Procédures modérées
Tester l’efficacité de thérapies cellulaires dans un modéle de leucémie chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un morceau d'oreille prélevé, une injection dans le ventre, puis pour certaines une injection dans la veine de la queue en boîte de contention, une injection dans la veine de l'œil sous isoflurane répétée à trois, sept et trente jours, des injections hebdomadaires sous la peau et des prises de sang à la joue chaque semaine sur animal éveillé. 910 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, greffées de cellules de leucémie humaine puis traitées par différentes préparations de cellules immunitaires. Le porteur décrit les signes attendus du développement de la leucémie, prostration, poil hérissé, yeux plissés, envahissement du sang par les cellules cancéreuses. Chaque procédure peut durer jusqu'à dix mois, au terme desquels les souris sont tuées, ou plus tôt si un point limite est atteint.
Objectifs
Les immunothérapies ont changé le paradigme du traitement du cancer en s'éloignant de la chimiothérapie cytotoxique conventionnelle. Certaines cellules immunitaires ont la capicité de tuer des cellules infectées par des pathogènes intracellulaires et des cellules tumorales. Ce projet vise à comparer l'activité anti-tumorale de différentes préparations de cellules immunitaires in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes . L'activité anti-tumorale etudiée dans ce projet sera dirigée contre des cellules cancereueses de la moelle osseuse et du sang. Ces travaux nous permettront de mieux comprendre l'activité anti-tumorale de ces cellules immunitaire dans un modèle de tumeurs humaines chez la souris.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies ont changé le paradigme du traitement du cancer, s'éloignant des méthodes conventionnelles de chimiothérapie cytotoxique. Cependant, les résultats de l'immunothérapie restent plus limités dans certains cancers. Il apparaît donc essentiel de développer une alternative à ces immunothérapies en utilisant des cellules immunitaires à l'origine de thérapies cellulaires. Ces protocoles d'activation différentiel des cellules immunitaires in vitro pourraient être mis en place sur une plateforme de biothérapie cellulaire en vue d'un futur essai clinique de thérapies cellulaires dans le cadre de leucémie.
Procédures
672 souris seront soumises à de la contention et auront un prélèvement de petit bout d'oreille et une injection unique au niveau du ventre (quelques seconde sur souris vigile). Parmi ces 672 souris, 96 (souris vigiles) auront une injection unique dans la veine de la queue après avoir été placé dans une boite à contention, moins d'une minute et auront aussi des prélèvements répétés de sang au niveau de la joue 1/semaine avec alternance des sites de prélévement. 288 autres souris auront une injection unique au niveau de la veine de l'oeil après anesthésie à l'isoflurane (quelques secondes),ainsi que des injections répétées sous la peau (1/semaine) sur souris vigiles, quelques secondes. Et 288 autres souris auront une injection unique dans la veine de la queue après avoir été placé dans une boite à contention (moins d'une minute) , ainsi qu' une injection au niveau de la veine l'oeil après anesthésie à l'isoflurane (quelques secondes) pouvant être répétée à J3, J7 et J30, de plus elles auront des injections répétées sous la peau (1/semaine) sur souris vigiles,(quelques secondes) et des prises de sang répétées au niveau de la joue (hebdonadaire) sur souris vigiles, quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements seront sources de stress et de douleur (inflammation sur le site d'injection), cependant le volume injecté ou prélevé reste faible et l'acte est rapide (inférieur à une minute). Les effets indésirables attendus liés au développement de la leucémie (souffrance modérée) seront la prostration, le poil hérissé, les yeux plissés ou bridés et un envahissement du sang par les cellules cancereuses.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure (10 mois au maximum) ou avant si un point limlite est atteint.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro avec les différentes sous type de cellules imminitaires et les différentes lignées de cellules cancereuses ont été réalisées au laboratoire, nous premettrant de limiter le nombre de conditions in vivo. Cependant, les approches in vitro ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire, ni du dévélopement du cancer car celle-ci nécessite la présence d'un micro-environnement. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet pour tester l'efficacité des cellules immunitaire dans un modèle de leucémie.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=910) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Dans toutes les procédures nous aurons besoin de 8 souris par groupe afin de définir des différences significatives. Ce projet sera réalisé de façon séquentielle : dans un premier temps les P2 et P3 seront réalisées afin de définir les conditions expérimentales optimales pour la procédure P4.
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Les souris seront toujours herbergées dans des cages sur portoir ventilé et les expérimentation seront réalisées en condition stérile afin d'éviter des contacts microbiens qui pourraient nuire à leur bien-être. Les injections au niveau de la veine de l'oeil seront toujours précédées d'une anesthésie gazeuse qui limitera la douleur des souris. Les pélèvements sanguins se feront en altermant le site de prélèvement. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (blocs de cotons ou tube en plastique, .....) et le maintien dans la mesure du possible des groupes sociaux et surtout au cours de la gestion des souris. Au fur et à mesure de l'apparition des tumeurs et de mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour la nidification, mocreaux de bois et tube plastique pour l'enrichissement ludique). Pour la procédure de gestion, les souris gestantes seront maintenues avec le mâle géniteur.
Choix des espèces
Ce modèle est donc très pertinent car il permet de reconstituer des pathologies humaines telles que des leucémies après transfert des cellules cancereuses et de tester l'efficacité de thérapies cellulaires. Pour les accouplements, nous utiliserons des souris arrivées à maturité sexuelle (8 semaines). Dans les autres procédures, des souris âgées de 6 à 15 semaines seront utilisées afin de permettre un bon développement tumoral et permettre de tester sur des souris adultes l'efficacité de nos thérapies cellulaires.
Interaction du microbiote et des lymphocytes T spécifiques, les cellules MAIT, lors d’une inflammation intestinale chez la souris (Site 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Élevées dans un premier établissement pour ses conditions d'hébergement particulières, puis transportées vers un second uniquement pour y être tuées, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un composé chimique dans l'eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, par trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que les diarrhées provoquées font perdre environ 25 % du poids initial et que ce poids est retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Sur le remplacement, il écrit avoir déjà testé in vitro la présentation de l'antigène microbien aux lymphocytes T, et conclut que le rôle de l'interaction entre l'hôte et son microbiote ne peut être établi hors d'un "organisme entier".
Objectifs
Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.
Remplacement
Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.
Production de souris à phénotype dommageable pour des études moléculaires et cellulaires d’une maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une souris qui convulse est tuée sur le champ, et la prostration ou les tremblements déclenchent aussi l'arrêt immédiat du protocole. 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 1 200 fœtus sortis un par un de la corne utérine et décapités, et 720 souris porteuses d'un phénotype dommageable dont le porteur indique que 10 % meurent avant trois mois et environ 30 % avant quatre mois, de crises d'épilepsie spontanées. Une partie subit une ouverture de la cage thoracique sous anesthésie profonde pour une perfusion intracardiaque de fixateur, opération de trente minutes menée sans réveil. Ces souris ne sont produites que pour l'analyse post-mortem, aucune autre procédure expérimentale n'étant prévue, et le projet se ramène à fabriquer des individus atteints pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le but de ce projet est d’analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont impactés dans un syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Le gène déficitaire dans ce syndrome est exprimé dans le cerveau au cours du développement et chez l’adulte. Les modèles que nous étudions présentent une inactivation soit d’une copie, soit des deux copies du gène spécifiquement dans une population de neurones, les neurones produisant le neurotransmetteur GABA qui est le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau. Cette approche nous a permis de montrer que la plupart des symptômes associés au syndrome dont l’épilepsie et les troubles autistiques étaient liés à l’inactivation du gène dans cette population neuronale. L’inactivation des deux copies du gène nous permet de comprendre le rôle de ce gène dans les neurones GABAergiques au cours du développement. Le but ici est maintenant de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impactés dans ces modèles en regardant quelles sont les sous-populations de neurones GABAergiques affectées par des études immunohistologiques et les voies moléculaires dérégulées grâce à des études moléculaires. Les animaux de cette étude sont uniquement dédiés à de l’analyse post-mortem et ne font pas l’objet d’autres procédures expérimentales. Ils font l’objet d’une demande d’autorisation de projet pour phénotype dommageable. Le modèle avec inactivation d’une copie du gène présente des épilepsies spontanées qui se déclarent à partir de 6-8 semaines tandis que le modèle avec inactivation des deux copies du gène entraine une absence de formation d’une structure du cerveau appelée striatum servant à l’exécution des mouvements. L’absence de striatum entraine des spasmes musculaires à la naissance et le décès des petits dans les premiers jours de vie. Les études sur ce modèle ne concernent donc que les foetus dans le dernier tiers de développement (à partir de 15 jours de développement embryonnaire) et jusqu’au jour de naissance, c’est-à-dire avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de permettre la production de souris et de fœtus pour 2 modèles murins impliqués dans le syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Ces 2 modèles présentent des phénotypes dommageables dont la caractérisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine des troubles du neurodéveloppement associés à cette pathologie.
Procédures
Une partie des souris subissent une chirurgie sans réveil pour pouvoir fixer le cerveau de manière optimale. Pour cela, une anesthésie profonde est couplée à un anti-douleur. La procédure consiste en un acte chirurgical avec une ouverture de la cage thoracique et perfusion par voie intracardique d'un agent de fixation. La procédure dure environ 30 minutes et n'est réalisée qu'une seule fois par souris, celle-ci étant sans réveil.
Impact sur les animaux
Des épilepsies apparaissent chez certains animaux dont une copie du gène a été inactivée dans les neurones GABAergiques à partir de l’âge de 6-8 semaines. Ces crises se caractérisent par des myoclonies (secousses musculaires localisées au niveau des vibrisses, de la face, des oreilles et des membres antérieurs) ainsi que des crises tonico-cloniques (une course intense, une perte d’équilibre et une chute sur le flanc accompagnée de myoclonies généralisées pendant quelques secondes). Ces crises sont généralement indolores car il y a perte de connaissance. Si la crise est forte, certaines souris peuvent aller jusqu’à la crise tonique qui se manifeste par une hypertonie des quatre membres de la souris tendus en direction de l’appendice caudal. Cette dernière peut s’accompagner de la mort de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car leur cerveau est prélevé pour des analyses moléculaires et histologiques
Remplacement
Pour les études concernant le cerveau, il n'existe à l'heure actuelle pas d'alternative à l'utilisation des animaux. Les organoïdes cérébraux, censés mimer la structure et les fonctions principales du cerveau, n’ont pas la capacité de répliquer toutes les structures et réseaux neuraux d’un cerveau adulte. Il n'existe donc pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser les analyses qui sont faites dans ce projet.
Réduction
Pour chaque étude, les effectifs ont été calculés afin d'avoir un nombre minimal d'animaux d’intéret (n=6 individus par sexe et âge) tout en ayant des résultats scientifiquement et statistiquement interprétables. Nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 10 x 5 = 600 animaux au phénotype dommageable. Nous prévoyons des animaux supplémentaires pour compenser la perte de certains animaux lors de crises épileptiques. En effet, nous avons observé qu’environ 10% des souris décèdent lors des trois premiers mois et ~30% avant 4 mois). Basé sur une estimation de la moitié des animaux qui seront sacrifiés avant l'âge de 3 mois et l'autre après, nous aurons besoin de produire 120 animaux en plus, ce qui donne un total de 600 + 120 = 720 animaux . Nous produirons aussi des mâles au phénotype dommageable pour de nouveaux accouplements. Sachant que nous perdons environ 30% de ces mâles avant l’âge de 4 mois et que certains mâles ont du mal à se reproduire, nous estimons devoir produire en continu 6 animaux en âge de se reproduire. A cela, nous devons ajouter le même nombre de femelles qui seront aussi produites en même temps. Nous produirons donc 6 animaux x 2 sexes x 4 trimestres x 5 ans = 240 animaux. Pour les analyses des foetus, nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 2 génotypes x 10 x 5 = 1200 foetus. Nous utiliserons donc au maximum 2160 animaux.
Raffinement
L'état général et le comportement des souris est suivi quotidiennement par l'animalier: examen de l’apparence de l’animal, de l'état du pelage, de la coloration des muqueuses, évaluation de l'état de souillure de l'arrière-train, analyse visuelle de la respiration. Le premier signe d'alerte sera une perte de poids, un arrière-train souillé et un pelage mal entretenu qui entraînera une surveillance accrue (niveau 1). Le second signe d'alerte sera la prostration (et/ou des tremblements) qui entraînera un arrêt immédiat du protocole et l'euthanasie de l'animal (niveau 3). Certains animaux avec inactivation d'une copie du gène d'intérêt pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment à partir de l’âge de 6-8 semaines. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Afin d'éviter au mieux le stress pouvant provoquer une crise chez ces animaux, ceux-ci seront manipulés avec un tunnel lors des changes de cages. Si nous observons une souris qui convulse, celle-ci sera euthanasiée. Les souris avec inactivation des deux copies du gène d'intérêt développent des spasmes musculaires (dystonie) peu après leur naissance et meurent pendant les premiers jours de vie. Ces animaux sont prélevés et mis à mort avant que le phénotype dommageable n’apparaisse. Les foetus seront sortis de la corne utérine un par un et euthanasiés par décapitation directement afin de réduire au minimum le stress lié à cette sortie.
Choix des espèces
Cette étude vise à comprendre le rôle du gène d'intérêt dans le développement et le fonctionnement des neurones inhibiteurs GABAergiques. L’utilisation d’un modèle d’inactivation conditionnelle permet d’étudier l’impact spécifique de ce gène dans ces neurones. Cette étude requiert un modèle animal suffisamment proche de l’homme tel que la souris. Les animaux sont utilisés à différents stades pré- et postnatals : E15.5-E18.5, avant sevrage (1-12 jours) juvénile (3-6 semaines), adulte (2-4 mois). Les études nécessitent de comprendre le développement dès le stade embryonnaire et jusqu’à l’établissement de la pathologie à l’âge adulte.
Identification de nouvelles protéines impliquées dans les maladies métaboliques liées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quinze semaines d'un régime gras rendent 288 souris obèses, diabétiques et porteuses d'un foie chargé de graisse, avant sept prélèvements de sang en deux heures le jour du test au glucose. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit comme douleurs que celles des piqûres de la queue et des prélèvements à la veine sous-mandibulaire, qualifiées de légères, l'obésité, le diabète et la stéatose induits restant rangés au titre des perturbations métaboliques attendues. La mise à mort finale sert à récolter le sang et les organes pour identifier les protéines associées à la protéine p85 dans la voie de l'insuline.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie métabolique caractérisée par une concentration élevée de sucre (hyperglycémie) dans le sang. Le nombre de cas est en constante augmentation, en parallèle avec l’augmentation des cas d’obésité. Les patients diabétiques développent fréquemment des maladies chroniques du foie, notamment caractérisées par une accumulation de graisses dans le foie (stéatose). L'hyperglycémie, qui définit le diabète de type 2, est liée à l'action inadéquate de l'insuline. L'insuline est libérée par le pancréas suite à l'ingestion d'un repas. Elle agit avec d’autres protéines en cascade afin de faire entrer le sucre dans les cellules et maintenir sa concentration correcte dans le sang. Parmi les protéines de cette cascade, on retrouve notamment une protéine appelée p85. Afin de mieux comprendre les mécanismes liés au développement d'un diabète et d'accumulation de graisses dans le foie, nous souhaitons identifier les protéines qui participent au maintien de la concentration correcte de sucre dans le sang chez des souris mâles et femelles obèses. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques afin d'identifier les protéines qui sont associées à la protéine p85. Ces souris seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une stéatose chez l'animal. Les études cliniques et précliniques indiquent des différences majeures liées au sexe dans la voie de l'insuline, ainsi nous utiliserons des souris des 2 sexes. A la fin de l'expérience, différents organes seront prélevés afin de purifier la protéine d'intérêt et d'identifier les protéines auxquelles elle est associée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de l'insuline dans les pathologies du diabète de type 2 et du foie gras (stéatose hépatique). La purification spécifique des protéines d'intérêt de la voie de l'insuline permettra d'identifier et de comparer leurs interactions avec d'autres protéines chez des souris saines et des souris obèses. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.
Procédures
Les animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Un prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux recevront une fois une solution de glucose par gavage et une fois de l'insuline par injection intrapéritonéale. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes et seront espacés au minimum d'une semaine. Le même jour, des prélèvements d’une seule goutte de sang seront réalisés à la queue toutes les 15 min minutes sur une durée de 2h pour étudier, soit 7 prélèvements prenant moins de 5 secondes chacun. Un prélèvement intermédiaire de sang, prenant environ 15 secondes, pourra aussi être réalisé (1 fois 100 μl), espacé au minimum d’une semaine avec les autres prélèvements. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.
Impact sur les animaux
Les animaux nourris avec les régimes gras deviendront obèses et présenteront des perturbations métaboliques associées à l’obésité telles que le développement d’un diabète (concentration élevée de sucre dans le sang) et d'une stéatose (accumulation de graisses dans le foie). Les prélèvements sanguins (intermédiaire et final) à la veine submandibulaire et les injections de glucose (OGTT) et d’insuline (ITT) peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang (pour la mesure de la glycémie) peut entraîner une légère douleur.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les pathologies étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, dans ces pathologies, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier une version modifiée d'une protéine d'intérêt.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude de l’efficacité et de la bio distribution de produits de santé utilisés dans le traitement de maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées à la fin du protocole pour que leurs organes soient prélevés et la quantité de produit mesurée organe par organe, 424 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une ou deux injections dans une veine ou directement dans le cerveau, cette dernière voie demandant jusqu'à une heure de préparation en cadre stéréotaxique et pouvant provoquer des douleurs, des saignements et des dommages cérébraux irréversibles. S'y ajoutent des séances de micro-scanner et d'imagerie optique sous anesthésie générale, jusqu'à deux par jour les trois premiers jours puis une par jour jusqu'au septième. Le porteur affirme qu'aucun modèle de remplacement ne permet d'évaluer la biodistribution d'un produit dans un "organisme entier" vivant, et n'envisage de garder en vie que "la ou les souris background" si cela s'avère possible.
Objectifs
D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, la schizophrénie, la sclérose en plaque et la maladie de Charcot touche 24 millions, 1,8 millions et 500 000 personnes dans le monde respectivement. Afin de mieux comprendre les maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes (comme la schizophrénie, la sclérose en plaque ou la maladie de Charcot (également appelée sclérose en plaque amyotrophique)) qui sont des maladies multifactorielles et ainsi développer de nouveaux médicaments thérapeutiques. Dans le cas de la sclérose en plaque et la maladie de Charcot, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la maladie. Pour la sclérose en plaque, les traitements actuels permettent seulement d’éviter les récidives des poussées et de freiner la progression de la maladie. De nouvelles recherches ont démontré l’implication de protéines rétrovirales endogènes (de la famille des rétrovirus endogènes humain gamarétroviraux HERV) dans le développement de la maladie. Ces protéines sont retrouvées dans le sang, le cerveau et /ou le liquide céphalo rachidien de patients atteints de sclérose en plaque ; cette protéine a même été retrouvée dans certains cas de Covid long. C’est pourquoi ces protéines rétrovirales endogènes semblent être un facteur clé à étudier dans le cas de sclérose en plaque mais probablement dans le cas d’autres maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes. L’objectif de ce projet est de développer des anticorps ciblant ces protéines rétrovirales endogènes. Les anticorps peuvent êtres couplées a des fluorochromes ou rendu bioluminescent afin de suivre leur biodistribution. Plusieurs voies d’administration seront testés au cours de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera dans un premier temps à avoir une meilleure compréhension de la biodistribution d’anticorps marqués et/ou de produits afin de définir la voie d’injection la plus pertinente puis dans un deuxième temps aux développements de nouveaux médicaments dans le cas de maladies neurologiques, psychiatriques ou auto-immunes et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer de nouveaux médicaments thérapeutiques.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux injections soit par voie intraveineuse ou par voie intracérébrale en respectant les volumes d’injections recommandés. Les injections par voie intraveineuse pourront être fait sur animal vigile et seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute). Les injections par voie intraveineuse réalisées sous anesthésies et en comptant l’anesthésie dure environ 5 minutes. Les injections intracérébrales peuvent durer jusqu’à 10 minutes. Plus l’injection dans le cerveau est lente et mieux c’est pour l’animal. La chirurgie donc du placement de la souris dans le cadre stéréotaxique et la préparation à l'injection cela dure entre 30 minutes à maximum 1 heure par animal. Des examens micro scanner ou d’imagerie optique pourront être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis 1 acquisition par jour jusqu’au 7e jour.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, injections par voie intraveineuse et acquisition d’imagerie optique. Les injections intracérébrales sont susceptibles d’induire des douleurs voire des saignements pouvant induire des dommages irréversibles dans le cerveau. Différents signes cliniques pourront être observés tels qu’une perte de poids, des troubles neurologiques ou des signes liés à la douleur. Une prise en charge analgésique avant et après injection sera donc réalisée. Des mesures spécifiques seront prise pour cette voie d’injection. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration choisies pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies voire inflammation du site d’injection).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organe et réaliser une quantification des produits par organe grâce à de l'imagerie optique ex-vivo ou par d’autres techniques in vitro. Si possible, la ou les souris background pourront être gardées en vie.
Remplacement
A l’heure actuelle il n’existe aucun modèle de remplacement permettant d’évaluer la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique), le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire.
Réduction
L’utilisation de produits rendu fluorescent ou bioluminescent vont permettre de suivre au cours du temps la biodistribution du produit par imagerie médicale sur les mêmes animaux et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Une étude pilote pourra être réalisée sur un nombre limité d’animaux (2 ou 3 par groupe) pour vérifier la détection in vivo des molécules marquées et s’assurer que la technique d’injection intracérébrale n’entraine pas de signes cliniques incompatible avec l’étude. L’étude principale pourra être réalisée si lors de l’étude pilote, 90% des animaux ne présentent pas de paralysie ou lésions cérébrale incompatible avec la poursuite de l’étude (c’est-à-dire sur une étude pilote de 7 souris, 0 ou 1 souris morte est un go pour démarrer l’étude pilote) et si la molécule marquée à un niveau suffisant pour être détectable et mesurable in vivo. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en réalisant des tests statistiques permettant d’étudier la biodistribution des produits testés, des groupes contenant un nombre de souris suffisant seront réalisés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude. Sauf pour les animaux ayant subi une chirurgie, ces animaux pourront être herbergés seuls les 24 à 48h suivant la chirurgie (ou plus si nécessaire) (le temps nécessaire pour que la plaie soit cicatrisée et éviter que les souris s'arrachent et/ou se rongent les fils de suture). Selon les études les animaux background pourront être hébergés collectivement ou individuellement.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi pour : -Sa taille réduit permettant l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier, -Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la biodistribution en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés) -des souris sans poils pourront être privilégiés car l’absence de poils permet d’augmenter la sensibilité de détection de la fluorescence. Des souris de minimum 5 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes GR et de ses co-régulateurs SRC1 et TIF2 dans l’atrophie musculaire 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Gavées de prednisone tous les jours pendant un mois ou injectées à la dexaméthasone trois jours de suite, sans anesthésie ni analgésique, 960 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Trois semaines de nourriture médicamenteuse puis cinq jours d'injections intrapéritonéales servent d'abord à désactiver dans leur muscle deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes. Un test d'agrippement, réalisé une seule fois en trois essais, mesure ce qu'il reste de force musculaire. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire majeur n'avait été observé lors d'études comparables, tout en prévoyant d'exclure les souris ayant perdu plus de 20 % de leur poids en une semaine et en signalant que le gavage répété peut causer des fausses routes et une irritation de la gorge.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.
Procédures
Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.
Comparaison des effets provoqués par un faisceau d’ions lourds 56Fe avec ceux induits par irradiation gamma sur les cellules souches de souris adultes.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système urogénital
652 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est irradiée aux rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds, une autre reçoit une irradiation à dose létale qui détruit son système sanguin et dont la mort survient en 11 à 15 jours sans greffe, une autre encore est stérilisée par un composé reprotoxique avant de recevoir une greffe de cellules souches testiculaires ou de moelle osseuse. Les données doivent servir à estimer les risques encourus par les astronautes lors de vols dans l'espace profond, sur la fertilité masculine, le système sanguin et le cerveau, et à améliorer la composition des capsules, des vêtements et du régime alimentaire des équipages. Sur le remplacement, le porteur indique que les cultures de cellules souches ne reproduisent ni la quiescence, ni les régulations hormonales, ni la réponse inflammatoire, et que seule la greffe chez un receveur vivant démontre le caractère "souche" d'une cellule.
Objectifs
Les vols spatiaux autour de la Terre ont des effets sur la santé qui ne peuvent être extrapolés aux séjours de longue durée dans l'espace profond. La Terre protège du rayonnement cosmique, un mélange complexe de radiations dont les éléments les plus toxiques sont les ions lourds. Des irradiations X ou photons répétées à faibles doses accélèrent le vieillissement et augmentent le risque de cancers. Mais il est impossible de transposer leurs effets aux faisceaux d'ions lourds plus toxiques pour les cellules. Ce projet vise à examiner les conséquences d'expositions à faibles doses sur la fertilité masculine (production de sperme), le système sanguin (risques de cancer) et le cerveau (dysfonctionnements). En l'absence de données, les risques encourus par les astronautes peuvent être analysés chez la souris adulte. Les effets des ions lourds seront comparés à ceux après irradiation obtenus dans la première partie du projet. Ces effets ne peuvent être identifiés dans des cultures de cellules qui ne reproduisent ni les régulations hormonales, ni les réponses inflammatoires, ni les interactions entre types cellulaires. Pour minimiser le nombre de souris, des tissus d'un même animal (testicules, moelle osseuse et cerveau) seront prélevés. L'accent est mis sur les cellules souches, présentes tout au long de la vie et essentielles à la production de cellules matures telles que les cellules sanguines et les spermatozoïdes, ainsi qu'au maintien du système nerveux. L'étude comprend des expériences de greffes afin d'examiner la capacité des cellules souches irradiées, testiculaires et hématopoïétiques, à produire respectivement des spermatozoïdes ou à induire des cancers chez les souris receveuses. Après immunohistologie des cerveaux irradiés, une reconstruction 3D permettra de visualiser et quantifier la production de neurones, les interactions cellulaires et l’inflammation afin d’améliorer la compréhension des disfonctionnements cérébraux observés. Différents prélèvements de sang et de tissus seront réalisés sur les souris euthanasiées pour mettre en évidence des différences entre souris irradiées et non irradiées via des dosages biochimiques, le suivi de marqueurs de stress, et l'analyse de l’expression géniques dans les tissus d'intérêt. Les procédures se dérouleront sous anesthésie et des antalgiques sont prévus avant et après les interventions. Une grille de suivi des points limites permettra de minimiser le stress et/ou la douleur chez les animaux greffés.
Bénéfices attendus
- L'analyse in vivo des effets de faibles doses d'irradiation reste délicate. Pour les radiations, des effets dégénératifs et cancérigènes ont été démontrés, mais les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas totalement élucidés. L'analyse comparée des cellules souches de 3 tissus soumis à des irradiations de natures différentes apportera des éléments de réponse complémentaires. - Il n'y a pas actuellement de données sur l'innocuité de l'exposition aux ions lourds à faible dose sur les cellules souches testiculaires. Ce travail permettra d'établir si elles conservent à moyen terme leurs propriétés de production de spermatozoïdes. Leur capacité à restaurer une spermatogenèse après exposition à un faisceau 56Fe sera un argument positif en faveur du maintien d'une fertilité masculine normale dans l'espace. Ces données préliminaires permettront d'analyser ensuite le risque héréditaire potentiel (génétique et/ou épigénétique) sur la descendance. - Une analyse immunohistologique en 3D des cerveaux des animaux irradiés permettra de préciser les types de cellules nerveuses altérées et l'influence de la réponse inflammatoire dans les disfonctionnements cognitifs. - Des expériences de greffes de cellules souches hématopoïétiques irradiées (impliquées dans la production des cellules sanguines) dans des animaux receveurs sains permettront de confirmer ou infirmer leur rôle dans le développement de leucémies - Pour chaque type de cellules souches, les analyses d'expression génique permettront de déterminer s'il existe ou non une signature spécifique des faisceaux de forte énergie par rapport aux irradiations de faible énergie, en fonction de la dose. Ces données serviront de base aux études ultérieures des effets d'une exposition chronique à de faibles doses de radiations, plus proche de la réalité mais techniquement impossible actuellement. Elles devraient permettre également d'améliorer les mesures de protection des équipages (composition des capsules, vêtements, régime alimentaire).
Procédures
Des groupes de souris mâles seront exposés une seule fois à des rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds et d'autres ne seront pas exposés (contrôle). Les conditions d’irradiation (en groupe, à l'obscurité avec bruit limité et sur une courte durée inférieure à10 min) induisent peu de stress et les doses d'exposition ne sont pas associées à de la douleur. Les souris réintègrent pour 7 jours leurs cages d'origine et font l'objet d'une surveillance régulière avant d'être euthanasiées. Les animaux receveurs sont préalablement stérilisés par injection d'un composé reprotoxique, suivi 24h après d'une greffe de moëlle osseuse pour maintenir leur système sanguin. Après 1 mois, les cellules souches testiculaires fluorescentes sont greffées (anesthésie chimique et durée 20 minutes). Deux mois plus tard, les testicules des receveurs euthanasiés sont prélevés et analysés pour déterminer la présence de spermatozoïdes fluorescents. Le système sanguin des souris receveuses est éliminé par une seule irradiation à forte dose et de la moëlle osseuse est greffée 24 h après (durée moins de 10 min). Les cellules souches des donneurs sont greffées 24 h après sous anesthésie gazeuse par une transfusion d’une durée de 5 min. Les animaux receveurs seront euthanasiés 4 mois plus tard pour permettre le prélèvement de tissus et organes et leur analyse.
Impact sur les animaux
- Le stress généré par la séance d'irradiation. De plus pour les souris irradiées à fort dose (dose létale, la mort est attendue entre 11 et 15 jours en absence de régénération du système sanguin. Signes préalables de souffrance : des problèmes oculaires, des dermatites, une perte de poids, une prostration, un pelage terne ou des vocalisations anormales. - La greffe hématopoïétique peut échouer chez les animaux traités par l'agent reprotoxique : perte de poids, prostration, vocalisation anormale. Après la transplantation de cellules testiculaires, ces animaux sont observés quotidiennement (sur 7 jours) afin de détecter la présence éventuelle de lésions cutanées, de réactions inflammatoires (suppuration), de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, dos vouté, vocalisation anormale), et de signes d’infection. - Les différentes injections d'anti douleurs et anesthésiques peuvent également stresser les souris.
Devenir
Les animaux irradiés et contrôles non irradiés seront euthanasiés après 5 jours, pour permettre le prélèvement de tissus en vue d'analyses cellulaires ou génétiques, ou de greffes pour ceux exprimant la protéine fluorescente. Ces expériences sont destinées à déterminer les effets induits par l'irradiation : lésions dans l'ADN non réparées, mort cellulaire, arrêt de la multiplication des cellules et réduction des capacités de régénération des cellules souches. Les animaux receveurs de greffes intratesticulaires seront euthanasiés après 2 mois pour déterminer si les cellules fluorescentes greffées ont permis la régénération d’une spermatogenèse fonctionnelle (production de gamètes). Les animaux receveurs de greffes hématopoïétiques seront euthanasiés après 4 mois pour prélever et analyser leur moelle osseuse. En absence de production de cellules sanguines fonctionnelles à partir des cellules greffées, le décès des receveurs survient habituellement dans les 2 semaines suivant la greffe. Dès la détection de signes cliniques de souffrance, les animaux seront euthanasiés; et leur moelle osseuse sera analysée.
Remplacement
1) Les modèles alternatifs de culture de cellules souches de souris ne permettent pas de modéliser leur microenvironnement en conditions physiologiques, ni de reproduire l'absence de multiplication (quiescence) d'une grande partie du stock de cellules souches. Ces modèles de substitution ne peuvent rendre compte des régulations hormonales, et de la réponse inflammatoire susceptible d'être induite après irradiation. L’utilisation d’un modèle animal reste ici nécessaire pour évaluer l’effet des radiations sur un organisme. (2) La validation ultime du caractère "souche" des cellules ne peut être établie que par transplantation (greffe) de cellules chez un receveur, qui est le seul moyen de démontrer la capacité d'une cellule à restaurer une différenciation normale (propriété des cellules souches) en conditions physiologiques et assurer une régénération tissulaire.
Réduction
Les irradiations "corps entier" associées à l’étude de 3 tissus d’un même animal permettent de limiter notablement le nombre d’animaux impliqués dans ce projet. Un programme de modélisation prenant en compte les différents paramètres importants de l’expérience est utilisé pour estimer la taille des groupes expérimentaux. Il offre le meilleur ratio de probabilité de réussite dans la comparaison de groupes de petits effectifs par des tests statistiques classiques.
Raffinement
L’irradiation corps entier n’induit pas de de stress particulier, car elle est de courte durée et réalisée en groupe. Les animaux bénéficient de conditions d'hébergement enrichies (Tunnel, coton pour la nidification) et sont maintenus par paires. Des protocoles d’anesthésie/ analgésie sont en place pour minimiser la douleur. Un suivi hebdomadaire sera effectué et en cas de signes de souffrance (d’après une grille d’évaluation de l’état général) le vétérinaire sera alerté. Un traitement symptomatique pourra être mis en place, puis une euthanasie sera pratiquée si aucune amélioration n'est observée.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère le plus fréquemment utilisé à cause de ses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l’Homme. Animal de petite taille, son temps générationnel est court. C'est également un modèle de référence en radiobiologie. Les membres des équipages exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 8 à 12 semaines. L'étude de la spermatogenèse implique que l'ensemble des animaux soient des souris mâles. Les astronautes exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 2 à 3 mois . Les animaux receveurs destinés aux procédures 2 et 3 auront de 7 à 9 semaines pour tenir compte des chronologies expérimentales (délai de stérilisation : 1 mois; analyse post greffe : 2 à 3 mois pour la spermatogenèse, 2 à 4 mois pour l'hématopoïese).
Impact des polluants environnementaux sur le neurodeveloppement et le vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 036 souris boivent une eau chargée en fongicides ou en résidus de plastique, les femelles un à deux mois avant la reproduction puis pendant la gestation et l'allaitement, leur descendance dès la vie utérine et jusqu'au jour de sa mise à mort. 752 jeunes et 752 souris âgées passent des tests d'interaction sociale et d'activité, 128 femelles gestantes subissent une chirurgie de 30 à 45 minutes pour électroporer de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons, et 92 souris reçoivent un médicament de l'hyperactivité pour confirmer qu'elles en présentent les signes. Toutes sont tuées, tissus prélevés pour y chercher des marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives. Le porteur affirme n'avoir observé ni douleur ni souffrance aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et place le bénéfice attendu dans une révision éventuelle de cette réglementation.
Objectifs
Les objectifs du projet de recherche sont d'étudier les effets de certains polluants fréquemment détectés dans notre environnement sur le neurodéveloppement et le vieillissement. Nous nous interessons à différents polluants: - les fongicides, très largement utilisés pour le traitement de la vigne et pour préserver les fruits de la moisissure grise après récolte. Des études scientifiques ont d’ailleurs révélé que des résidus de fongicides font partie des pesticides les plus fréquemment détectés dans l’alimentation française. Récemment, ces résidus ont été retrouvés dans les petits pots destinés à l'alimentation des bébés, mais aussi dans l'air et dans l'eau. Nous avons montré précédemment que l'exposition à 3 fongicides à la dose reglementaire, autorisée dans l'eau potable, aggrave les marqueurs de la maladie d'Alzheimer dans un modèle de souris génétiquement modifié. Notre objectif est donc d'étudier l'impact de ces composés sur le neurodevelopppement, puis au cours du vieillissement chez la souris. Notre hypothèse est que ces composés pourraient induire des altérations moléculaires lors du développement du cerveau conduisant à des défauts de comportements, voire à un phénotype de type autistique, caractéristique des pathologies neurodéveloppementales. De la même manière, nous nous intéressons aussi à 3 types de résidus plastiques : -les PET (polyethylène téréphthalate), les PVC (polychlorure de vinyle) et les PS (polystyrène) présents dans les emballages alimentaires. Des résidus type "nanoplastiques" contaminent directement les aliments ou l'eau des bouteilles. Par ailleurs, les "microplastiques" issus de la dégradation de déchets plastiques de plus grande taille, envahissent les océans et les eaux de surface type lacs ou rivières, et sont une voie d'entrée dans la chaine alimentaire. Leurs impacts sur l'environnement et la santé sont préoccupants. Notre objectif est d'étudier leurs effets sur le neurodéveloppement et le vieillissement.
Bénéfices attendus
Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : - identification des polluants perturbant le neurodéveloppement et le vieillissement (au niveau moléculaire, cellulaire et phénotypique). - les expositions utilisées dans notre modèle correspondent aux doses réglementaires à ne pas dépasser dans l'eau potable ou à faibles doses, en fonction des résultats obtenus, une révision de la réglementation actuelle pourrait être envisagée - si les animaux développent des phénotypes spécifiques de certaines pathologies (autisme, Parkinson, Alzheimer,TDAH), ces données permettraient d'expliquer en partie l'étiologie de ces maladies et de proposer des méthodes préventives.
Procédures
Les nuisances subies par les animaux sont les suivantes : 1) Exposition des animaux, femelles gestantes et progénitures, aux polluants environnementaux dans l’eau de boisson. Les femelles sont exposées entre 1-2 mois avant la reproduction et pendant toute la durée de la gestation, lactation, jusqu’au sevrage des petits. La progéniture est exposée in utéro, pendant la lactation, et jusqu’à leur date d’euthanasie. Nombre total d’animaux exposés dans l’étude : 3036. 2) Analyse de la morphologie de la progéniture, et tests d'observation et de comportements chez des animaux jeunes. Ces tests comportementaux sur la progéniture seront effectués dès 3 jours post-natal jusqu'à 3 mois. La durée est variable selon le test: entre 1 min pour les tests d'observation du phénotype, et jusqu'à 3 séances consécutives de 10 min pour les tests d'interactions sociales. Ces tests sont non-invasifs. Nombre d'animaux = 752. 3) Tests de comportements chez des animaux âgés à 3, 6, 9 et 12 mois. Les animaux ont 1 séance de 10 min par jour pendant 3 à 5 jours selon le test. Ces tests sont non invasifs. Nombre d'animaux = 752 animaux. 4) Des résultats préliminaires ont montré que les animaux exposés à certains polluants développent un comportement type trouble déficitaire de l’attention et hyperactivité (TDAH). Il existe un traitement médicamenteux chez l’humain pour traiter le TDAH, et notre objectif est d’administrer ce médicament aux souris afin de les soigner. Cela permettra de confirmer que les animaux ont bien un phénotype TDAH. Dans ce but, les souris subiront deux injections, une injection par test de comportement, mesurant soit l’activité locomotrice, soit l’impulsivité. Ces tests sont non invasifs et durent entre 5 min et 1h30. Nombre d'animaux = 92 animaux.5) Chirurgie sur des femelles gestantes pour marquer les cerveaux des embryons avec de l’ADN. Cette intervention va induire la production de protéines fluorescentes pour visualiser les cellules du cerveau en développement. La nuisance va durer le temps de l’intervention chirugicale, entre 30-45 min selon le nombre d'embryons à électroporer par femelle, et la durée du rétablissement des femelles opérées (7 jours). Nombre d'animaux = 768 (dont 128 femelles opérées).
Impact sur les animaux
D'après nos études conduites chez des souris adultes génétiquement modifiées (modèle Alzheimer) traitées aux fongicides pendant 11 mois, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, nous n'avons pas observé de douleurs, souffrance, perte de poids, stress, consécutives au traitement. De même, chez les souriceaux préalablement exposés aux polluants pendant la gestation, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et analysés à 3 jours post-natal, nous n'avons pas observé d'anomalies morphologiques, de douleur ou de souffrance induites par l'exposition aux fongicides. Les nuisances attendues pour le traitement par les composés aux doses indiquées sont légères. Pour les chirurgies, les nuisances attendues sont des nuisances post-opératoires de classe modérée : douleurs, saignement suspect, mobilité (prostration éventuelle), aspect du pelage (terne, hérissé), éventuelle inflammation abdominale, infection ou problème de délivrance.
Devenir
A l'issue des 5 interventions décrites ci-dessus en 5.6.1, tous les animaux (3036) seront euthanasiés et les tissus prélevés pour analyser les marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives.
Remplacement
Nous avons déjà étudié les effets des fongicides sur des modèles cellulaires. Nos travaux ont montré que les fongicides ciblés dans ce projet sont toxiques pour les cultures de neurones à de faibles concentrations. Nous étudions également les effets des fongicides sur les cellules souches issues de patients Alzheimer. Pour les différents plastiques, nous avons montré dans des études in vitro, qu'ils favorisaient la formation d'aggrégats de protéines. Toutefois, étudier les effets de ces polluants sur la cognition et le comportement, en lien avec des pathologies de type autisme ou des maladies neurodégénératives, telles que Alzheimer, nécéssite d'avoir recours à un modèle plus complexe telle que la souris.
Réduction
Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 3036 souris sur la durée du projet, réparties en 5 procédures. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avec un faible nombre d'animaux avant de générer l'ensemble des expériences prévues. D'autre part, les études sur le PVC et PET seront réalisées ultérieurement après les études sur le PS. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.
Raffinement
Les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité avec les fongicides à la dose maximale autorisée dans l’eau potable par l’Union Européenne et dose utilisée dans l’étude, ni pour les résidus de plastiques, car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. D'après nos résultats obtenus sur les fongicides, et à ces doses, il n’est pas attendu de souffrance chez l’animal. Les animaux (5/cages) seront hébergés sous surveillance quotidienne, dans un milieu enrichi, avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson, avec ou sans polluants. Si les points limites adaptés à nos expérimentations sont atteints lors de l’expérimentation les souris seront euthanasiées. Concernant les souris qui subissent une chirurgie: l’acte chirurgical est réalisé de préférence le matin pour suivre le réveil des animaux pendant la journée et s’assurer de l’absence de complications post-opératoires. Les femelles seront anesthésiées pendant la chirugie. En post-opératoire un analgésique sera administré pour éviter la douleur. Les souris sont surveillées régulièrement pendant la période post-opératoire. Concernant les points limites pour les femelles électroporées, une grille de suivi adaptée sera mise en place avec 5 critères notés de 0 (bon) à 5 (mauvais). Si le score se situe entre 0 et 9, l'animal est considéré bien portant, entre 10 et 12, une surveillance augmentée est mise en place, et au delà de 12, l'animal est euthanasié. Cette décision est prise par le personnel formé qui réalisera la procédure.
Choix des espèces
Dans les modèles d'expositions aux polluants environnementaux pendant la gestation, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses biochimiques et histologiques; - des études précédentes sur l'exposition aux polluants ont permis de mettre en évidence des modèles d'autisme et de TDAH chez la souris. Les souris sont donc un bon modèle de pathologies neuro-développementales et de vieillissement, c'est pourquoi nous privilégions les souris sauvages dans ce projet. Les mères seront traitées avec les polluants avant l'accouplement (1 ou 2 mois selon le polluant), puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à la concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux polluants tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront soumis aux polluants à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.
Rôle d’un traitement aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Modifiées pour que le récepteur des glucocorticoïdes puisse être désactivé dans leurs cellules souches musculaires, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le génotypage passe par un tatouage au doigt ou l'amputation de la première phalange, sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Suivent cinq injections de tamoxifène, une injection de cardiotoxine qui lèse le muscle, puis selon les groupes de la dexaméthasone en intrapéritonéal ou un gavage quotidien de prednisone pendant deux fois sept jours, le porteur précisant qu'aucune anesthésie ni aucun analgésique n'est prévu. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine étant sorties de l'étude et tuées.
Objectifs
Les muscles représentent plus de 40 % de la masse corporelle et permettent le maintien de la posture et le déplacement. Suite à une lésion, le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à partir des cellules satellites, des cellules souches localisées à la périphérie des fibres musculaires. Ce processus prend environ un mois à l'issue duquel les muscles sont régénérés et le pool de cellules satellites disponible pour une éventuelle nouvelle lésion est rétabli. Bien que les cellules satellites possèdent un grand potentiel en médecine régénérative, les mécanismes régulant leur prolifération et leur différentiation sont encore mal caractérisés. Les glucocorticoïdes, comme la prednisone, sont des anti-inflammatoires prescrits dans le cas de maladies chroniques telles que l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. Cependant, des traitements prolongés avec ces composés peuvent induire une perte de la masse musculaire, posant un sévère problème clinique, en particulier chez les personnes âgées. Les glucocorticoïdes exercent leurs actions via leur récepteur, le récepteur des glucocorticoïdes (GR), qui va contrôler l’expression de gènes cibles. Des études in vitro montrent que les glucocorticoïdes promeuvent la différenciation cellulaire. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la régénération musculaire en jouant sur la différenciation des cellules satellites. Pour ce faire, nous invaliderons sélectivement GR dans les cellules satellites avant d'induire une lésion à la cardiotoxine, et nous déterminerons si un traitement avec un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes permet une amélioration ou au contraire une aggravation des dommages musculaires.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes dans le processus de régénération musculaire.
Procédures
Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance. L'ensemble des animaux subiront 5 injections au tamoxifène pour induire la mutation par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec / souris), ainsi qu'une injection de cardiotoxine pour induire une lésion musculaire (30 sec / souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement aigü aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera en plus injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement chronique aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera quant à lui traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 2 fois 7 jours.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène peut très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. Le gavage peut conduire à des fausses routes et les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Dans les deux cas, les animaux seront sortis de l'étude et mis à mort. La phalangectomie effectuée pour le génotypage peut engendrer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris et la cinétique de régénération sont similaires à celles de l'Homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle CreERT2 et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'extraction d'ARN et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux. De plus, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test de Student ou d'une ANOVA au risque de se tromper de 5%.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène, de cardiotoxine et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L’injection de dexaméthasone et le gavage à la prednisone ne sont en général pas problématiques pour l'animal. Néanmoins, s’ils sont mal effectués et entrainent des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. Le projet s’intéresse au rôle de GR dans la régénération musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités au tamoxifène entre 7 et 11 semaines afin d'effectuer les expériences sur des animaux adultes. Ils seront ensuite analysés un mois ou un an après afin de déterminer le rôle des glucocorticoïdes chez les souris jeunes et âgées.
Génération de tumeurs du système lymphatique chez la souris pour établir un modèle d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Contenues et pesées deux fois par semaine, les souris sont examinées à la recherche de ganglions hypertrophiés, d'une posture voûtée ou d'une perte de poids, signes que le lymphome se développe et qu'il faut les tuer avant leur mort "naturelle". 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et leurs tumeurs. L'objectif est de constituer un stock de tumeurs à partir duquel une même tumeur sera réimplantée dans plusieurs souris receveuses, pour alimenter de futures études précliniques sur le lymphome diffus à grandes cellules B. Le porteur annonce que certaines souris recevront une injection d'une minute pour ce transfert de cellules tumorales, sans dire combien, et ne mentionne aucune analgésie.
Objectifs
Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Actuellement, il y a un manque de modèles expérimentaux qui ressemblent avec précision au lymphome diffus à grandes cellules B. L'objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l'aide d'un nouveau modèle de souris permettant de suivre l'initiation et la progression du lymphome. Ce modèle nous permettra d'étudier les causes du développement du lymphome ; et grâce à l'expansion de ces tumeurs chez des souris receveuses, nous générerons suffisamment de matériel pour des applications précliniques, y compris de futures études in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
À court terme (1-3 ans), nous générerons des informations importantes sur les gènes et les voies qui contribuent à l’apparition et à la progression du lymphome, qui sont actuellement inconnus. À long terme (3-5 ans), ces modèles permettront de réaliser des études précliniques pour identifier de nouvelles façons de tester de nouvelles thérapies afin de faire progresser les traitements contre les cancers du sang.
Procédures
Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Les tissus seront collectés pour déterminer les causes de la formation de tumeurs et générer un référentiel de tumeurs. Certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer des cellules tumorales.
Impact sur les animaux
Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Des injections entrainent également du stress et des douleurs légères de courte durée.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.
Remplacement
Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux. De même, la même tumeur récoltée peut être utilisée pour implanter plusieurs souris receveuses, limitant ainsi la nécessité d’augmenter le nombre de souris donneuses.
Réduction
L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.
Raffinement
Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement de lymphomes, les souris vieilliront jusqu'à 14 mois, puisque la latence de cette maladie, d'après nos études précédentes, se situe entre 8 et 14 mois. Pour les expériences impliquant le transfert de cellules de lymphome, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont couramment utilisées comme souris receveuses.
Evaluation d’une thérapie anti-complément dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes : Projet HMGCR ANTImyoDY two
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
Des injections quotidiennes d'immunoglobulines prélevées chez des patients, pendant sept à dix-sept jours, provoquent chez la souris une myopathie nécrosante avec perte de force musculaire. 154 souris, dont une partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles gastrocnémiens. Elles subissent en plus deux à quatre microprélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à cinq tests d'agrippement et une mesure de force in situ de dix minutes. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, tout en décrivant une échelle qui va de la queue traînante à la paralysie du train arrière et un protocole arrêté au score 2.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) ; dont l'aAc anti SRPP (anti-3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-Coenzyme A Réductase) avec une corrélation du titre avec la myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d'immunoglobulines G purifiées issues de patients porteurs cet d’aA anti-HMGCR. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de molécules du sytéme du complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Nous avons déja démontré l'efficacité préventive d'un inhibiteur spécifique du complément. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel inhibiteur spécifique du complément humain dans notre modèle murin de MNAI par transfert d'anticorps de malades et de la comparer à celle d'un autre inhibiteur commercialisé mais de spécificté différente et de la molécule antagoniste. Pour ne pas avoir de réponse xénogénique lors de la procédure évaluant le rôle curatif de cette molécule, nous aurons recours à des souris immunodéficientes. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal, nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Avec ce nouvel inhibiteur du fragment C2 du complément nous pouvons nous attendre à une restauration partielle ou complète de la fonction musculaire de l'animal ouvrant ainsi la porte à un essai clinique chez les patients atteints de MNAI.
Procédures
Les animaux seront soumis à des microprélèvements de sang (2 à 4 en fonctions des groupes d'animaux) de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, par voie intra péritonéale (IP), durant 7 à 17 jours selon les groupes, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des immunoglobulines G en IP, de 2 à 5 fois par souris selon les groupes, sur respectivement une période de 7 à 17 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Une mesure de la force musculaire par test d'agrippement (grip test) sera réalisée pour chacune des souris, durée moins de 10 secondes, jusqu'à 5 tests sur le temps de suivi des souris. Mesure de la force musculaire in situ-sur souris anesthésiée, 1 seule mesure par souris, en fin de procédure, durée 10 minutes.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal dans l'évaluation de molécules thérapeutiques a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercussion visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de moléculesinhibitrices du complément dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. De plus, en raison de leur sensibilité aux infections, les animaux seront maintenues en portoir ventilé. Les prélèvements sanguins, la mesure de la force musculaire et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse grâce à un matériel dédié. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante: Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration, ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de dispositions pour réduire la douleur. Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place lors de la première injection des anticorps pour les animaux de tous les lots. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré en sous cutané 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par un des tests adaptés.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Effet de différents traitements dans des modèles d’addiction et de trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) chez la souris ou le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2500
Perte de poids d'au moins 20 %, hypothermie, anorexie prolongée, automutilation : les rongeurs qui présentent ces signes plus de 24 heures sont sortis des expériences et tués. 4 850 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Ils reçoivent des psychostimulants jusqu'à trois fois par semaine pendant six semaines, développent hyperactivité et stéréotypies de léchage, de rognage et de reniflement, et passent jusqu'à dix-huit tests de locomotion d'une heure dix, plus sept passages en labyrinthe en T le même jour. L'objet réel est le criblage de molécules pour des formulations dissuasives, associant un stimulant prescrit et un composé censé en limiter l'abus, avant une éventuelle utilisation chez l'être humain.
Objectifs
Les psychostimulants prescrits sont aujourd’hui indiqués pour le traitement du trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH). Ces traitements vont réduire les symptômes liés à la maladie en augmentant l’attention et la vigilance et en réduisant l’hyperactivité. Ils sont généralement sans danger lorsqu’ils sont utilisés à des doses thérapeutiques via la voie d’administration autorisée. Cependant, ces stimulants présentent un potentiel addictif important et sont classés comme substance contrôlée par les organismes de réglementation. L’abus et le mésusage de psychostimulants est devenu un problème de santé majeur. Ces médicaments sont détournés de leur usage normal dans un but récréatif. En effet, le mésusage des médicaments prescrits sur ordonnance peut inclure : la prise d’une dose incorrecte, ou au mauvais moment, oublier de prendre une dose, arrêter le médicament trop tôt. L’abus est défini comme soit l’utilisation sans ordonnance, soit en plus grande quantité et/ou plus souvent, soit par une voie d’administration non autorisée telle que la voie intranasale ou intraveineuse.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la prévention de l’utilisation abusive, de la dépendance et de l’addiction aux stimulants prescrits. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement des formulations dissuasives par combinaison d’un stimulant et d’une molécule pour prévenir les abus, les mésusages et l’addiction associés à la prise de psychostimulants.
Procédures
Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au cours et en fin de procédure (soit entre 1 et 3 prélèvements maximum par animal). Tous les animaux recevront une injection sous cutanée pour l’implantation de la puce d’identification RFID. Les animaux recevront les administrations des traitements soit par voie intrapéritonéale, orale ou intraveineuse. Pour la procédure 2, en cas d’administration par voie intrapéritonéale ou orale, les animaux recevront 3 injections par semaine pendant 6 semaines maximum. En cas d’administration par voie intraveineuse, la fréquence est adaptée et les animaux recevront 2 injections par semaine pendant 4 semaines maximum. Concernant les tests comportementaux, pour la procédure 1, les animaux seront soumis à 2 tests de locomotion sur 3 jours (pour une durée totale de 2 heures et 20 minutes). Pour la procédure 2, les animaux seront soumis à 18 tests maximum de locomotion sur une période de 6 semaines (3 tests/semaine) qui dure chacun 1 heure et 10 minutes. Pour la procédure 4, les animaux seront soumis à 7 tests au sein du labyrinthe en T qui auront lieu le même jour (soit 20 minutes de test maximum par animal le jour du test). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.
Impact sur les animaux
Du fait de l’administration aigu ou chronique de psychostimulants, les animaux vont développer une hyperactivité et/ou des stéréotypies comportementales (mouvements anormaux et involontaires de type léchage, rognage, reniflement) lors des sessions expérimentales. Ces comportements sont transitoires et disparaissent au bout d’une ou deux heures pour l’hyperlocomotion ou au bout de plusieurs minutes pour la stéréotypie après l’administration du stimulant. Ces comportements seront surveillés lors de chaque expérimentation. L’administration aigue d'une molécule va induire des déficits cognitifs qui seront transitoires (24 heures). Une session d’acclimatation ou test d’essai seront réalisés afin de réduire le stress des animaux au nouvel environnement. Également, l’isolement et le changement de boisson intervenant dans certaines expérimentations peuvent induire du stress et de l’anxiété chez les animaux. Ces paramètres seront surveillés en observant le comportement de l’animal dans sa cage, en vérifiant la prise de nourriture et de boisson. De plus, le poids des animaux sera suivi entre 2 et 5 fois par semaine. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés.
Remplacement
Ce projet se focalise sur des modèles expérimentaux d’hyperactivité, de sensibilisation comportementale et de TDAH nécessitant l’utilisation d’animaux. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal et il n’existe pas de modèle cellulaire ou autre pouvant reproduire nos procédures expérimentales. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de notre combinaison (stimulant/molécule). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (implantation des puces d’identification) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes et les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. Un tableau de suivi a été mis en place en adaptant les points limites au seuil le plus bas. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié. Afin de diminuer le stress des rongeurs, leur milieu sera enrichi avec du matériel de nidification afin que les animaux puissent se cacher et ronger. La sociabilisation avec l’expérimentateur sera plus importante pour les animaux isolés dans leur cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux ou leur locomotion, l’administration de psychostimulant induisant une hyperlocomotion. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés. Ces deux espèces sont appropriées pour les études comportementales. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en addictologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces. Afin de pouvoir étudier la période d’adolescence chez nos animaux, ils auront au moins 6 semaines au début de chaque procédure. En effet, l’adolescence se caractérise par un risque important de développer une addiction ou des troubles liées à l’utilisation de substances. Il est donc important d’étudier cette période chez les animaux et de la comparer aux animaux adultes. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée scientifique du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou au contraire changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Également, le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante.