Procédures modérées

Une partie de la vessie retirée puis remplacée par un implant du commerce, huit cochons miniatures subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont ensuite hébergés seuls pendant trois à six mois, le porteur reconnaissant que l'isolement d'une espèce grégaire peut créer stress et anxiété, avant une cystoscopie sous anesthésie puis la mise à mort pour analyse de la vessie, du foie et des reins. Il s'agit de vérifier qu'un implant de 4 à 8 cm de diamètre régénère du tissu vésical à une taille jugée transposable à la chirurgie humaine, deux essais précédents ayant porté sur des implants plus petits. Le texte du RNT décrit six animaux répartis en deux groupes, alors que huit sont déclarés au titre des atteintes attendues, sans que cet écart soit expliqué.

Objectifs

Le projet porte sur le développement d'un implant tissulaire pour la reconstruction de la vessie. La reconstruction de la vessie est nécessaire dans certaines malformations congénitales. La référence en matière de remplacement de la vessie est l’utilisation d’un segment d’intestin mais le contact entre les urines et l’intestin entraîne des complications telles qu'une production excessive de mucus, des calculs urinaires, des troubles métaboliques et, à long terme, même une tumeur maligne. C’est pourquoi les chirurgiens recherchent de nouvelles méthodes de reconstruction de la vessie. L’ingénierie tissulaire constitue une approche prometteuse pour fabriquer des substituts de novo à la vessie. Plusieurs stratégies peuvent être envisagées mais nous pensons que la médecine régénérative guidée avec laquelle on fournit un « squelette » implanté qui fournit une structure architecturale temporaire et orchestre l'attachement/la croissance cellulaire et la régénération du tissu in vivo est plus attractive avec des produits disponibles dans le commerce et prêts à l'emploi. Jusqu'à présent, ces implants ont été utilisés avec succès pour la réparation d'urètre chez le lapin et le chien et la sécurité des implants a été confirmée dans une étude préliminaire chez l’Homme sur la réparation des sténoses urétrales. Ces implants ont également démontré une régénération tissulaire dans un modèle d'augmentation vésicale de lapin (2,5 cm x 2,5 cm) et un modèle d’augmentation vésicale de porc (2 porcs, implant de 4,5 cm de diamètre). Par contre, la taille de l’implant était trop petite par rapport aux besoins cliniques chez l’Homme. Il est donc nécessaire de poursuivre nos recherches avec des implants de plus grandes tailles qui représentent mieux la réalité clinique. Ainsi, l'objectif de cette étude est de démontrer la capacité des implants de 4 et 8 cm de diamètre (taille d'implant cliniquement pertinente) de régénérer du tissu vésical dans un modèle d’augmentation vésicale de porc.

Bénéfices attendus

Une intégration réussie de l'implant suivie d'une régénération tissulaire au site d'implantation confirmerait le potentiel de l’implant régénératif à devenir une option thérapeutique pour les patients nécessitant une augmentation ou une reconstruction vésicale partielle de la vessie. Un implant du commerce et prêt à l'emploi permettrait d'éviter un deuxième site chirurgical en chirurgie reconstructive de la vessie et réduirait ainsi tous les risques liés au prélèvement de tissu intestinal actuellement utilisé pour la reconstruction de la vessie. Les avantages de l'implant peuvent être résumés par des risques moindres de complications postopératoires, des durées chirurgicales plus courtes et une récupération plus rapide.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de type cystectomie partielle (opération qui consiste à enlever seulement une partie de la vessie) avec réparation par implant régénératif. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés pour une durée de 3 mois (n = 2) ou 6 mois (n = 4) avant euthanasie. Avant l'euthanasie des animaux, ils seront soumis à une cystoscopie (réalisés sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Le premier effet indésirable potentiel est en lien avec la chirurgie subie par les animaux. Parmi les effets indésirables possibles en lien à la chirurgie, il est possible que l’animal éprouve une douleur malgré le protocole d’analgésie, la plaie chirurgicale peut aussi saigner, s’infecter ou mal cicatriser. Le second effet indésirable potentiel est lié l’hébergement des animaux. En effet, suite à la chirurgie et pendant une durée de 3 à 6 mois, les animaux seront hébergés individuellement. Les porcs étant une espèce grégaire cela pourrait créer un stress et une anxiété chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort suite à la procédure car des prélèvements post-mortem doivent être réalisés pour analyse histologique (vessie, foie, rein).

Remplacement

Les implants ont subi de nombreux tests in vitro pour démontrer leur sécurité, leur conformité chirurgicale et leurs interactions favorables avec les cellules. Les tests in vivo sur le site clinique pertinent sont la seule possibilité d'évaluer la régénération fonctionnelle des tissus. La régénération tissulaire est une interaction complexe entre l'implant et le tissu environnant du site d'implantation avec ses cellules vivantes et ses processus médiés par les intégrines. Par conséquent, il est important de tester un implant d’une taille cliniquement pertinente sur le site d’implantation clinique ciblé.

Réduction

Ce projet est une étude de faisabilité. L'étude est donc réalisée avec un nombre réduit d'animaux (n = 6 avec 2 tailles d'implants testés 4 (n = 2) et 8 cm (n = 4).

Raffinement

La chirurgie est réalisée par des chirurgiens spécialisées en collaboration avec des personnels scientifiques et techniques formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie sur modèle porcin. L'anesthésie et l’analgésie durant les interventions ont été conçues pour supprimer la douleur induite par une chirurgie et la manipulation des viscères. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un suivi assuré par les techniciens en expérimentation ainsi que par les différents intervenants. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire sera consulté et les animaux traités en conséquence.

Choix des espèces

Le miniporc est très proche de l’Homme en terme de physiologie et d’anatomie. La taille de sa vessie est appropriée pour réaliser une cystectomie avec une taille d’implant cliniquement pertinente. Le recours au mini-porc est donc pertinente pour pouvoir transposer les résultats à l’humain. Les animaux seront adultes. La croissance d’un animal jeune pourrait interférer avec la reconstruction de la vessie.

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Six micro-prélèvements de sang à la veine submandibulaire sur animal vigile, quatre échocardiographies sous anesthésie profonde et 21 semaines de protocole : 60 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avant d'être mises à mort pour prélèvement d'organes. Une injection dans le sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale et analgésie locale, ouvre la séquence. L'objet est d'observer le rôle d'une protéine transportant le phosphate dans la calcification des vaisseaux au cours de l'athérosclérose, sur des souris génétiquement modifiées pour ce gène. Les douze souris par groupe ne sont justifiées que par des travaux antérieurs et une analyse statistique dont le RNT ne dit rien de plus.

Objectifs

L’athérosclérose est caractérisée par la formation de plaques lipidiques dans les vaisseaux sanguins et aboutit à la formation de dépôts calciques. Nous avons ici pour objectif d’étudier le rôle d'une protéine dans le développement des calcifications des vaisseaux sanguins au cours de l’athérosclérose en utilisant un modèle de souris génétiquement modifiée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de de ce projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes qui sont responsable de l’apparition de calcifications vasculaires dans la maladie de l’athérosclérose

Procédures

- 1 injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous analgésie locale et anesthésie générale (durée totale : 15 minutes) - 6 micro-prélèvements de sang (50µl) à la veine submandibulaire sur animaux vigiles pendant les 21 semaines du protocole (durée d'un prélèvement < 1 minute) - 4 séances d’échocardiographie sous anesthésie profonde (durée d'une échocardiographie : 15 minutes) - Pesée des animaux 1 fois par semaine pendant 21 semaines

Impact sur les animaux

Un stress modéré est attendu lors des micro prélèvements sanguins et lors de la pesée des animaux

Devenir

mis à mort pour prélèvement d'organe

Remplacement

Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine multifonctionnelle, notamment connue pour transporter du phosphate de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule. La régulation de l’homéostasie phosphocalcique est une composante importante pour nos problématiques ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier. De plus, la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement complexe de l’athérosclérose nécessite de travailler sur animal vivant.

Réduction

Dès que cela est possible, nous utilisons des modèles cellulaires dédiés aux questions posées. Nos précédents travaux, ceux publiés dans la littérature et notre analyse statistique préalable, 12 souris par groupe est suffisant pour notre étude

Raffinement

Le suivi de l’animal par échocardiographie sera réalisé sous anesthésie générale. L’injection intraveineuse est effectuée sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux sont surveillés par la mise en place d'une fiche de suivi de l'état général des souris du début à la fin du protocole. Les animaux seront hébergés par 5 en environnement enrichi.

Choix des espèces

Ce projet est basé sur le phénotypage de souris génétiquement modifiée sur notre gène d'intérêt pour comprendre le développement de l'athérosclérose. Ces modèles animaux sont des modèles intégrés, unique moyen d’observer les effets systémiques sur le développement de cette pathologie. L'athérosclérose est une pathologie cardiovasculaire apparaissant chez l'adulte. Nous utilisons donc des animaux adultes mâles et femelles âgés de 10 semaines.

Non mis à mort à l'issue mais rendus disponibles pour une prochaine expérience après une période de repos, trois macaques à longue queue déjà utilisés dans un projet antérieur subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une sonde est introduite dans leurs narines jusqu'à l'œsophage pour administrer deux fois, à trois semaines d'écart, un candidat médicament contre le cancer du foie. Leur sang est ensuite prélevé sans anesthésie à la veine ou à l'artère fémorale, jusqu'à 10 % du volume circulant, avec un risque d'hématome et d'anémie transitoire. Le donneur d'ordres n'attend aucun effet indésirable puisqu'il a déjà testé la molécule sur des primates non humains à doses plus élevées, et le porteur décrit cette étape comme "indispensable" à la poursuite des essais réglementaires chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet repose principalement sur la réalisation de prélèvements sanguins pour l’isolement de plasma et de cellules mononuclées du sang périphérique après administration d’un candidat médicament chez le primate non humain. Le candidat médicament servira dans le traitement des carcinomes hépatocellulaire, une forme de cancer primitif du foie. Les doses qui seront testées dans ce projet sont des doses que l'on sait non toxiques car déjà testées à des concentrations plus élévées sur le primate non humain par le doneur d'ordres. L’objectif sera double : tout d’abord l’étude pharmacocinétique de la molécule et l’étude de sa pharmacodynamie dans le sang du primate non humain.

Bénéfices attendus

L’étude de la pharmacocinétique d’une molécule à une concentration donnée permettra de prédire la dose administrable à l’homme. Réaliser ces tests sur un petit nombre d’animaux permet de déterminer les doses qui seront utilisées par la suite dans des études réglementaires plus conséquentes, mais permet également de réduire le nombre d’animaux et de raffiner leur utilisation en administrant une molécule dont on a déjà établi un profil, ce qui va permettre d’adapter le suivi.

Procédures

Les animaux de cette étude recevront un candidat médicament pour le traitement des carcinomes hépatocellulaire par voie orale à deux reprises espacées d’environ 3 semaines. Pour ce faire, la contention de l’animal se fera dans son hébergement à travers les barreaux dans le module d’isolement. Ce mode de contention permettra d’éviter de sortir l’animal complètement, réduisant son stress, et la durée de contention. Pour l’administration par voie orale, une sonde sera insérée dans l’œsophage de l'animal via les narines. Une seringue sera ensuite adaptée sur la sonde et la solution sera administrée à l’animal. L’administration durera quelques secondes. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les procédures internes validées par le vétérinaire et avec les recommandations éthiques en vigueur. Tous les animaux de cette étude seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau des veines et/ou artères fémorales et/ou céphaliques, sans anesthésie, d'une durée de quelques secondes (de 10 secondes à 30 secondes) en fonction du nombre de tubes à remplir. Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques et ne dépasseront pas 7mL/Kg soit 10% du volume sanguin circulant suivi d'une période de repos de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et/ou l’apparition d’hématome(s) au niveau de la zone de ponction. Lors de prélèvements fréquents ou en grande quantité, une anémie transitoire peut également apparaître. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivants les administrations. Un suivi de la température corporelle sera donc réalisé pendant plusieurs jours post-administration. Pour ce protocole, le donneur d’ordres n’attend aucun effet indésirable spécifique lié à son candidat médicament car celui-ci a déjà été testé sur le primate non humain à des doses plus élevées que celles qui seront utilisées dans ce protocole.

Devenir

A la fin de cette procédure, les animaux ne seront pas mis à mort et pourront être réutilisés après une période de repos selon les recommandations éthiques, selon l’avis du vétérinaire et de la structure du bien être animal.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet il n’est pas possible de remplacer l’utilisation de l’animal. En effet, déterminer le profil pharmacocinétique et pharmacodynamique de la molécule en fonction de la dose administrée permettra d’obtenir des informations sur le candidat médicament chez l’animal, indispensable au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. L’évaluation clinique des animaux effectuée avant et après administration de la molécule permettra d’observer et d’anticiper d’éventuels effets secondaires. Tous ces résultats permettront d’ajuster la dose optimale qui pourra être administrée chez l’homme, indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 3 (1 mâle et 2 femelles) non naïfs. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats interprétables et transposables à l’homme. En raison du faible nombre d’animaux, seules des analyses statistiques descriptives seront réalisées. Les animaux utilisés dans ce protocole sont non naïfs, donc issus d’un projet antérieur, de classe légère. Ils ont bénéficié d’un temps de repos adéquat et le vétérinaire ainsi que la structure du bien être animal ont autorisé leur réutilisation.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être des animaux et de leur permettre d’exprimer leurs besoins comportementaux primaires, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, avec des congénères qui ne seront pas inclus dans cette procédure, (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement (après les manipulations et en fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). De la musique est diffusée dans les salles d’hébergements en continu pendant la journée à un volume raisonnable, afin d’avoir une homogénéité sonore de leur environnement et contribue à diminuer le stress lié aux activités du personnel ou autres animaux des autres salles de l’animalerie. La température et l’hygrométrie des hébergements sont suivies et contrôlées quotidiennement. Les animaux disposent d’eau de boisson à volonté, d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids et de fruits et/ou légumes frais pour compléter et diversifier leur régime alimentaire. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel d’étude, formé et compétent. Deux observations sont faites quotidiennement avec prise en compte du stress et de la douleur potentiels. Enfin, un suivi pondéral des animaux est fait au minimum une fois par semaine pour suivre leur état de santé. Des points limites sont définis, adaptés aux besoins physiologiques des animaux. Un vétérinaire attitré est, au besoin, appelé afin d’évaluer l’état des animaux et de prescrire tous les soins nécessaires. Les animaux sont non naïfs, ils sont donc habitués à leur environnement et aux interactions avec les techniciens. Cependant, ils auront 28 jours d’acclimatation avant le démarrage de l’étude pendant lesquels ils auront des séances d’entrainement aux différents actes de l’étude avec un renforcement positif. Enfin, les animaux auront des temps de repos entre les prises de sang et les administrations du candidat médicament (environ 3 semaines). Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Le candidat médicament en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent. Enfin, la séquence d'acides aminés cible et déterminante dans le mécanisme d'action du candidat médicament n'a pas de différence significative entre l'homme et le primate non humain. De jeunes adultes seront utilisés de préférence pour des raisons de maturité du système immunitaire.

Marquées par entailles aux oreilles, vaccinées trois fois par voie sublinguale et trois fois par voie nasale sous anesthésie, saignées jusqu'à neuf fois par ponction à l'œil, 1 020 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est maintenue jusqu'à 22 mois pour tester les candidats vaccins sur des organismes vieillissants, le porteur signalant que cette durée d'hébergement peut entraîner alopécie, hypothermie et blessures de combat. La dernière étape est une trachéotomie terminale pour recueillir salive et mucus nasal, après quoi tous les animaux sont mis à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur présente la lignée choisie comme proche de l'humain sur le plan immunitaire, tout en la décrivant comme une étape avant le passage à des animaux "plus pertinents et proche de l'humain", les primates non humains.

Objectifs

Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée des pathogènes impliqués dans le cas de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après vaccination par voie muqueuse : la muqueuse sublinguale ou la muqueuse nasale. Un rappel vaccinal sera pratiqué par injection pour réactiver la réponse immunitaire et l’amplifier. Ces paramètres seront étudiés sur des souris de deux âges différents (8 semaines et 16 mois) afin de mesurer l’efficacité de différents candidats vaccins sur des animaux vieillissant. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire vaccinale au niveau des muqueuses, en fonction de l’âge et des différents candidats vaccins étudiés. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).

Procédures

Ci-dessous, la liste des interventions réalisées sur l’animal à chaque étape du projet : - L’identification : le marquage sera réalisé sur l'animal anesthésié par de petites entailles au niveau sur les bords des oreilles (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie sublinguale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). - Les administrations par voie intranasale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). - Les injections par voie sous-cutanée sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Le prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire une douleur modérée et un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 à 9 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les prélèvements de salive et du mucus nasal nécessitent une trachéotomie et une immobilisation de l’animal. Pour ces raisons, nous réaliserons ces prélèvements en phase terminale sous analgésie et anesthésie (1 fois/animal, durée : 40 minutes).

Impact sur les animaux

- Identification des animaux : ce geste d’inconfort peut entrainer la fragilisation de l’oreille et augmenter les risques de blessure en cas de combats. - Prise de température : la prise de la température au niveau de l’abdomen nécessite une contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles et sous contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang en rétro-orbitaire : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : pour les expériences concernant les animaux de 16 mois, les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 8 semaines et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…). Pour éviter cela, une surveillance hebdomadaire et un enrichissement de l’environnement sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour procéder à des prelèvements d’organes et de quantités importantes de fluides (sang, mucus).

Remplacement

Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 5 ans à 1020 souris. Pour les 3 procédures, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales. Un choix restreint de groupes expérimentaux a été fait après sélection de candidats vaccins in vitro. Les temps de chaque procédure ont été sélectionnés d’après nos précédentes expériences et par la littérature scientifique pour se focaliser uniquement sur les 3 temps d’analyses les plus pertinents. Nous avons également réduit le nombre d’animaux contrôles au strict minimum : 10 animaux contrôles « naïf » pour chaque âges (8 semaines et 16 mois) soit deux groupes par procédure. C’est-à-dire que dans chaque procédure, tous les groupes expérimentaux se réfèrent au groupe contrôle du même âge. De plus, selon l’avancée du projet, le nombre d’animaux est susceptible d’être réduit. En fonction des groupes expérimentaux, si les résultats obtenus lors des premières expérimentations ne donnent pas de données robustes, alors les expériences prévues pour les groupes similaires à des temps plus tardifs ne seront pas réalisées.

Raffinement

Dans ce projet, des points limites assez prédictifs ont été établis pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance des animaux. Dans l’ensemble du projet, voici les mesures appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux : - De l’enrichissement du milieu sera appliqué dès la réception de animaux. - Une période d’acclimatation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée après la réception des animaux. - L’identification individuelle des animaux sera réalisée grâce à des petites entailles au bord de l’oreille (moins sensible) et sous anesthésie générale. - La période de vieillissement (de 2 à 16 mois) sera ponctuée par des observations et des pesées hebdomadaires, additionnées à partir de 15 mois de mesures de la température corporelle. - Les administrations sublinguales et intranasales se feront sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins et des mucus se feront sous analgésie et anesthésie générale. - Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Un suivi des animaux à 4h/24h après chaque étape des procédures (identification, immunisations, prélèvements) et/ou au moins une fois par semaine sera réalisé. Ce suivi comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen) et des modifications végétatives (respiration anormale). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée, à 24h après chaque immunisation afin de détecter d’éventuelle montée de température. Concernant les souris âgées de plus de 16 mois, une prise de la température sera aussi réalisée au moins une fois par semaine afin de détecter une éventuelle hypothermie. - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie, ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.

Deux à quatre injections sous anesthésie et un prélèvement de sang qui expose à une infection de l'œil : 566 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort ensuite pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales, qui forment une tumeur rejetée en quatorze jours, ou une infection virale, afin de comparer les cellules immunitaires mémoires produites dans les deux cas. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du développement d'un cancer. L'effectif de 566 animaux n'est justifié que par un "minimum nécessaire et suffisant" à l'analyse statistique, sans autre précision.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si une tumeur transitoire, rapidement éliminée de l’organisme par le système immunitaire, est suffisante pour altérer la réponse immunitaire mémoires. Pour cela, les cellules mémoires générées en réponse à un virus ou un tumeur transitoire seront comparées.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes mise en place lors du développement d'un cancer.

Procédures

Chaque animal reçoit : 2 à 4 injections (15 secondes) sous anesthésie / 1 prélèvement sanguin (150 uL) sous anesthésie (10 secondes) / Anesthesie : 3 minutes pour anesthésie gazeuse , 30 minutes pour anesthésique injecté

Impact sur les animaux

Injection intraveineuse de cellules ou prélèvements : possibilité d'infection au niveau de l'oeil (très rare) Infection virale : Aucun signe clinique attendu Injection de tumeur : La tumeur n’est pas métastatique, n’excède pas 200 mm3 et est rejetée par les animaux en 14 jours.

Devenir

Mis à mort pour prélèvements des organes

Remplacement

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différents organes. Les procédures ne peuvent donc être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et en condition stérile afin de prévenir tout risque d’infection. Un collyre anesthésique est administré avant chaque prélèvement sanguin en prévention d'éventuelles infections. Des points limites bien définis et suffisament précoces permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au moment de l’immunisation, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.