Procédures modérées

Réutilisés d'une étude à l'autre sur accord du vétérinaire, 120 mini-porcs portent un émetteur de télémétrie implanté à demeure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'implantation dure de trois à cinq heures, une heure de plus si une chambre vasculaire est posée, et peut être refaite pour repositionner un cathéter. Chaque animal est ensuite isolé six à huit jours après chaque chirurgie, mis à jeun jusqu'à trente heures, porte parfois un gilet à minipompe pendant vingt-quatre heures et reçoit les candidats médicaments par voie orale, veineuse, cutanée ou intrapéritonéale. Le protocole suit les demandes des fabricants, et le porteur décrit ce passage par l'animal comme une "étape indispensable" avant les premières administrations à des humains.

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le mini-porc éveillé, en utilisant un dispositif électronique permettant la mesure et l’enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, une chirurgie initiale est prévue afin d'implanter de manière définitive ce dispositif électronique. Les enregistrements se font dans les pièces d'hébergement, sur des animaux libres de leurs mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires sur le système cardiovasculaire. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Dans ce projet les animaux pourront être soumis à deux types de chirurgie sous anesthésie générale : une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie (dispositif permettant la mesure des paramètres cardiovasculaires), et parfois une chirurgie d'implantation de chambre vasculaire (dispositif permettant l'administration intraveineuse de produit, ou la réalisation de prélèvements sanguins). La durée de ces interventions sera d'environ 3h à 5h pour l'implantation de l'émetteur en fonction des paramètres mésurés, plus 1h supplémentaire en cas d'implantation de chambre vasculaire. En cas de besoin, l'animal pourra être soumis à une nouvelle chirurgie pour repositionner le cathéter de l'implant ou de la chambre vasculaire, voir pour changer la chambre (durée 1h environ). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes). Et si l’administration se fait par une perfusion de longue durée (supérieure à 1h), les animaux porteront des gilets (avec une minipompe embarquée) pendant maximum 24h. Ainsi, les effets sur les paramètres cardiovasculaires seront évalués. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa pièce d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Des prélèvements sanguins, sans anesthésie, pourront être effectués durant les phases expérimentales (moins de 2min par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux pour induire l'anesthésie, administrer le produit ou réaliser les prélèvements sanguins peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés à une ou plusieurs reprises, pour l'implantation de l'émetteur de télémétrie, et dans certains cas, de la chambre vasculaire. Ces chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, une analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8 jours après chaque chirurgie). Cet hébergement individuel engendrera un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'hébergement individuel permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Par ailleurs, les animaux seront mis à jeun avant les chirurgies, et parfois avant l'administration du produit à tester. Cette période de jeun durera au maximum 30h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courte durée. Enfin, les effets potentiellement indésirables provoqués par le candidat médicament à tester font l'objet d'échanges avec les fabricants du candidat médicament afin d'adapter les outils d'observation des animaux, pour anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude du même projet ou dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré, après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le mini-porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires de ces candidats médicaments. Or, avant toute utilisation chez l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le mini-porc est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle car il présente un système cardiovasculaire proche de celui de l'homme.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (n=4 à 8 par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences, et d’effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, •l'utilisation de la télémétrie sans fil (animal libre de ses mouvements pendant les phases d'enregistrement), • la validation du système de télémétrie et la validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • l'utilisation d'une chambre vasculaire permettant des prélèvements sanguins sans une restriction physique importante • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Le mini-porc est une espèce animale adaptée et couramment utilisée pour évaluer les effets cardio-vasculaire d'un candidat médicament car son système cardiovasculaire est physiologiquement et anatomiquement proche de celui de l'homme. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Pour indiquer à des laboratoires clients quel antibiotique perturbe le moins le microbiote, 280 souris vont être gavées chaque jour pendant dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées quotidiennement à l'état vigile, isolées trois minutes dans une cage vide pour la récolte des fèces, puis tuées pour le prélèvement de leur côlon. Le nombre de groupes varie selon les molécules et les doses que le partenaire souhaite tester. Le porteur prévoit une irritation possible de l'œsophage par l'aiguille de gavage et écrit qu'aucun analgésique ne pourra être administré, au motif que cela biaiserait la réponse cellulaire mesurée.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de différents traitements antibiotiques sur la composition du microbiote intestinal et vaginal. Ils souhaitent grâce à cela définir le traitement et sa dose qui perturbe le moins la composition des microbiotes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la qualité du microbiote intestinal et vaginal en réponse à différents traitements antibiotiques. Ainsi, le partenaire pourra connaître quel traitement perturbe le moins les microbiotes. Il pourra ajuster les doses pour proposer un traitement efficace tout en préservant le microbiote du patient

Procédures

Les souris seront régulièrement manipulées quotidiennement lors de ce projet pour différentes raisons : - Les suivis de poids auront lieu tous les jours pendant 10 jours sur souris vigile (souris manipulées et déplacées dans une balance à pesée dynamique) - Les administration per os par gavage des composés antibiotiques et de l’eau auront lieu tous les jours pendant 10 jours sur souris vigile. La contention sera utilisée ) - Le prélèvement des féces aura lieu une fois le 10ème jour sur souris vigile dans une cage propre et vide pour récupérer les féces déposés dans la cage (isolement de l’animal d’environ 3 minutes avant sa mise à mort)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l’administration quotidienne des composés par voie orale (gavage) sont : - Stress dû à la contention quotidienne pour l’administration orale (les contentions seront réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces actes afin de limiter les contraintes subies par l’animal) - Une potentielle perte de poids liée aux modifications des microbiotes - Légère irritation potentielle dûe au passage de l’aiguille de gavage dans la cavité orale Les effets indésirables seront limités grâce à l’utilisation de matériel adéquat ainsi que grâce à l’expérience du personnel correctement formé. La mise en place de points limites et d’une grille de score permettent de suivre et de réduire la gêne et l'inconfort des animaux. Les animaux entrant en expérimentation seront clairement identifiés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne part le personnel de l’animalerie.

Devenir

Tous les animaux sélectionnés pour immunophénotypage seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des colons et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences sera de 7 animaux par groupe afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester. Les résultats seront ensuite analysés à l’aide du logiciel GraphPad Prism et nous appliquerons selon la taille des groupes différents tests statitistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en zone d’expérimentation. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’acclimatation à leur nouvel environnement d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par du personnel. Une grille de score sera utilisée prenant en compte différents critères tel que le comportement de l’animal et la variation du poids. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Nous savons que chez l’homme, ces antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées en effet secondaire. Si nous observons la même chose chez les souris, nous donnerons une solution de réhydratation aux animaux et effectuerons plus régulièrement le change des litières. Enfin, les gavages quotidiens peuvent entrainer une irritation de l’œsophage chez la souris. Toute administration d’analgésique ou autres substances ne pourra être réalisé car entrainerait un biais sur la réponse cellulaire observée lors de l’étude. En revanche, nous pourrons suppléer les souris avec de la pâtée énergisante afin de leur faciliter l’accès à la nourriture et les réalimenter.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du microbiote des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, le modèle murin est un modèle de choix pour l'étude des microbiotes grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 8 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.

Greffées sous la peau avec des fragments de tumeurs prélevées sur des patients, 2 420 souris âgées de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux qui développent une tumeur sont tués, ceux qui n'en développent pas sont gardés un an au maximum puis tués aussi, faute de pouvoir survivre hors d'un environnement dépourvu de pathogènes. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en listant parmi les signes surveillés la nécrose tumorale cutanée, le prolapsus anal, le dos courbé et le "masque de la douleur". Le projet alimente une banque de 162 modèles tumoraux caractérisés, que l'établissement entend élargir aux tumeurs rares et mettre à disposition d'autres équipes.

Objectifs

Nous avons une collection de 162 tumeurs humaines issues de patients. Cette collection regroupe 5 types de tumeurs : sein, ovaire, pancréas, côlon et sarcomes. Une partie seulement de ces modèles a été caractérisée de façon complète. Ces modèles sont très utiles pour les études de nouvelles molécules anticancéreuses car ils conservent bien les caractéristiques de la tumeur du patient dont ils sont issus. Dans le cadre de ce projet, notre objectif est à la fois d’optimiser la collection existante et de la caractériser. De plus nous souhaitons développer de nouveaux modèles tumoraux, certains très rares, que nous ne possédons pas actuellement dans la banque. A termes, nous souhaitons pouvoir mettre à disposition de chercheurs l’ensemble des modèles pour des projets de recherche en oncologie.

Bénéfices attendus

Les modèles tumoraux développés sont précieux pour tester les réponses à différentes molécules anti-cancéreuses. Ils reproduisent fidèlement les caractéristiques d’une tumeur humaine, les résultats obtenus sur souris peuvent être considérés comme des transpositions fiables de la réponse chez les patients. Notre collection vise à disposer de modèles représentatifs de cancers agressifs et difficiles à soigner. Cette collection de modèles parfaitement caractérisés représentera un outil de recherche pré-clinique puissant.

Procédures

Chaque animal subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sous anti-douleur. La durée de l’intervention est en moyenne de 5 minutes anesthésie, chirurgie et réveil compris. En cas de signe clinique pouvant évoquer une toxicité, un prélèvement sanguin (durée < 20 secondes / prélèvement) sera réalisé pour des analyses.

Impact sur les animaux

La chirurgie de greffe de fragments tumoraux peut engendrer chez les animaux : - Douleurs - Faibles pertes de poids - Déshydratations - Risque d’infection au site d’incision Tous les animaux seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière quant à l’apparition de signes cliniques pouvant être liés au développement tumoral : - Nécrose tumorale cutanée - Diarrhées - Déshydratations - Dos courbé - Prolapsus anal - Masque de la douleur - Perte de poids

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux ayant développé une tumeur seront euthanasiés. Les animaux n’ayant pas développé de tumeur seront conservés et suivis pendant un an maximum, délai au delà duquel ils seront également euthanasiés car ne pouvant survivre que dans un environnement dépourvu de pathogènes.

Remplacement

Il n'existe pas de possibilité de remplacement. Dans la cadre de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques des tumeurs de patients.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum mais il doit cependant être suffisant afin que les tumeurs générées reproduisent fidèlement les tumeurs de patients.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état des souris utilisées sera assurée en prenant en compte tous les points limites établis dans le cadre de ce projet. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse et sous anti-douleur, afin de réduire tout stress et la souffrance de l’animal. Les antidouleurs pourront être utilisés si nécessaire. L’espace de vie de l’animal est diversifié et enrichi afin d’assurer son confort de vie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine. C’est un bon modèle pour l’évaluation de la croissance des tumeurs d’origine humaine. Sur la base de notre expérience dans le domaine, pour favoriser la prise de greffe, les animaux utilisés seront âgés entre 4 et 5 semaines, car la prise de greffe est optimisée à cet âge.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie générale une chirurgie qui obstrue le flux urinaire d'un rein pour provoquer une maladie rénale chronique, puis un prélèvement de sang rétro-orbital le jour de sa mise à mort. Le porteur indique que la plaie peut s'infecter et que l'animal peut souffrir, se désorienter et perdre du poids. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'insuffisance rénale, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant d'évaluer le rôle d'un récepteur de l'immunité innée. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de tubules rénaux ne reproduisent ni la vascularisation ni le flux urinaire, et conclut qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein et à son remplacement progressif par un tissu cicatriciel aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Plusieurs études ont montré le rôle délétère de l’immunité innée dans le développement des lésions rénales dans différents modèles murins de maladies rénales chroniques. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur de l’immunité innée dans l’apparition de lésions rénales dans un modèle murin chirurgical de maladie rénale chronique. Ce modèle utilise une chirurgie rapide sous anesthésie générale sur animaux adultes qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins et ne compromet pas la fonction rénale du rein restant. L’invalidation génétique de ce récepteur de l’immunité innée sera évaluée à différents temps après la chirurgie : 1, 4 et 14 jours.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre d’élucider le rôle d’un récepteur de l’immunité innée sur le développement des lésions rénales en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de freiner la progression des maladies rénales chroniques.

Procédures

L’ensemble des animaux (120 souris) sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. L’acte chirurgical en lui-même est d’environ 5 minutes. Le temps global de la procédure de chirurgie (préparation, anesthésie, chirurgie, suture et réveil) est de 2 heures. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang (30secondes) sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir 2 injections pour l’anesthésie pré-opératoire et lors de la mise à mort ce qui peut induire un stress momentané lors de la contention et une douleur aigüe lors de l’injection. Le modèle chirurgical n’induit pas par lui-même de nuisance puisqu’un seul des 2 reins étant obstrué, l’autre rein maintient une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir (désorientation, éventuelles douleurs, perte de poids) et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection (douleur aigüe). Le prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie générale peut induire une douleur aigüe.

Devenir

L’ensemble des 120 animaux sera mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas l’étude intégrée d’un rein ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Il n’est donc pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l’évaluation des points limites par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Les souris présentant une infection de la plaie se verront appliquer une solution de désinfection ainsi qu’une pommade anti-septique jusqu’à disparition des symptômes. A l’issue de la procédure, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les souris utilisées sont déficientes pour une protéine de l’immunité innée. Ces souris ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour étudier la voie de l’immunité innée dont le rôle est questionné dans cette étude. Les animaux subiront une chirurgie à l’âge adulte (8-12 semaines) après la fin de maturation des reins.

Choisis parce que leur œil a presque la taille d'un œil humain, 20 lapins New Zealand vont subir le retrait de leur cristallin et son remplacement par un sac capsulaire artificiel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'intervention dure 25 à 30 minutes par œil sous sédation profonde, et le porteur annonce une gêne visuelle d'une quinzaine de jours puis une irritation de la cornée pendant sept à dix jours. Dix lapins sont prévus au départ, dix de plus si l'implantation échoue ou si l'œil rejette le dispositif. Trois mois après la greffe, tous sont tués pour que leurs cornées soient prélevées et analysées.

Objectifs

La perte du cristallin chez les patients à deux origines majeures : *La cataracte qui est une opacification partielle ou totale du cristallin qui menace la vue à long terme. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. L’opération de la cataracte consiste à inciser le cristallin, puis à y injecter une lentille intraoculaire IOL (Intraoculaire Lens) afin de restituer l’acuité visuelle du patient. Certaines complications de l’opération peuvent amener à une rupture du sac capsulaire entraînant un déplacement de l’IOL dans la cavité vitréenne. L’IOL sélectionné ne peut plus être utilisé et le chirurgien doit alors envisager une opération secondaire pour le remplacer. *L’aphaquie congénitale ou traumatique : La luxation ou l’absence totale de cristallin peut aussi intervenir : • Suite à des maladies du tissu élastique ou certaines pathologies oculaires, qui fragilisent le complexe cristallin-sac capsulaire-zonule • Suite à un traumatisme contusif violent • Suite à de la radiothérapie pour des traitements ophtalmiques oncologiques Notre équipe en collaboration avec un laboratoire spécialisé dans les implants oculaires a développé un sac capsulaire artificiel, remplaçant totalement le cristallin et permettant de : • Eviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications • Apporter une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin. Après de multiples tests d’implantations dans des yeux artificiels, une étude préclinique chez l’animal est indispensable avant le passage chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’implantation de ce sac capsulaire artificiel appelé MIOS remplacera totalement le cristallin et permettra d’éviter les opérations secondaires de la cataracte suite à des complications des anciennes génération d’implants (IOL) et apportera une alternative facilement implantable suite au cas de luxation ou d’absence naturelle totale de cristallin de plus il peut permettre d’intégrer des inserts cosmétiques permettant de traiter les défauts d’IRIS (Aniridie). L’opération de la cataracte est l’intervention chirurgicale la plus fréquente au monde. Près de 4.700.000 personnes sont opérées en Europe chaque année (INSERM 2017) et 800.000 opérés en France en 2020

Procédures

Une intervention chirurgicale ophtalmologique qui consistera en l'exérèse du cristallin puis son remplacement par la pose d'un implant oculaire (sac capsulaire artificiel) cette intervention aura une durée de 25 à 30 minutes

Impact sur les animaux

Les lapins ressentiront une gêne dans l’acclimatation de la vue pendant environs 15 jours après l’opération. Ils ressentiront une irritation de la cornée au niveau du site opératoire pendant une période de 7 à 10 jours. Puis une reprise de la vue normale progréssive.

Devenir

Tout les animaux ayant subit la procédure 1 suivront la procédure deux et à l'issu de cette dernière procédure ils seront mise à mort pour évakuation histologique.

Remplacement

Pour répondre au principe de remplacement la mise au point de la technique de greffe du sac capsulaire artificiel a été réalisée sur des yeux artificiels malgré tout il est indispensable de passer sur un modèle animal pour suivre l’intégration et la fonctionnalité de l’implant au court du temps.

Réduction

Ce projet a pour but une application direct en médecine humaine de cette nouvelle forme d’implant. Il est donc important de prouver la bonne intégration et le bon fonctionnement de ce nouveau dispositif médical intraoculaire. Notre première approche qui a permis de réduire l'utilisation des animaux vis à vis de l'implantation à 10 lapins a été effectuée sur des yeux artificiels. La maitrise parfaite de l'implantation a permis d'exclure ce facteur de l'analyse de nos résultats futurs sur la parfaite intégration des implants. En nous basant sur des études antérieures ayant permis la mise en application de prothèses intraoculaires nous avons pu déterminer que 10 lapins maximum seraient suffisant. Dans un premier temps 10 lapins seront opérés d’un œil (retrait du cristallin et remplacement par un sac capsulaire artificiel). Au terme des 3 mois d’évaluation sans complication majeure et avec une parfaite récupération de la vue le projet sera arrêté et l’étude validée. Dans le cas de complications lors de l’implantation, de rejet de l’implant par défaut de d’intégration ou de problèmes de récupération de la vue, 10 nouveaux lapins seront opérés en concertation avec le SBEA de notre établissement afin d’apporter des mesures correctives. Le minimum d’animaux utilisés sera donc de 10 et le maximum 20.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Le temps opératoire sera très courts maximum 30 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoires seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention, ainsi qu'un collyre anti-rejet. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 7 à 10 jours. Chaque jour, un examen ophtalmologique sera pratiqué ainsi que des photos seront réalisées afin de suivre la bonne intégration de l'implant. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale. Cette évaluation consiste à observer attentivement les joues, les yeux, les oreilles, le museau et les moustaches de l'animal en tenant compte d'une échelle d’évaluation des expressions faciales du lapin. Dans cette étude nous porterons une attention toute particulière aux yeux et au regarde.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la taille de l’œil est proche de celle de l’homme. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg

Pour voir si un anti-inflammatoire ajouté à l'immunothérapie retarde le cancer du foie, 104 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à des semaines différentes selon leur groupe. Deux jours après leur naissance, elles sont séparées de leur mère le temps d'une injection de streptozotocine, puis nourries au régime gras dès le sevrage jusqu'à développer une cirrhose puis un carcinome hépatocellulaire à partir de la seizième semaine. Suivent de quatre à quarante injections dans le ventre sur animal éveillé selon les groupes, trois anesthésies gazeuses, deux scanners du foie et deux allers-retours de cinq cents mètres entre l'animalerie et le service d'imagerie, le porteur qualifiant d'"indolore" cette évolution vers le cancer. La seule limite décrite pendant l'examen tient au monitoring respiratoire, l'animal en détresse étant retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu'à son réveil.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

Une injection de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, cinq injections dans le ventre sur animal éveillé, une injection dans une veine, une injection directement dans la tumeur, neuf séances d'imagerie : 1 600 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur qui pousse peut provoquer des douleurs, une gêne, une nécrose et une perte de poids, et les anesthésies répétées de l'imagerie ajoutent fatigue et stress. Le porteur présente le suivi par fluorescence comme non invasif et fait valoir que chaque animal est son propre témoin, argument de réduction avancé pour un projet qui en utilise 1 600. Sur la raison de la mise à mort, il écrit que les souris seront tuées parce qu'elles auront une tumeur sous la peau.

Objectifs

Le développement de nouvelles sondes d’imagerie en cancérologie, que ce soit pour la détection de tumeur ou pour la thérapie (ou les 2 combinés), est en plein essor. Afin d’étudier leur potentiel thérapeutique et leur devenir dans l’organisme une fois injectées, une étude préclinique est nécessaire.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel diagnostic et/ou thérapeutique de nouvelles sondes d’imagerie en préclinique dans le but de développer de nouvelles thérapies dirigées contre le cancer ou de nouvelles sondes améliorant le diagnostic.

Procédures

Injection sous la peau sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses, durée 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé 5 fois. Injection dans la veine sur animal anesthésié : durée inférieur à 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans la tumeur sur animal anesthésié : durée 30 secondes, geste réalisé 1 fois. Imagerie : 1 min, 9 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses sous la peau : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention. Mauvaise réaction suite à l’injection des sondes d’imagerie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous la peau.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles sonde d’imagerie qui permettraient d’améliorer le diagnostic et/ou la thérapie dans le cadre du cancer. Même si le potentiel thérapeutique, la validité de la sonde et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles animaux avant d’envisager un passage chez l'homme.

Réduction

Les sondes seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les sondes validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de fluorescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour leur permettre de s'habituer à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille), dans une environnement contrôlé en température et en hygrométrie. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Des points limites ont été mis en place afin de limiter les possibles douleurs chez l'animal.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

Le flanc rasé sous anesthésie gazeuse, 176 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de pancréas sous la peau, puis deux ou trois injections d'anticorps dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, rates et ganglions prélevés. Il s'agit de tester l'inhibition de trois composants d'une voie moléculaire soupçonnée de faire progresser le cancer du pancréas et de le rendre résistant aux immunothérapies. Ni la voie, ni les protéines, ni les anticorps ne sont nommés, et le nombre de souris par groupe est dit défini "à minima" sans qu'aucun chiffre ni calcul n'apparaisse.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Malgré la révolution apportée par les immunothérapies dans certains types de tumeurs, les cancers de ces patients sont généralement résistants à ces traitements. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, il apparaît indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires supportant la progression de ces cancers. Nos données préliminaires, ainsi que les connaissances dans d’autres types de cancers, suggèrent qu’une voie particulière pourrait jouer un rôle crucial dans la progression du cancer du pancréas et la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc investiguer l’effet de l’inhibition de trois composants de cette voie dans la progression de ces cancers, dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire permettant la progression du cancer du pancréas, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales d’anticorps (2 ou 3x 5 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’administration d’un des médicaments, peut induire une perte temporaire de poids légère, qui est restaurée rapidement après l’arrêt du traitement.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la voie d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que la voie d’intérêt est impliquée dans la prolifération des cellules de cancer du pancréas, mais aussi dans leur expression de certaines molécules impactant la réponse immunitaire. Cependant, la pertinence préclinique de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour valider la fonction de ces protéines. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent des cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des lymphocytes en intraveineuse, et sont transportées pour une irradiation de dix minutes qui peut leur faire perdre du poids et affaiblir un temps leurs défenses immunitaires. La tumeur est mesurée trois fois par semaine, l'objectif étant de voir si des lymphocytes modifiés pour surexprimer un facteur cellulaire deviennent efficaces contre les tumeurs solides, là où les thérapies par transfert de lymphocytes échouent aujourd'hui. Le porteur écrit que les interactions entre cellules immunitaires et microenvironnement "ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables", après avoir mené in vitro les expériences qui ont suggéré l'intérêt de ce facteur.

Objectifs

Les traitements d’immunothérapie ont révolutionné la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, les thérapies par transfert de lymphocytes, qui sont très efficaces dans les cancers du sang, ne permettent aujourd’hui pas d’obtenir un bénéfice clinique chez les patients atteints de tumeurs solides telles que le mélanome. Un nouveau facteur cellulaire a été décrite comme importante pour la fonction des lymphocytes dans le mélanome. Nous souhaitons donc évaluer l’effet d’une augmentation génétique de l’expression du facteur d’intérêt dans deux types de thérapies par transfert de lymphocytes, dans le cadre du mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

A ce jour, les thérapies cellulaires par transfert de lymphocytes ne sont que très peu efficaces chez les patients atteints de tumeurs solides. Nos travaux pourraient permettre soutenir le développement d’une nouvelle génération d’immunothérapies par transfert de lymphocytes sur-exprimant le facteur d’intérêt.

Procédures

Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) – Transport sur le même site et irradiation à faible dose (10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’irradiation peut entraîner une perte de poids temporaire et une immunodéficience partielle temporaire.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la molécule d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que l’augmentation de l’expression du facteur d’intérêt dans les lymphocytes, améliore leur potentiel thérapeutique. Cependant, le développement pré-clinique de cette thérapie de nouvelle génération nécessitera une série d'expériences in vivo pour confirmer son effet bénéfique. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes , de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies.. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

Constituer et entretenir une collection de tumeurs humaines greffées, mise à disposition d'autres chercheurs et des tests précliniques de médicaments : 9 830 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit sous anesthésie générale, après incision du dos, un fragment de tumeur ou une injection de cellules tumorales, la plaie refermée par deux ou trois agrafes, puis un marquage à l'oreille ou une puce sous la peau. Suivent des mesures de tumeur jusqu'à trois fois par semaine, parfois des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire ou une ponction intracardiaque terminale, et selon les modèles un traitement à la testostérone ou aux œstrogènes. Le porteur juge "indispensable" de développer ces modèles sur un "organisme complexe", et chiffre l'effectif en greffant chaque modèle sur six à dix-huit souris par passage, pour un taux de pousse annoncé à 25 % minimum.

Objectifs

L’augmentation des chances de succès de la mise sur le marché d’un médicament efficace, notamment en oncologie, passe par l’amélioration des systèmes permettant de tester le potentiel thérapeutique de ce médicament avant son application enclinique, et donc par la mise au point de modèles in vivo mieux caractérisés et plus proches des pathologies étudiées. Les modèles de Patient Derived tumor Xenografts (PDX) sont des outils précieux pour la recherche visant à étudier les effets de médicaments en amont des essais cliniques puisqu’ils conservent les caractéristiques moléculaires et histologiques des tumeurs primaires humaines dont ils sont issus. L’établissement de collections de PDX est donc aujourd’hui un enjeu majeur pour l’évaluation des thérapies anti-cancéreuses afin de reproduire au mieux la diversité des cancers humains, de développer des thérapies spécifiques et d’identifier les marqueurs biologiques prédictifs de la réponse à ces thérapies. Le but de ce projet est de développer une collection de modèles PDX fiables, représentant au plus près la maladie humaine, afin de mettre à disposition du plus grand nombre de chercheurs des outils performants permettant de comprendre et de lutter efficacement contre les différents types de cancers. Les modèles PDX seront générés à partir de l’exérèse de tumeurs prélevées chez des patients consentants, ou encore par transfert de modèles primo-implantés par nos collaborateurs. La réalisation d’analyses moléculaires fait partie intégrante du projet afin de caractériser le plus finement possible les modèles développés. Ce sont elles qui permettront de choisir le modèle étudié en préclinique (selon la présence d’une mutation particulière, l’expression d’un gène spécifique,…). La mise en service de modèles PDX couvrant la diversité tumorale permettra de relever les défis actuels rencontrés dans la lutte contre le cancer grâce à une identification rapide des évènements oncogéniques, leur ciblage thérapeutique et l’anticipation des mécanismes de résistance et de toxicité aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif le développement de modèles de PDX nécessaire pour déterminer l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique, dans le but d’améliorer et d'identifier des thérapies efficaces pour le traitement des divers types de cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement, les études précliniques ont une première étape vers l’identification des traitements plus efficaces ou avec des effets secondaires moindres.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral ou de cellules dissociées issues de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral ou l’injection de cellules. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Selon les caractéristiques des modèles, un traitement à la testostérone ou une supplémentation en oestrogènes pourront être réalisés. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. La durée de mesure de la tumeur et de pesée est inférieure à 1 minute par animal. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, une hypothermie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. La xénogreffe de tumeurs peut également provoquer une perte de poids (modèles cachectiques). Un stress induit par les prélèvements sanguins est également une nuisance attendue. Ces nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont transitoires et peuvent donc être classés en modérés. Dans le cas où ces nuisances persisteraient, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral ou de cellules tumorales, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, greffe de cellules tumorales, traitement hormonal) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur absence de toxicité et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de développer les modèles PDX à partir de tumeurs de patients. Ces modèles sont les seuls représentant le plus fidèlement possible les diversités caractéristiques observée dans les cancers humains, et ce dans un organisme complexes. Ils permettent d’augmenter les chances de succès dans le développement de traitements efficaces et personnalisés pour des populations définies (médecine personnalisée), avant un transfert en étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale utilisant un nombre d’animaux réduit au minimum. Nous estimons développer 40% des modèles primo-implantés (taux de chances qu’un modèle pousse chez la souris à partir d’un échantillon humain) et 100% des modèles transférés par les partenaires du projet, ces derniers ayant été greffés chez la souris au préalable, leur croissance chez la souris a déjà été un succès. Lors de la greffe d’une tumeur sur un animal, les chances qu’elle pousse est de minimum 25% (d’après les données internes et les données de la littérature). Pour maximiser les chances de réussites et espérer la croissance d’au moins une tumeur par passage, chaque modèle est greffé sur 6 animaux à chaque passage. Si, pour un modèle donné, nos analyses montrent que le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à chaque passage pourra être réduit à 4 au lieu de 6. Afin de garantir la conservation des modèles dont le développement a été un succès, et pour analyser leurs caractéristiques biologiques et moléculaires, une banque biologique est créée, nécessitant de greffer chaque modèle sur 18 animaux à un passage donnée. Si le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à ce passage pourra être réduit à 12 au lieu de 18. Afin de vérifier les possibilités de décongélations des modèles, 3 méthodes de décongélations sont testées, cela nécessite l’utilisation de 6 animaux par méthode de décongélation (3x6=18 animaux). Si la première méthode de décongélation testée est un succès, les deux autres méthodes ne seront pas testées permettant de réduire le nombre d’animaux à 6 au lieu de 18.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter le risque d’hypothermie. De l’antiseptique sera appliqué sur la peau des animaux, les agrafes seront aseptisées et le matériel utilisé sera stérilisé pour éviter les risques d’infection. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire sera administré à l’animal. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la réalisation de tests précliniques, dont le but final est la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès