inconfort chez un rat.

Choix des espèces

Le rat est retenu pour nos études du fait de la richesse de la littérature dans le domaine de l’exposition à des métaux radioactifs chez cette espèce de rongeur. Sa taille, permet des prélèvements biologiques suffisants pour obtenir des niveaux de métaux mesurables. Les rats en expérimentation seront des animaux adultes, livrés à l’âge de 6 à 8 semaines, et utilisés aux âges de 7 à 9 semaines. Ces choix sont liés à la taille de l’animal, qui reste un compromis entre des poumons suffisamment gros pour tolérer au mieux l’instillation intratrachéale, et une taille des animaux qui n’induit pas un inconfort lors de leur hébergement en cage à métabolisme.

Une ou deux injections et une prise de sang sur souris éveillées, puis deux injections sous anesthésie générale : 672 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le résumé annonce une étude de l'arthrose du genou sans décrire comment la maladie est provoquée, et signale que les injections peuvent entraîner un saignement, un gonflement de l'articulation et, plus rarement, une infection articulaire avec boiterie. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'il est "indispensable de réaliser des études in vivo", les cultures cellulaires ne reproduisant pas selon lui les interactions entre cartilage, os, ligaments et tissu synovial. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever l'articulation du genou et l'analyser.

Objectifs

L’arthrose est une maladie des articulations liée à l’usure progressive du cartilage avec le temps. L’arthrose du genou concerne des millions de personnes dans le monde et constitue l’une des principales causes de douleurs chroniques et de perte de mobilité. Aujourd’hui, les traitements disponibles permettent surtout de soulager la douleur et d’améliorer la qualité de vie, mais ils ne ralentissent pas réellement l’évolution de la maladie. Lorsque l’arthrose devient très sévère, la pose d’une prothèse totale du genou est souvent la dernière solution. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes de la maladie afin de développer des traitements capables de prévenir son apparition ou de freiner sa progression. L’arthrose du genou ne se limite pas à l’usure du cartilage. Elle s’accompagne également de changements dans le tissu synovial, un tissu qui tapisse l’intérieur de l’articulation et produit le liquide nécessaire à son bon fonctionnement. Une inflammation légère mais persistante de ce tissu semble jouer un rôle important dans le développement et l’aggravation de la maladie. Parmi les cellules présentes dans le tissu synovial, des cellules du système immunitaires appelées macrophages occupent une place centrale. Ces cellules participent normalement à la protection et à l’entretien des tissus. Cependant, dans l’arthrose, elles peuvent produire des substances favorisant l’inflammation et la dégradation du cartilage. Des recherches récentes ont montré qu’il existe plusieurs types de macrophages dans le tissu synovial. Deux grandes familles de macrophages ont été identifiées dans la membrane synoviale. La première forme une couche protectrice à la surface du tissu synovial. Ces cellules semblent contribuer à maintenir l’équilibre de l’articulation et à limiter l’inflammation. La seconde famille, appelée macrophages interstitiels, est située plus en profondeur dans le tissu synovial. Cependant, on sait encore très peu de choses sur la localisation exacte, le comportement et les fonctions de ces macrophages interstitiels dans l’arthrose du genou. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces macrophages dans le développement de l’arthrose du genou chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires, appelées macrophages interstitiels synoviaux, dans le développement de l’arthrose du genou. En étudiant leurs caractéristiques et leur fonctionnement au sein de l’articulation, nous espérons découvrir de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement de la maladie. Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles pistes de traitement ciblant plus précisément l’inflammation présente dans l’articulation. A terme, cette meilleure compréhension de la maladie pourrait contribuer au développement de thérapies innovantes capables de ralentir la progression de l’arthrose, voire de prévenir les dommages articulaires avant qu’ils ne deviennent irréversibles.

Procédures

672 animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1 ou 2 injections (20 secondes chacune) et un prélèvement sanguin (30 secondes) sur animaux vigiles ainsi que 2 injections (10 secondes chacune) réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les injection et les prélèvements sanguins peuvent provoquer une douleur légère. Les injections peuvent occasionner une hémorragie se manifestant par une saignement et/ou un gonflement localisé de l’articulation, susceptible d’entraîner une douleur modérée transitoire. Dans de rares cas, une infection articulaire peut survenir. Les signes cliniques associés incluent une boiterie, de la rougeur et un gonflement de l’articulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever l’articulation du genou dans le but de l’analyser.

Remplacement

Pour comprendre le rôle des macrophages dans l’arthrose, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents tissus de l’articulation (cartilage, os, ligaments et tissu synovial) ainsi que les différents types de cellules qui les composent.

Réduction

Nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Nos visites régulières (au moins 3 fois par semaine) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le rôle des macrophages dans l'arthrose du genou et nous disposons déjà du modèle génétique murin permettant de cibler ces cellules. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).