Procédures modérées

Infectées sous anesthésie par Mycobacterium abscessus, puis soumises pour certaines à une ou deux injections quotidiennes d'antibiotiques pendant dix jours, 2 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, au plus tard trente jours après l'infection, pour mesurer la charge bactérienne dans leurs organes. Le porteur écrit que la bactérie persiste plusieurs semaines "sans donner de signes de maladie", et décrit par ailleurs des injections répétées susceptibles de provoquer un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Il ajoute que l'impact de ces injections sur le bien-être des souris sera évalué au cours de deux expériences préliminaires, menées sur des souris elles aussi injectées.

Objectifs

Mycobacterium abscessus est une bactérie responsable d'infections chroniques et de la détérioration des poumons chez les patients atteints de mucoviscidose ou d’autres affections pulmonaires. L'éradication de cette bactérie est extrêmement difficile car elle est résistante à un large éventail d'antibiotiques. Le traitement de la maladie pulmonaire causée par cette bactérie nécessite l'administration à long terme de plusieurs antibiotiques, ce qui entraîne des effets indésirables graves. Cependant, même les antibiotiques cliniquement pertinents ne sont pas très efficaces et l'infection à Mycobacterium abscessus est toujours considérée comme une maladie chronique incurable pour la plupart des patients, ce qui souligne le besoin urgent de développer des stratégies thérapeutiques alternatives. Au-delà de la résistance, nous émettons l'hypothèse que la tolérance aux antibiotiques, c’est-à-dire la capacité à survivre aux antibiotiques pendant une période de temps plus ou moins longue, contribue également aux mauvais résultats du traitement des infections à Mycobacterium abscessus. La tolérance est un phénomène adaptatif en réponse à des conditions de stress environnemental. Plusieurs études chez différents pathogènes bactériens ont établi que la tolérance aux antibiotiques a des implications cliniques importantes dans la gestion des infections chroniques, car elle contribue à allonger la durée du traitement antibiotique, à l'échec du traitement et à la rechute des infections chroniques, et à l'émergence de mutations conférant la résistance aux médicaments. Cependant les fonctions et adaptations qui contribuent à la tolérance aux antibiotiques chez Mycobacterium abscessus restent largement méconnues. Ce projet s’inscrit dans ce contexte et vise 1) à identifier les fonctions et adaptations bactériennes qui favorisent la tolérance aux antibiotiques chez cette bactérie lors de l’infection, 2) à tester si les traitements antibiotiques in vitro et chez les patients sélectionnent des bactéries qui survivent mieux aux antibiotiques et si ces bactéries ont un comportement différent chez l’hôte, et 3) à évaluer si bloquer les fonctions contribuant à la tolérance augmentent l’efficacité des traitements in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez Mycobacterium abscessus et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes de Mycobacterium abscessus altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre les infections mycobactériennes dans le but de réduire leur durée.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés avant d’être infectés (durée 2 à 3 minutes). Les bactéries utilisées persistent dans les organes pendant quelques semaines sans donner de signes de maladie chez les animaux infectés. La durée de l'expérience n’excèdera pas 30 jours. Certains groupes d'animaux recevront quotidiennement une ou deux doses d’antibiotiques administrée(s) par injection sur des animaux vigiles (durée 1 minute) pendant une durée maximale de 10 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’anesthésie et de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques (effets secondaires). Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (piqûre et contention) d’une durée d’environ 1 min/injection. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une ou deux injections quotidiennes (1min/injection) pendant 10 jours. Si plusieurs antibiotiques sont utilisés, ils seront injectés en même temps dans 1 injection. L’impact de ces injections sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires mais les injections répétées pourraient conduire à un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Le niveau attendue de ces nuisances est modéré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que Mycobacterium abscessus. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission et pour l'étude de la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans celles-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Toutes les expériences impliquant des animaux font l’objet d’un protocole expérimental écrit et validé par le responsable de l’animalerie. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie et analgésie lors de l’infection, limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et des injections d’antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. Pour l’expérience impliquant une injection quotidienne d’antibiotique, nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté. Un suivi particulier des animaux sera réalisé pour évaluer les nuisances associées à ces injections et d’éventuelles réactions secondaires : inflammation locale, grattage, plaie. Les injections seront réalisées en alternance sur 4 sites des flancs avec des seringues à insuline. En première intention, les injections seront réalisées sur animaux vigiles (rapidité et absence d’hypothermie). En cas de stress important des animaux, nous pourrons utiliser un anesthésique.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à étudier la persistance en présence ou absence d’antibiotiques, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistances variables à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Dans cette étude, notre laboratoire utilisera une lignée de souris qui présente une bonne résistance à l’infection par Mabs mais dans laquelle le pathogène peut persister pendant plusieurs semaines. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

L'objet déclaré est d'immuniser des souris pour en tirer des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique, à raison de cinquante études sur cinq ans. 1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq administrations d'antigène et quatre d'ARNm, plus des microprélèvements de sang jusqu'à deux fois par jour, avec pour effets annoncés des poils hérissés, une perte de poids transitoire et une modification du comportement. Celles dont la réponse immunitaire est jugée "satisfaisante" sont tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, les autres sont tuées aussi.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à immuniser des souris avec un antigène (peptide/protéine, plasmide, cellule ou vésicule) et/ou de l’ARNm transcrit in vitro (IVT) afin d’obtenir, in fine, des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer des méthodes analytiques nécessaires pour les études en oncologie.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération de potentiels candidats médicaments pour de l’immunothérapie ainsi que d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration de l’antigène (5 fois maximum hebdomadairement ou quinzomadairement, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de l’antigène (1 injection, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’administration de l’antigène. Stress et douleur légère lors de l’administration de l’ARNm. Possibilité d’effets indésirables légers et/ou modérés liés à l’injection de l’antigène ou de l’ARNm : Poils hérissés, modification temporaire du comportement, perte de poids transitoire.

Devenir

Les animaux présentant une réponse immunitaire « satisfaisante », contre l’antigène d’intérêt, seront mis à mort pour la collecte des organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la production in vitro des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme. En cas d’atteinte de point limite justifiant l’euthanasie en cours d’étude, les animaux seront également mis à mort.

Remplacement

La génération d’anticorps est un mécanisme complexe issus d’une réponse immunitaire spécifique et adaptative à un antigène. Il nécessite l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires et permet ainsi d’aboutir à un anticorps de qualité dont la spécificité et la sélectivité sont généralement supérieures à un anticorps généré à partir de banques synthétiques. En effet, ce dernier nécessite une étape secondaire in vitro qui ralentit le développement des candidats médicaments de plusieurs mois et donc l’offre thérapeutique aux patients. Bien que ne garantissant pas la développabilité future d’anticorps, la génération d’un anticorps in vivo augmente les probabilités de réussite et permet de générer des candidats dont la séquence ne serait pas présente avec une banque synthétique, par définition plus restreinte. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins ou l’utilisation de protéine purifiée, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux reste, à ce jour, indispensable à la production de nos anticorps.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 5 souris maximum par stratégie d’immunisation seront utilisées. Plusieurs stratégies d’immunisation pourront être menées pour une même cible. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 50 études sera mené sur 5 ans. Le projet n’implique pas d'analyse statistique, et repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux. Une fois l’étape de génération de l’anticorps in vivo chez l’animal effectuée, les organes d’intérêt seront prélevés et la production d'anticorps sera entièrement réalisée dans des systèmes de production cellulaire in vitro.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L‘antigène ou l’ARNm injecté pourront induire une perte de poids de l’animal, plusieurs jours post-injection. Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera mis en place en pré et post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des cellules B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. La disponibilité de lignées de souris génétiquement altérées spécifiques permet, également, la génération d’anticorps humains sans passer par l’étape d’humanisation des anticorps générés. Dans le cas d’utilisation de myélome pour la production d’hybridomes, celui-ci est compatible avec la souche consanguine BALB/c, très largement utilisée pour la production d’anticorps monoclonaux à visée recherche ou thérapeutique. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 12 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.

Les 24 rats de ce projet arrivent déjà opérés, vingt avec un cathéter dans la veine fémorale, quatre avec une double pose dans le canal cholédoque et le duodénum. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, les uns après un prélèvement de sang terminal, les autres parce que le porteur indique qu'une fois opérés ils ne peuvent plus entrer dans un autre projet ni rester longtemps en vie. Les quatre rats doublement cathétérisés restent trois jours seuls en cage à métabolisme, le temps de collecter bile et urine. Il s'agit de mesurer la pharmacocinétique d'un principe actif non nommé, et le porteur précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques du principe actif testé et d'identifier un profil métabolique via l'analyse d'échantillons de bile et d'urine.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les paramètres pharmacocinétiques du principe actif et de pourvoir également identifier des métabolites s'il y en a .

Procédures

Les animaux seront commandés déja opérés. 20 animaux reçus auront un cathéter au niveau de la veine fémorale. Cela est necessaire pour adminsitrer la formulation à tester ( administration intraveineuse perfusion de 1h). Durée de l'administration intraveineuse 1h. Puis les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse ) et un prélèvement de sang terminal sera réalisé à T1h , T2h et T 4h aprés le début de la perfusion. Temps du prélèvement de l'ordre de la minute. Volume : au moins 2 mL. Les animaux seront euthanasiés à la suite du prélèvement sanguin conformément à la réglementation en vigueur. 4 autres animaux reçus auront une double cathétérisation au niveau du canal choledoque et au niveau du duodénum. La formulation a tester sera administrée par voie intraveineuse en bolus lent sous anesthésie gazeuse. Durée de l'administration de l'ordre de la minute. Puis les rats seront placés individuellement en cage à métabolisme pendant trois jours pour recueillir la bile et les urines. Recueil de bile et d'urine aux intervalles suivants: 0-2h, 2-6h, 6-12h, 12-24h, 24-48h et 48-72h. Durée des recueils environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet il est necessaire de commander des animaux opérés. Les animaux auront donc subit une chirurgie en amont. La présence de cathéters et la suite post opératoire des animaux peuvent engendrer une gêne , une douleur pour l'animal. Dans ce projet, les animaux seront hébergés de manière individuelle pour chacune des procédures. Cela peut générer du stress, de l'inconfort , une gêne. ,

Devenir

Les 24 animaux prévus dans ce projet seront euthanasiés. Certains animaux auront un prélèvement de sang terminal. D'autres animaux auront subit une procédure chirurgicale. Ces animaux opérés ne pourront pas être inclus dans un autre projet et pour leur bien être ils ne peuvent pas être gardés en vie trop longtemps aprés cette chirurgie.

Remplacement

Pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques et identifier d'éventuels métabolites du principe actif administré il est indispensable de recourir à l'animal. Les méthodes ex vivo sur organes isolés et cultures cellulaires ne peuvent pas suffire. Seul l'animal dans son ensemble pourra présenter un profl métabolique et pharmacocinétique complet.

Réduction

D'un point de vue pharmacocinétique et pour avoir des résultats fiables et interprétables il est nécéssaire d'avoir un nombre d'animaux minimal de trois. Dans le premier cas: 3 animaux par temps pour chaque sexe sont prévu soit 6 animaux par temps ( 1h (fin de perfusion), 2h et 4h aprés le début de la perfusion). Soit un total de 18 animaux. Deux animaux supplémentaires sont prévus au cas ou d'un dysfonctionnement du dispositif chirurgical ( exemple cathéter bouché ou débranché). Dans le second cas: 3 animaux sont prévus pour déterminer les profils métaboliques. 1 animal de réserve est prévu dans le cas d'un dysfonctionnement du dispositif chiruirgical (cathéter duodénal ou choledoque débranché ou bouché). Soit 4 animaux au total. Dans le projet global, un nombre de 24 animaux est un nombre minimal. L'effectif de 3 animaux par groupe pour le premier cas ou 3 au total pour le second cas est le nombre minimal pour pouvoir avoir des resultats représentatifs qui prennent en compte les varaibilités intra et inter individuelles. 1 animal supplémentaire par type de chirurgie et le nombre minimal pour pallier aux problèmes post opératoires. Pas d'approche statistique réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions individuelles dans des cages à métabolismes le temps de la perfusion pour une durée d'une heure dans le premier cas. Le reste du temps pendant les 3 jours d'acclimatation et jusqu'a 4 heure après le début de l'infusion les animaux seront placés dans des cages makrolons classique conformes à la réglementattion. Pour les animaux du second cas, ils seront hébergés de manière individuelle également mais resteront en cage à métabolisme 3 jours consécutifs pour la récolte de la bile et de l'urine. Pour la réalisation de l'administration intraveineuse en bolus lent, les animaux seront sous anesthesie gazeuse, le temps de l'injection. Pour le bien être des animaux, et maintenir une digestion normale, des sels biliaires seront administrés via le cathéter allant au duodénum. Débit en sels biliaires 1.2 mL/h, concentration 0.025% dans du NaCl. dans le premier cas, les points limites sont - Comportement de l'animal durant la perfusion (convulsion, tremblement, prostration) dans ce cas l'animal sera exclu de l'étude est euthanasié - Problème au niveau du dispositif (cathéter bouché ou débranché au niveau interne de l'animal). Dans ce cas l'animal sera exclu de l'étude est euthanasié. Problème d'infection post chirurgicale, écoulement au niveau des cathéters. Dans le second cas , les points limites sont: - Un problème du dispositif: Cathéter débranché au niveau interne de l'animal, cathéter bouché. Si le cathétéer est bouché un petit volume de NaCl sera administré pour débouché le cathéter ( environ 0.1 mL) - Problème d'infection post chirurgicale: écoulement au niveau des cathéters, douluers abdominale, abdoment gonflé, vocalise de l'animal à la palpation.

Choix des espèces

Le rat est une espèce majoritairement utilisée pour ce type d'étude. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques Jeune adulte . il est necessaire d'avoir un système métabolique stable et mature

Une injection dans le cerveau sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, un jeûne de vingt-quatre heures, un isolement de quarante-huit heures : 360 souris porteuses de la mutation responsable de la maladie de Huntington vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection intraveineuse du composé testé et deux injections quotidiennes de traceur cellulaire pendant trois jours, avant des tests comportementaux. Le porteur qualifie ces nuisances de "mineures" et n'attend ni point limite ni mort prématurée. Il écrit que les résultats obtenus sur cellules "nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients", pour une maladie qui touche cinq personnes sur 100 000 et reste sans traitement curatif.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (5 cas pour 100 000 individus) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de troubles moteurs et intellectuels conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès). La maladie de Huntington est dûe à une mutation sur le gène de la protéine nommée huntingtine, lui conférant une structure anormale. Cela entraîne un gain de fonctions toxiques mais aussi une perte des fonctions physiologiques de la huntingtine. La protéine ainsi mutée ne peut plus assurer son rôle dans le transport de molécules essentielles à la survie neuronale provoquant la mort des neurones. La mutation induit également le déclin des capacités des précurseurs neuronaux et donc la production de nouveaux neurones. En reproduisant des réseaux neuronaux en laboratoire, nous avons pu démontrer que l’expression d’une molécule thérapeutique couplée à l’utilisation d’un composé chimique destiné à réduire les niveaux de protéine mutée était capable de restaurer certaines fonctions de la huntingtine dans un modèle de la maladie de Huntington. Ce projet a donc pour but de tester cette approche thérapeutique, validée sur cellules, afin de restaurer les capacités des précurseurs neuronaux pour rétablir la production de neurones ainsi que les défauts dans les neurones qui conduisent à leur dégénérescence en présence de la mutation. L’objectif final est donc de soutenir la génération de neurones et de limiter la dégénérescence neuronale pour limiter voire abolir les symptômes de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’existe à ce jour pour soigner les patients atteints de la maladie de Huntington. Nous proposons donc d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les résultats prometteurs obtenus sur cellules nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients.

Procédures

4 actes expérimentaux impliqueront d’éventuelles nuisances mineures à l’animal: 1/ Lors de l’injection dans le système sanguin de la molécule d’intérêt (anesthésie de 5 minutes) 2/ Lors de l’injection dans le cerveau de la molécule thérapeutique complémentaire (anesthésie de 30-45 minutes) 3/ Lors de l’injection dans le système sanguin de molécules permettant de marquer les cellules (2 fois par jour pendant 3 jours). 4/ Lors des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

1) Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus à la mutation car chez la souris, la pathologie ne se développe pas de manière aussi sévère que chez l'Homme. En effet, chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales bien précises. 2) Un léger stress peut être induit lors des tests de comportements impliquant une mise à jeun de 24h ou un isolement de 48h. 3) Une légère douleur peut survenir lors des injections dans le système sanguin et dans le cerveau. 4) Un stress modéré peut également survenir lors de la contention des souris pour la réalisation des injections du traceur cellulaire.

Devenir

L’approche thérapeutique proposée consiste en l’injection dans le système sanguin d’un premier composé suivi d’une injection d’une molécule complémentaire dans le cerveau dans le but d’empêcher les effets toxiques de la protéine mutée dans la maladie de Huntington. Pour attester de l’efficacité de ce protocole , ces souris seront ensuite soumises à des tests comportementaux dont les résultats seront confirmés à l’issue de leur euthanasie, nécessaire pour prélever le cerveau à étudier et réaliser divers marquages.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet thérapeutique de notre protocole pour traiter les symptômes de la maladie de Huntington et d’évaluer son mécanisme d’action dans le cerveau. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de mimer les modèles comportementaux et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et de matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie de son cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris transgéniques (knock-in). Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptomes de la maladie de Huntington apparaissant à l'âge adulte, nous souhaitons tester notre approche thérapeutique à un stade pré-symptomatique et à un stade symptomatique. Les souris modèles de la maladie de Huntington développent des troubles moteurs et cognifits observables en étude de comportement à 6 mois. Ainsi, en étudiant des souris âgées de 1 et 6 mois, nous pourrons voir l'efficacité du protocole thérapeutique sur l'apparition des symptomes. Le but de ce projet est donc de voir le ralentissement de la progression de la maladie voire d'empêcher l'apparition des symptomes.

Pesées deux fois par semaine pendant huit semaines, dont la moitié sous régime hypercalorique jusqu'à peser près de 50 grammes et devenir prédiabétiques, 144 souris reçoivent ensuite un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Quarante-huit autres passent seize heures à jeun avant deux prélèvements, et vingt-quatre subissent une contention de trente minutes, un stress que le porteur présente comme "nécessaire" à l'activation de l'axe nerveux étudié. Au total 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, pour analyser leur métabolisme du glucose et leur régulation du stress.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de l’équilibre de la glycémie (concentration de sucre (ou glucose) dans le sang), notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Dans cet optique, le récepteur de glucose SGLT3 (pour sodium-glucose transporter 3) est une cible de choix. En effet, l’expression ce récepteur, présent dans les neurones de l'intestin grêle et dans les régions du cerveau qui contrôle la faim– est diminuée chez des souris obèses et varie également après une chirurgie gastrique, un traitement très efficace de l'obésité sévère, en particulier chez les patients diabétiques. Néanmoins, ces différentes études anatomiques et fonctionnelles restent aujourd’hui incomplètes pour définir le rôle de SGLT3 dans la détection du glucose et l’équilibre de la glycémie. Ce projet vise à déterminer si la détection du glucose par le récepteur SGLT3 est important dans le contrôle de la glycémie et du poids et, à plus long terme, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre de l’obésité et du diabète. Pour cela, nous étudierons une lignée de souris transgéniques qui n’expriment pas le récepteur de glucose SGLT3.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter les travaux sur les mécanismes de détection du sucre-glucose et de transmission des informations de l’alimentation envoyées par l’intestin. En effet, plusieurs études ont suggéré que SGLT3 est impliqué dans le métabolisme du sucre, notamment dans des situations pathologiques telles que l’obésité. Néanmoins ces travaux n’ont pas encore permis de montrer précisément le rôle de SGLT3. Ce projet nous permettra peut-être d’identifier une nouvelle cible de choix dans la lutte contre l’obésité et ses complications.

Procédures

-144 souris (72 nourries avec un régime standard et 72 nourries avec un régime hypercalorique) seront pesées et leur prise alimentaire sera mesurée deux fois par semaine pendant 8 semaines. Ces souris recevront ensuite soit un unique gavage avec une solution de glucose, soit une unique injection d’insuline (d’une durée d’environ 45 secondes par souris pour chaque geste). Des mesures de glycémie par prélèvement d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue seront réalisées 0,15,30,60,90 et 120 minutes après le gavage ou l’injection. - 48 souris seront mises à jeun pendant 16h et subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue. - 24 souris subiront un test de contention d’une durée de 30 minutes ainsi que 3 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue.

Impact sur les animaux

- Des hypoglycémies peuvent survenir lors du test de tolérance à l’insuline. Le contrôle régulier de la glycémie permettra d’anticiper une baisse de la glycémie trop importante. - Le jeûne de 16h ainsi que le test de contention vont entrainer un stress de l’animal, nécessaire à l’activation de l’axe nerveux que nous étudions ici. - Le régime hypercalorique favorise la prise de poids et l’induction du diabète. Après 8 semaines de régime, les souris WT sont prédiabétiques et en surpoids (environ 50g) mais sans impact sur leur mobilité. - Les souris recevant un gavage de glucose oral pourront présenter une légère irritation de l’œsophage.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort afin d’étudier différents paramètres de leur métabolisme glucidique ainsi que de leur régulation du stress.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose a des impacts sur l’ensemble du corps et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit 6, 9 ou 18 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus. La mesure de prise alimentaire se fait par la pesée des croquettes dans la mangeoire. Toutes les souris étant hébergées 3 par cage, il est nécessaire de se baser sur le nombre de cage et non sur le nombre d’animaux, pour calculer la taille nécessaire d’échantillon. Ainsi, avec 18 souris par groupe, nous fixons une taille d’échantillon de 6 par groupe. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Enfin, la réalisation de la procédure 3 est conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2. Si nous n’observons pas de différences dans la contre-régulation induite par le jeûne de 16h, nous ne réaliserons pas cette dernière procédure. Au total, ce projet nécessitera au maximum 216 souris.

Raffinement

Les souris contrôles seront commandées à l’âge de 4 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des tests à l’âge de 14 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, les animaux seront observés et pesés régulièrement. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Pour les différentes procédures, les animaux seront en groupe et manipulés dans le calme pour éviter tout stress superflu. Pour prévenir la douleur due à l’incision de la queue, de la crème anesthésiante à base de lidocaïne (anesderm) est appliquée localement sur la queue des souris, 30min avant l’incision. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Pour minimiser le stress lié à l'éclairage, nous utiliserons un éclairage diffus et faible (

Choix des espèces

Le rôle du récepteur SGLT3 dans le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Les animaux provenant d’un éleveur agréé seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (à partir de 14 semaines). Les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.

Les souris utilisées développent spontanément un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'à la mort en trois semaines environ. 802 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections dans la peau du dos sous anesthésie en trois semaines, jusqu'à six administrations intranasales d'insuline modifiée, une injection rétro-orbitaire et un prélèvement de sang, pour mettre au point une allergie cutanée à l'insuline que le porteur décrit comme jamais décrite dans la littérature. L'apparition du diabète, d'érythèmes sévères ou d'un état général affaibli déclenche la mise à mort anticipée.

Objectifs

L'allergie à l'insuline est une complication rare mais qui pose de sérieux problèmes pour la prise en charge des patients diabétiques. Les manifestations allergiques incluent urticaire, éruption cutanée, hypotension, essouflement. Dans des cas extrêmes, ces réactions intenses et rapides sont susceptibles de provoquer la mort. Elles sont induites par des anticorps IgE dirigés contre l'insuline injectée. Les traitements actuels consistent en l’utilisation d’agents anti-histaminiques, de corticoïdes, mais également la sélection de préparations d’insuline moins allergènes et des pompes à insuline intrapéritonéale plus invasives. Cependant, aucun traitement de référence n’existe ciblant les causes immunologiques de cette maladie. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle stratégie visant à diminuer les réponses allergiques, et induire ainsi une désensibilisation vis-à-vis de l’insuline. Nous utiliserons de l’insuline modifiée qui sera administrée par voie intranasale, ayant comme objectif d’être le moins invasif possible pour à terme facifiter le transfert à la clinique de cette stratégie. Ce choix a été motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses. Dans ce projet, nous travaillerons dans un modèle de souris qui développe un diabète. Tout d'abord, nous mettrons au point un modèle de réaction allergique cutanée induite par sensibilisation d'insuline (mimant ainsi ce qui se passe chez les patients diabétiques), modèle qui n'a jamais été décrit dans la littérature. Nous testerons ensuite notre approche thérapeutique avec l'insuline modifiée administrée par voie intranasale et nous analyserons les mécanismes immuntaires induits.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de notre insuline administrée par voie intranasale dans le contexte de l’allergie à l’insuline. Ainsi, en cas de succès, ces recherches pourraient aboutir rapidement à des essais cliniques chez les patients diabétiques présentant une allergie à l’insuline, pour laquelle il n’existe aucun traitement de référence à l’heure actuelle. Des résultats positifs sur les manifestations allergiques pourraient à plus long terme permettre d’envisager une application de la thérapie intranasale par insuline dans d’autres indications, en particulier le diabète de type 1 qui touche principalement les enfants et adolescents. En effet, des efforts sont développés pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir cette maladie. Les thérapies envisagées doivent montrer une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour être attractives pour une application clinique. Notre insuline intranasale remplit ces exigences.

Procédures

Injection intradermiques (au niveau de la peau du dos) sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois, 2 fois par semaines pendant 3 semaines. Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). Injection intraveineuse (rétro-orbitaire) sous anesthésie généralependant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois.

Impact sur les animaux

Les souris femelles que nous utilisons développent un diabète (hyperglycémie). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. L'allergie cutanée à l'insuline, développée par le protocole mis en place, peut se manifester par des démangeaisons locales modérées et de courte durée (quelques minutes) ou des irritations légères de la peau. Enfin, les souris peuvent subir un léger stress lié aux injections intradermiques ou à l’anesthésie.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des tests in vitro appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour le traitement de l’allergie à l’insuline et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé. Les espérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les différents stades de la réponse allergique.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris allergique, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions, et peau pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé nous ferons un premier élevage très restreint des souris afin de définir quelle est la lignée la plus adaptée pour l'induction de l'allergie à l'insuline avant de lancer un plus grand élevage pour les expériences d'immunothérapie avec l'insuline intranasale.

Raffinement

La réponse allergique cutanée sera induite par injections intradermiques d’insuline sur la peau rasée des souris. Afin de réduire au minimum la douleur et le stress des animaux, cet acte se fera sous anesthésie générale. Les souris sont sujettes à une surveillance accrue pendant les 20 minutes suivant l’anesthésie avec un réveil complet et une récupération de la mobilité. Aussi l’endroit de l’injection sera surveillé plusieurs fois par semaine afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’irritation majeure de la peau suite à l’injection. De plus, travaillant sur un modèle de souris susceptible au diabète, des tests de glucosurie (concentration du glucose dans les urines) seront réalisés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de la maladie. Enfin, de manière générale, la consommation d’eau, de nourriture, la motricité et le comportement de l’animal seront surveillés de manière hebdomadaire par les soigneurs et les expérimentateurs. La survenue du diabète (hyperglycémie), d’érythèmes sévères ou l’observation d’un état général affaibli entraineront la mise à mort anticipée de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les études de l’allergie cutanée étant donné la bibliographie existente sur le sujet et la caractérisation des réponses allergiques chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Nos expériences seront réalisées chez des souris adultes (entre 8 et 15 semaines d’âge) avec un système immunitaire mature..

Environ trente anesthésies et trente prélèvements sanguins par animal, quatre ponctions de moelle osseuse, quinze prélèvements urinaires dont trois par sonde vésicale : 168 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est infectée par le virus Zika ou par le chikungunya après immunisation avec des candidats vaccins, puis hébergée seule pendant quatre à huit semaines pour éviter les contaminations croisées. Aucun n'est tué à l'issue selon le champ de devenir, le porteur indiquant qu'ils seront gardés en vie sur avis vétérinaire et inclus dans d'autres projets, ce qui réduit le nombre d'animaux comptés dans chacun. Le macaque est présenté comme le "seul modèle" possible avant les essais chez l'humain, pour sa proximité phylogénétique et sa réponse vaccinale semblable.

Objectifs

Les agents du Zika et du chikungunya appartiennent à la famille des arbovirus, large famille de virus véhiculés par des insectes qui se nourrissent du sang d’animaux. Ils sont essentiellement transmis par les moustiques du genre Aedes (hémisphère Sud) et Culex (hémisphère Nord). . Restreint il y a encore quelques années à des zones tropicales, le moustique tigre se répand de plus en plus en Europe, étant maintenant implanté dans les pays du nord de la méditerranée (France, Italie, Croatie, Albanie, Grèce). Il pourrait être le point de départ de nouvelles épidémies. Actuellement, la surveillance sur le chikungunya et zika a été renforcée en France métropolitaine. Si la plupart des infections qu’ils provoquent sont sans gravité, ces virus peuvent parfois conduire à des complications sévères voire mortelles : - une microcéphalie chez des bébés nés de mères infectées par le virus Zika et dans de très rare cas des atteintes neurologiques (syndrome de Guillain Barré). - des douleurs articulaires persistantes et sévères en cas d’infection par le chikungunya. Le virus Zika est déjà à l’origine de plusieurs épidémies en Océanie (2006, 2013) et plus récemment sur le continent Sud-Américain en 2015. Le 1er février 2016, l’OMS a déclaré que le virus Zika constitue une urgence de santé publique. Le virus Chikungunya est endémique en Asie du Sud et en Afrique mais s’est étendu en 2005 dans l’océan indien, notamment à l’île de la Réunion suite à une forte épidémie. En 2007, la maladie est arrivée en Europe, avec des cas autochtones dans le sud de la France en 2010. Les facteurs tels que le réchauffement climatique, l’élargissement du biotype des vecteurs, l’émergence de cas autochtone de certains arbovirus en Europe, conduisent dernièrement à une menace accrue d’épidémie qui nécessite de chercher et tester des candidats vaccins, idéalement pouvant protéger contre plusieurs type d’arbovirus.L’objectif du projet est d’évaluer sur des modèles précliniques l’immunogénicité (le type de réponse immunitaire déclenchée) et l’efficacité de candidats vaccins lors d’infection par les virus Zika et Chikungunya.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier le passage à des essais cliniques du candidat vaccin sélectionné. A long terme, la preuve de concept d’un vaccin ciblant plusieurs arbovirus permettrait d’envisager des constructions plus complexes, protégeant les populations selon les circulations endémiques des virus en une seule injection. Que ce soit pour les nourrissons et jeunes enfants, pour les populations ayant un accès limité aux soins ou même pour les touristes se vaccinant avant leur voyage, la simplification du régime vaccinal devrait être très bien accepté. De plus, économiquement, les coûts de développement et le prix final d'un vaccin unique seraient fortement réduit.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - immunisation avec des candidats vaccins (pouvant aller jusqu’à 3 fois selon les résultats de l’étude pilote d’immunogénicité, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus Chikungunya (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Infection par le virus Zika (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les groupes) - Prélèvements sanguins (30 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Prélèvements de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les groupes) - Prélèvements salivaires (15 fois, 2 minutes, tous les groupes) - Prélèvements urinaires (15 fois, 15 minutes, tous les groupes) - Implant puce de température (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Sonde vésicale (3 fois, entre 2 à 30minutes, groupes exposés) - hebergement individuel (1 fois, 4 semaines pour les infections avec Zika et 8 semaines pour les infections avec Chikunguya, groupes exposés)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’immunisation (peu attendu) : Réaction locale, écoulement de pus, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite à l’infection (attendu pour les animaux non vaccinés, peu attendu pour les vaccinés) : Chikungunya : L’infection du macaque se caractérise, comme chez l’homme, par une infection par le virus transitoire détectable entre les jours 1 et 5, accompagnée d’un épisode fébrile (1 ou 2 jours d’après les précédentes études), d’un gonflement transitoire des articulations, principalement les chevilles et les poignets, 4 ou 5 jours entre les jours 6 à 10, d’une éruption cutanée transitoire diffuse et d’intensité variable pendant les 3 premiers jours ainsi que d’infiltrations persistantes de monocytes/macrophages (cellules immunitaires) infectés dans les tissus lymphoïdes et à un moindre niveau dans les muscles et les articulations. Ces nuisances ne sont pas accompagnées d’une modification de comportement et se résolvent en quelques jours. Zika : Nausées, vomissements, fièvre, déshydratation (évaluation du pli cutané lors des prélèvements). Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse, urine et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Pour le prélèvement urinaire par sonde, les nuisances possibles sont un risque d’abrasion des muqueuses et de contamination avec la sonde. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Nuisances possibles chez les animaux après la pose de puce de température: Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie sur avis vétérinaire et pourront être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre les maladies virales Zika et Chikungunya nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions systémiques à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettant pas de construire des modèles pertinents des interactions hôte-pathogène, de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire à une infection ou une vaccination. L’espèce macaque cynomolgus a été choisie pour sa proximité phylogénétique et physiologique de l’homme permettant ainsi une transposition des résultats. Les modèles d’infection par le virus Zika et par le virus Chikungunya ayant déjà été développés chez cette espèce, il est plus opportun de poursuivre chez celle-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Des études préliminaires sont prévues avec des groupes réduits au minimum à 2 individus pour permettre de sélectionner les meilleures conditions pour les études d’efficacités. Pour ces dernières, le nombre d’animaux a été réduit à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique adaptés aux petits échantillons.Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriquesstatistiques adaptés aux petits échantillons, comprenant 6 animaux par groupes expérimentaux.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si trouble alimentaire/anorexie suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Puce de température: Une réaction locale au site d’incision peut être observée comme un gonflement, suintement de la plaie (rare). Les réactions sont signalées au vétérinaire (traitement symptomatique). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation Si réaction locale à l’injection du vaccin (écoulement de pus (suppuration), démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection) => signalement au vétérinaire, un traitement symptomatique local pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale si la douleur est marquée). Si la réaction locale est exacerbée (suppuration intense avec nécrose, absence de récupération après mise en œuvre des traitements), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. Hébergement individuel: Les animaux seront hébergés individuellement pendant la phase d’exposition virale pour éviter une contamination croisée et/ou une surinfection. Un enrichissement complémentaire sera apporté lors de cet hébergement individuel. Infection: Suite à une infection avec le virus Zika, les animaux peuvent avoir des nausées, vomissements, fièvre et déshydratation. Un signalement au vétérinaire sera fait en cas d’apparition de ces symptômes. Si les symptômes sont plus sévères (type paralysie) la sortie d’étude de l’animal sera envisagée. Les données issues d’un projet précédent n’ont pas montré de dégradation de l’état de santé de l’animal ni de mortalité. Suite à une infection par le virus chikungunya, une surveillance accrue sera mise en place sur les 10 premiers jours avec suivi de la température des animaux, mesure des articulations proches des sites d’injection et d’éventuelles rougeurs cutanées. Ces nuisances n’entrainent pas de changement de comportement et disparaissent au bout de quelques jours d’après les données d’un projet précédent.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est le modèle animal retenu pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de candidats vaccins avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme, la réponse immunitaire et vaccinale étant similaire à celle de l’homme. De plus, il a déjà été utilisé dans des modèles specifiques de ces infections dans la littérature et au laboratoire pour étudier l’efficacité de vaccin avec des phases cliniques. Enfin, notre laboratoire maîtrise les techniques d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale chez le macaque ce qui permet une exploration complète de ces réponses. Le suivi immunologique et la réponse à l’infection sont des paramètres majeurs dans ce projet, nous avons donc besoin d’animaux adultes avec un système immunitaire pleinement mature, au minimum 3 ans.

Les souris et les rats sont tués en fin d'étude parce qu'ils s'habitueraient à l'expérience, leur niveau de stress baissant avec le temps et faussant les mesures. 552 souris et 552 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie d'environ deux heures pour implanter des électrodes cérébrales, puis jusqu'à quatre privations de sommeil de douze heures sur un tapis roulant ou sur une plateforme entourée d'eau, certains étant hébergés seuls pendant tout ou partie de l'étude. Le porteur prévoit d'évaluer s'il peut utiliser les mêmes animaux sur trois à quatre semaines, ce qui réduirait les effectifs des études suivantes.

Objectifs

L'objectif du projet consiste à évaluer l'efficacité de nouvelles substances anxiolytiques sur les troubles du sommeil et de manière plus générale sur le cycle circadien. Des personnes souffrant d'anxiété peuvent développer des troubles physiques associés à leur pathologie tels que des troubles digestifs, des douleurs et tensions musculaires ou encore des insomnies, qui sont la cause de somnolence dans la journée ou d'un état de fatigue global. Un état d'anxiété et/ou des crises d'angoisses retardent l'endormissement d'un sujet mais aussi modifie l'architecture globale du sommeil. Les phases de sommeil lent et de sommeil paradoxal peuvent être allongées pendant les périodes de récupération d'un sujet alors qu'elles sont inexistantes lors d'insomnies. La mesure de l'activité cérébrale et motrice permet de déterminer l'état de vigilance de l'animal et d'évaluer l'effet pharmacologique de substances.

Bénéfices attendus

Il existe différents traitements pour lutter contre les troubles de l'anxiété en plus de la prise en charge des patients par psychothérapie. Néanmoins, pour certains patients, les troubles de l'anxiété ne diminuent que faiblement avec les traitements médicamenteux ou réapparaissent dans le temps. La recherche de nouveaux traitements reste donc indispensable pour améliorer les conditions de vie des patients, en limitant l'apparition de symptômes secondaires indésirables. La mise en place de modèles précliniques translationnels reste également une priorité dans ce domaine pour pouvoir tester de nouvelles thérapeutiques. Les tests décrits dans ce projet sont utilisés dans la littérature pour modifier l'architecture du sommeil et évaluer de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

Les animaux seront opérés sur une durée d'environ 2 heures pour implanter des électrodes cérébrales (chez la souris et le rat). Le cas échéant, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Après une période de récupération, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées par télémétrie sur plusieurs heures (12 à 24 heures) et sur plusieurs jours consécutifs (minimum de 3 jours). Les animaux seront placés sur un tapis roulant à faible vitesse ou sur une petite plate-forme entourée d'eau (entre 2 et 5 cm d'eau en fonction de la taille du rongeur) pendant 12 heures. Les mesures électroencéphalographiques et la privation de sommeil seront répétées un maximum de 4 fois par animal. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés (maximum de 3 fois sur une durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. A la suite des chirurgies, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte. Les animaux sont parfois hébergés seuls pendant toute ou partie de l'étude ce qui peut causer un stress bien qu'ils conservent un contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères. La privation transitoire de sommeil peut conduire à un stress modéré, en raison de l'environnement dans lequel est placé l'animal. Un état de fatigue peut également être observé lorsque les animaux sont obligés de bouger sur le tapis roulant.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin des expériences car ils auront subi 2 à 3 procédures de privation de sommeil, considérées comme des conditions stressantes. Il ne sera pas possible de les utiliser à nouveau car ils seront déjà familiarisés avec cet environnement et leur niveau de stress va diminuer dans le temps, impactant les données.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro à notre connaissance. Néanmoins, les molécules testées sont préalablement sélectionnées dans des modèles in vitro permettant de déterminer leurs potentiels effets sur une cible.

Réduction

Le nombre d'animaux a été ajusté en fonction des données de la littérature et a été déterminé selon une approche statistique. Il sera également évalué, lors de la première procédure, l'impact de la réutilisation des animaux sur les résultats électroencéphalographiques afin de déterminer si les animaux peuvent être réutilisés sur 3 à 4 semaines et ainsi diminuer le nombre d'animaux par étude.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour les phases chirurgicales, une anesthésie et une analgésie seront réalisées. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire et une couverture chauffante est placée sous l'animal anesthésié pour maintenir sa température corporelle pendant la chirurgie.Les animaux isolés (minimum de 7 jours pour la période de récupération post-chirurgie) sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger et en présence de coton ou de frisure. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. A la fin de la période de récupération, les souris sont regroupées par deux. Des points limites stricts ont été définis. Pendant les périodes de privation de sommeil (animaux placés sur un tapis roulant ou sur une plate-forme, placée dans de l'eau), les animaux sont surveillés par un technicien, permettant l'intervention de ce dernier immédiatement si un animal montre des signes de fatigue en se retrouvant dans une position inconfortable. Les rongeurs seront également séchés avant d'être remis sur la plate-forme pour éviter tout risque d'hypothermie.

Choix des espèces

Les études sur le cycle circadien sont effectuées chez le rongeur (rat et souris) car ces modèles, basés sur la mesure de l'activité cérébrale, sont translationnels. Les substances mises sur le marché pour traiter les troubles psychiatriques ou du sommeil ont été découverts en utilisant des modèles chez le rongeur. Dans ce projet, le rat sera utilisé de préférence car le laboratoire a plus d'expérience avec cette espèce pour évaluer le rythme circadien mais la souris pourra être utilisé au besoin. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 4 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique