Procédures modérées

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

2 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer de huit à vingt-quatre semaines sous régime gras pour développer obésité et diabète, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, d'autres placées seules en cage sept jours, immobilisées deux à cinq minutes dans un tube pour mesurer leur graisse corporelle, ou laissées une nuit sur une grille pour récupérer leurs fèces. Le porteur reconnaît que les injections intrapéritonéales répétées pourraient provoquer une péritonite et que les gavages peuvent causer des microlésions. Le projet ne teste aucun traitement et vise à comprendre le rôle des macrophages du foie, quand l'atteinte des souris, elle, est acquise dès la mise au régime.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présents dans tous les tissus. Ils participent au maintien de l’organisme en éliminant notamment les cellules mortes ou bien des pathogènes (bactéries, virus). Ces cellules ont toutefois été aussi fortement impliquées dans un grand nombre de maladies dites chroniques, où on leur prête bien souvent un rôle délétère, et notamment dans la maladie du foie gras (NAFLD), l’athérosclérose (maladie des artères à l’origine des infarctus du myocarde) ou bien dans le tissu adipeux chez les individus avec surcharge pondérale (obésité) et diabète. Les macrophages sont des cellules très diverses qui sont fortement influencées par le tissu où elles résident et leur environnement, notamment en conditions pathologiques. Notre projet vise à mieux définir le rôle des macrophages du foie dans le développement des pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras (NAFLD), obésité). Pour reproduire les différents contextes pathologiques, des modèles animaux seront nourris avec différents types de régimes alimentaires qui favoriseront la survenue d'obésité, de la NAFLD ou bien encore de l'hypercholestérolémie (facteur de risque majeur de l’athérosclérose). Certains traitements pourront aussi être conduits sur les animaux pour modéliser un aspect bien précis de l’évolution pathologique de la NAFLD, à savoir la fibrose du foie. En modifiant, la fonction de ces macrophages, leur capacité à survivre ou bien même en éliminant ces cellules du foie de manière momentanée ou durablement, nous essaierons de comprendre leurs rôles et l’importance de leur diversité (origine, activation) dans le contexte de la pathologie et comment ces cellules peuvent influencer le développement des maladies cardio-métaboliques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies métaboliques, comme l’obésité, a augmenté à un rythme exponentiel au cours des dernières décennies. Il est important de noter qu'en plus d'avoir ses propres comorbidités, l'obésité a un impact considérable sur la santé d'un patient et augmente sa susceptibilité à d'autres conditions, comme le cancer. Les comorbidités reconnues depuis longtemps de l’obésité comprennent la résistance à l’insuline et le diabète de type 2, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique. Il est à noter que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) soit également un facteur de risque indépendant majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires, notamment l’athérosclérose. Il existe de plus en plus de preuves d’une association étroite entre l’obésité et la NAFLD, et une attention considérable de la recherche est désormais portée sur cette association en raison de la prévalence croissante de la NAFLD et de sa capacité à évoluer vers un dysfonctionnement et une insuffisance hépatique. Le fardeau de la NAFLD devrait augmenter et les projections actuelles estiment que, d’ici 2030, plus de 300 millions de personnes développeront la NAFLD en Chine, plus de 100 millions aux États-Unis et 15 à 20 millions dans les principaux pays européens. Les coûts économiques actuels associés à la NAFLD et à ses comorbidités sont extrêmement élevés. Ainsi, de gros efforts sont en cours pour développer des traitements innovants pour lutter contre cette maladie, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement approuvé. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation) dans le développement de ces pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras ou NAFLD, obésité).

Procédures

Les animaux seront nourris avec différents types de régimes riches en graisses de 8 à 24 semaines pour les faire grossir et développer un diabète. Ils pourront également être nourris en alternance avec un régime riche en graisses ou avec un régime normal. Ils pourront être mis à jeun pendant quelques heures, recevoir un gavage ou une injection et subir 1 ou 2 tests de 2 heures avec quelques petites prises de sang sur animal vigile pour évaluer leur diabète. Les animaux pourront être anesthésiés et recevoir une injection en intra-veineux (durée de quelques minutes) une seule fois. Certains animaux pourront avoir deux prises de sang (vigile, une minute de contention) à quelques jours ou quelques semaines d’écart. Certains animaux pourront être placés dans un tube ou dans un compartiment d’une boite avec restriction de mouvements pendant 2 à 5 mins pour mesurer leur graisse corporelle. Certains animaux pourront être placés seuls dans une cage de dimension normale pendant 7 jours (isolement des animaux avec contact visuel et olfactif avec ses congénères) pour évaluer leur état général et leur niveau d’activité. Certains animaux recevront des traitements par injection de molécules (une seule fois ou deux fois par semaine pendant 6 semaines) ou par addition de molécules dans la nourriture pour induire des perturbations hépatiques. Certains animaux pourront être irradiés quelques minutes et subir une greffe de moelle osseuse immédiatement après par injection sous anesthésie (durée quelques minutes) pour étudier les cellules de leur moelle osseuse. Certains animaux pourront être placés sur une grille déposée sur le sol de leur cage pendant une nuit pour récupérer leur fèces. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour génotypage pourront induire une douleur légère et de courte durée. Les animaux nourris avec les régimes riches en graisses présenteront une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité avec diminution de leur activité quotidienne. La composition de ces régimes riches en graisses les rend plus mous et pourrait favoriser une pousse des dents plus importantes. Les contentions de courtes durées, les administrations par gavage, les injections et les prélèvements sanguins sur animal vigile nécessaires aux différents tests pourront être sources de stress et d’inconfort pour l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées pourraient induire un risque de péritonite. De façon rare, les gavages pourront induire des microlésions ou des irritations. Certains tests pourront également induire un stress pour les animaux en raison d’une courte période de mise à jeun. Les mesures de composition corporelle (mouvements limités dans un tube pendant 2 mins) pourront être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Les courtes anesthésies gazeuses pour les injections intra-veineuses pourront engendrer un stress thermique et les injections une douleur temporaire au réveil. Certaines injections ou administration de molécules pourront induire une inflammation temporaire, être source d’inconfort pendant 1 à 2 jours, et s'accompagner parfois d'une perte de poids. L’isolement (une nuit) sur grille pour la récupération des fèces pourront induire un stress. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par restriction de leur mouvement (durée 5 mins) dans une petite boîte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser l'analyse de leurs tissus post-mortem.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs cellulaires pouvant orienter le développement des pathologies cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras, obésité). Nous avons besoin d’étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de certains gènes dans nos cellules d’intérêt, et d'étudier les conséquences dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement du tissu.

Réduction

Un total de 2816 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour certaines expériences mâles et femelles seront étudiés séparément car les réponses tissulaires peuvent différer selon le sexe de l’animal. Toutefois, pour certaines études les mâles seront préférentiellement utilisés. Les femelles générées seront alors utilisées pour d'autres expériences, permettant de réduire le nombre d’animaux. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions standard d'animaleries EOPS (exempte d'organismes pathogènes spécifiques) avec hébergement en portoirs ventilés, avec respect des cycles jour et nuit de 12h, un contrôle de l’hygrométrie et de la température comprise entre 20 et 24 degrés. Les changes litière et de nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de papier kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des males se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur. Une solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux sera recherchée (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Après transfert des animaux des zones d’élevages, les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 1 à 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Pour les procédures où une douleur est attendue, les animaux seront suivis quotidiennement. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et,ou le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant. Si des points limites définis en amont sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. L’expression des maladies cardio-métaboliques est par ailleurs assez bien reproduite dans le modèle murin avec un recul expérimental de plusieurs décennies à travers le monde. Les animaux utilisés devront avoir atteint la maturité sexuelle et être de jeunes adultes au début des expérimentation. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.

Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.

Objectifs

La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.

Cette étude pilote sert à tester des sondes implantées avant leur commercialisation éventuelle. 30 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin de l'expérience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie générale une capsule de verre de 2 à 5 millimètres sous la peau, avec des douleurs possibles au réveil et pendant la récupération, puis retourne dans sa cage d'élevage où des capteurs enregistrent ses paramètres en continu. Le porteur présente le dispositif comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, puisqu'il éviterait les tests comportementaux et les prélèvements de sang répétés, tout en le validant sur des souris qu'il tuera à l'issue.

Objectifs

Le but de ce projet est de phénotyper des souris dans leur cage d'élevage standard. Pour cela nous utilisons de nouvelles sondes communicantes implantées dans la souris. Ces implants peuvent enregistrer des paramètres physiques, chimiques et biologiques de la souris en continu, pendant le jour et la nuit et tous les jours de la semaine. Ces enregistrements ne nécessitent aucune intervention de l'expérimentateur. Les souris sont hébergées en condition optimale dans une cage, groupe de males ou femelles, couple. Les données sont collectées par un réseau de capteurs communicants localisés à l'extérieur de la cage. Le fonctionnement des lecteurs RFID n'interfère pas avec les souris. Dans cette phase du projet, nous testerons cette nouvelle technologie avant leur éventuelle commercialisation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à reduire le nombre d'animaux et de cages que nous utilisions pour la caractérisation des mutants ou les analyses des conséquences de traitements pharmacologiques par exemple. Le premier bénéfice de ces technologies est le suivi longitudinal et individualisé de parametres physiologiques (physiques, chimiques, biochimiques). Les données sont collectées 24/24 7/7 et non plus au cours d'examen clinique. Ces sondes sont autonomes tout au long de la vie de la souris (pas de remplacement nécessaire). Le second bénéfice de ces technologie est que ces données sont collectées sans interaction avec un opérateur. En outre, le système est modulaire, il est possible d'adapter les sondes et les capteurs au besoin de l'expérience.

Procédures

Chaque souris subira l'implantation unique sous cutanée de sonde RFID 2 à 5 mm de diametre sous anesthésie générale courte.

Impact sur les animaux

Les animaux seront implantés avec une capsule de verre (diamètre de 2 à 5 mm) sous anesthésie générale et analgésie pour limiter au maximum la douleur associée à l'acte. Il est possible que cet acte entraine des douleurs chirurgicales au réveil ou post-chirurgicales pendant la récupération. Ces implants ont un format standard et n'affectent pas les 5 libertés individuelles de la souris.

Devenir

A l'issue de la procédure (mise en place d'un implant sous cutanée), les animaux sont remis dans leurs vivariums en condition d'hébergement classique pour la collecte de données physiologiques de base. A la fin de l'expérience, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Notre but est de comprendre les liens entre cognition, activité physique, métabolisme, et génétique. Pour cela il faut quantifier les conséquences des communications entre les organes (muscle cerveau tube digestif) qui ne peuvent se comprendre par l'étude individuelle de chaque organoide (cerveau, muscle...). La souris est un modèle pertinent par le controle de la génétique et des conditions expérimentales de l'élevage.

Réduction

Ce projet est une étude pilote pour évaluer de nouveaux senseurs qui permettent de collecter simultanément des données permettant de quantifier l'activité physiques, des données permettant d'évaluer le métabolisme et de données permettant d'évaluer le comportement. La collecte simultanée de ces données dans plusieurs souris hébergée dans une cage d'élevage au cours du temps (suivi longitudinal) permettra à terme de diminuer le nombre de souris d'animaux utilisés dans des études ultérieures.

Raffinement

Dans cette étude pilote, les données ne sont pas seulement collectées pour chacune des souris en continue dans une cage d'élevage sans interférence avec l'homme, 24h/24 7j/j, la collecte de ces données est aussi localisée dans les différents domaines de la cage dans laquelle plusieurs souris sont hébergées. La validation de cette approche pourra permettre d'étudier le comportement de souris et leur état physiologique sans les soumettre à des tests stressants (dispositif de comportement, prélèvements répétés de sang) augmentant ainsi leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un mammifère extrêmement bien caractérisé et qu'il est possible de modifier génétiquement. Il s'agit d'un modèle de prédilection pour de nombreuses maladies que nous étudions au laboratoire. Par ailleurs les chercheurs impliqués dans ce projet témoignent d'une grande expérience dans l'analyse et le maniement de données de recherche issues de l'expérimentation animale sur souris. Les données, outils et savoir générés au cours de ce projet seront indispensables pour continuer les activités de recherche déjà en cours et nécessitent d'être comparées avec la littérature d'ores et déjà publiée. Les animaux seront adultes males et femelles agés de plus d'un mois.

Pour tester si la perte d'action de l'insuline dans l'intestin fragilise la barrière intestinale, 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, chaque souris subit un jeûne de quatorze heures, de deux à neuf contentions de trente secondes pour jusqu'à sept gavages, un prélèvement de sang et une ou deux injections, le prélèvement final se faisant sous anesthésie. Le porteur envisage, dans les modèles d'inflammation ou d'infection intestinale, des poils hérissés, une léthargie, une ataxie, des tremblements, des diarrhées et des saignements rectaux. Le bénéfice annoncé, concevoir des stratégies préventives et thérapeutiques, reste une hypothèse, là où les jeûnes et les gavages sont déjà planifiés.

Objectifs

L’intestin exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la production de messages circulants et iii) un rôle de barrière contre l'entrée de substances toxiques ou de micro-organismes dans le corps. Bien que la perte d'étanchéité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète, les mécanismes à l’origine des défauts d’intégrité intestinale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Ce projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les mécanismes intracellulaires permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux (1 mise a jeun de 14h, 2 à 7 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 2 injections de produit), 144 animaux (2 mises à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 4 à 9 contentions de 30 secondes pour 2 à 7 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 1 à 6 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit). Sur animaux anesthésiés : 816 animaux (un prélèvement sanguin, 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucune des lignées d'animaux génétiquement modifiés ne présente de caractère dommageable. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. Concernant les modèles d'inflammation intestinale ou d’infection par un pathogène intestinal, l’apparition de signes généraux de souffrances (tels que poils ébouriffés ou hérissés, perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement, diarrhées et saignements rectaux) est envisageable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques), qui reposent sur des phénomènes complexes et faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Ces modèles seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro car ils permettent d'obtenir une représentation de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, dans des études préliminaires, nous avons utilisé des systèmes de culture à partir de fragments intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux sera réalisée avec un logiciel approprié. La "significativité" des résultats sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui nécessitant pas de traitement sur animaux vigiles et permettant d’étudier plusieurs parties de l’intestin et l'effet de plusieurs traitements à partir d’une seule souris, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

Les souris utilisées portent une mutation du gène Stim1 qui abîme progressivement leurs muscles et y fait apparaître des agrégats tubulaires. 160 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Identifiées par biopsie de l'oreille à 21 jours, elles passent ensuite six mois séparées de leurs congénères, une partie avec une roue d'exercice, un isolement que le porteur présente comme compensé par l'enrichissement de la cage. À huit ou douze mois selon le protocole, elles sont tuées pour prélever leurs muscles.

Objectifs

Les myopathies sont des maladies touchant les muscles squelettiques. Certaines d’entre elles sont d’origine génétique. Chez l’Homme, certaines mutations du gène Stim1 conduisent au développement d'atrophie musculaire des muscles proximaux chez l'Homme avec la présence d'agrégats tubulaires dans les fibres musculaires. Les souris porteuses de mutations sur Stim1 à l’état hétérozygote présentent une atteinte musculaire très progressive. Au fil du temps, la présence d’agrégats tubulaires est détectée dans les muscules des souris mutantes. Plusieurs publications récentes ont démontré l'intérêt de faire pratiquer une activité physique volontaire chez les souris myopathes pour diminuer les atteintes musculaires. Nous voulons donc tester l'activité motrice volontaire et voir son effet pour améliorer le phénotype histologique de ces souris. Les souris seront analysées à la fin de leur entrainement pour voir si l'histologie musculaire est préservée et si les paramètres métaboliques sont restaurés à la normale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide l'activité physique même modérée va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle chez les patients.

Procédures

Les animaux âgés de 21 jours seront identifiés par biopsie à l'oreille. Par la suite, ils seront uniquement soumis à un isolement tactile de leurs congénères durant une durée de 6 mois. Certains animaux âgés de 12 mois pourraient présenter des faiblesses musculaires modérées sans impact sur la qualité de vie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un protocole volontaire pour l'exercice physique le traitement ne devrait pas entrainer d'effet indésirable. Les souris n’ayant pas accès à la roue d’exercice développeront elles les atteintes musculaires histologiques progressives qui ne devraient pas entrainer de phénotype clinique délétère. L’isolement que nous devrons mettre en place pour l’activité locomotrice, qui pourra être considéré comme une nuisance sera compensé par un environnement enrichi. La présence dans les cages de la roue est un enrichissement important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de prélever les tissus musculaires et faire des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier un modèle in vitro de formation des aggrégats tubulaires dans des cellules musculaires. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée passe par une activité musculaire cette activité locomotrice ne peut se faire que sur un modèle in vivo. Les souris génétiquement altérées mimant la mutation retrouvée chez les patients est un bon modèle pour développer les approches thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons une approche statistique nous permettant de définir qu'il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe maximum.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Avant d'entrer en procédure, les animaux seront hébérgés par groupe de 5. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton.Afin de limiter les manipulations et le stress des animaux, le prélèvement de tissus pour la réalisation du génotypage sera couplé au geste d’identification (biopsie à l’oreille). Les animaux seront hébergés seul lors de la procédure mais avec un double enrichissement (dome et/ou kraft + roue) et maintiendront un contact olfactif, visuel et auditif avec leurs congénères.La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelles et tunnels). Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des signes cliniques, impactant le bien être des animaux. Les points limites nous permettront de limiter au strict miminum l’apparition de souffrance.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction des muscle squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Les animaux seront suivis de la naissance jusqu'à leur mise à mort à la fin du projet (8 mois ou 12 mois selon le protocole)

Un millilitre de liquide abdominal par souris, prélevé entre 67 et 72 heures après l'injection, avant que le parasite ne tue l'animal au-delà de 80 heures : 50 000 souris femelles de réforme vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent à produire les toxoplasmes entiers qui composent des kits de dépistage de la toxoplasmose, dont le porteur revendique 10 millions de tests fournis dans le monde. À partir de la soixantième heure, les parasites libérés dans la cavité abdominale provoquent une douleur et un inconfort que le porteur dit prendre en charge par un analgésique injecté dès la quarante-huitième heure. Un premier projet de remplacement a été arrêté en 2019 faute d'atteindre les performances visées, un autre est annoncé pour 2027, et l'entreprise indique avoir divisé par deux en dix ans le nombre de souris utilisées à volume de tests constant.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais pour le diagnostic de la toxoplasmose humaine. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Il est capable d’infecter l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires sans symptômes apparents dans 50% des cas. On estime entre 200 000 et 300 000 nouvelles infections chaque année en France le plus souvent bénignes. Par contre cette affection transmissible de la mère au fœtus peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant (150 cas par an), et peut être la cause de mortalité chez l’immunodéprimé (environ 200 cas par an en France). La séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes baisse régulièrement depuis une cinquantaine d’années. Elle varie selon les régions et est liée à des facteurs géo-climatiques et des habitudes de consommations alimentaires différentes. La baisse régulière de la séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes a pour corollaire une augmentation de la population des femmes séronégatives amenées à être suivies mensuellement (Santé Publique France). La France a instauré un programme de prévention unique au monde : le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire dans le cadre de suivi prénatal avec une sérologie en début de grossesse, qui entraine un contrôle mensuel sérologique des femmes non immunisées et la fourniture de conseils nécessaires pour prévenir la maladie et ainsi en éviter la transmission au fœtus. L’entreprise fabriquant les kits est pionnière de ce secteur et y occupe un positionnement unique. Ces trousses de diagnostic sont des matériels de référence, et donc utilisés en confirmation, en deuxième intention, pour éviter un diagnostic erroné. Les réactifs concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois de très bonnes sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et spécificité (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence, type CHU) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte fin 2022, 72 % des laboratoires CHU français utilisaient ces tests.

Bénéfices attendus

Les réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Ces kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois: une très bonne sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et une très bonne spécificité pour les immunoglobulines (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence comme les C.H.U.) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte: fin 2022, 72 % des laboratoires hospitalo-universitaires français utilisaient ces tests.

Procédures

- injection en moins 5 secondes/animal - A 48 heures injection d’analgésique en moins 5 secondes/animal. - De 67 à 72 heures après inoculation initiale : euthanasie rapide. - aucun prélèvement sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les souris sont injectées avec une suspension contenant des parasites et des cellules. Ces dernières sont colonisées par les parasites intracellulaires stricts. Ils ne sont pas agressifs pour la souris car tant qu’ils sont hébergés dans les cellules, ils n'ont pas de conséquence sur l’état sanitaire de l’animal. Il est important de noter que la faible quantité de la suspension en cellules ne provoque pas de douleur à l’animal. A partir de 60 heures après l’injection, les parasites s’étant multiplier dans la cellule, se retrouvent libérés dans la cavité abdominale ce qui entrainera une douleur au niveau de l’abdomen et un inconfort pris en charge de façon prédictive et jusqu’à la fin du protocole, avec l’ajout d’un analgésique dès la 48ème heure.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Au-delà de 80 heures le parasite provoquerait la mort de l’animal. De ce fait le liquide d’intérêt doit être prélevé avant la mort de l’animal.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés : sensibilité et spécificité des kits. Un premier projet de remplacement a été stoppé en 2019 car les objectifs de performance de cette nouvelle génération de tests n’ont pas été atteints. A ce jour un développement de nouvelles générations de kits est en cours afin de remplacer l’origine des antigènes en les produisant par culture. La durée du développement a été fixée à 8 ans à minima. La stratégie est de définir les bonnes conditions de culture garantissant un antigène présentant tous les épitopes d’un lysat parasitaire et ce, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Le lancement des premières commercialisations en Europe est prévu au premier semestre 2027.

Réduction

L’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL de liquide d’intérêt très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Plusieurs projets ont été menés pour réduire le nombre d’animaux utilisés : l’amélioration des conditions de vie des souris : enrichissement, adaptation du nombre d’animaux par cage, la rationalisation et l’optimisation des processus, l’ajout d’un analgésique. Ces projets ont permis de diviser par 2 l’utilisation annuelle des souris en 10 ans, alors que les volumes de tests vendus sont restés constants. Le développement de nouvelles générations de kits va permettre de réduire de façon conséquente le nombre d’animaux utilisés pour la production de ces toxoplasmes. 50 000 souris sont nécessaires sur les 3 années à venir. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 10 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. Les animaux continuent de se mouvoir dans la cage et de s’alimenter. Toutefois si un animal présente des signes de dégradation de son état sanitaire il est immédiatement euthanasié. Ces signes sont : isolement, apathie, dos voussé, yeux plissés, poil piqué. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc d’en diminuer l’impact : le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Les cellules ne peuvent pas se multiplier et donc ne sont pas toxique pour l’animal et provoquer les nuisances qu’elles pourraient causer si elles étaient inoculées seules, à savoir la production d’une quantité importante d’ascite après une dizaine de jours d’incubation. De plus le protocole ne dure que trois jours, il n’y a pas de début de production d’ascite. Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme a lysé la totalité des cellules et se retrouve libéré dans le péritoine. Il colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes d’inconfort apparaissent. Pour diminuer ceux-ci, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type Kétoprofène. Cette molécule est dotée d’une puissante activité anti-inflammatoire, antalgique et antipyrétique. La concentration maximale est atteinte en une heure et reste constante et élevée au niveau des sites inflammatoires pendant 30 à 36 heures, ce qui couvre la totalité du protocole. Les animaux sont alors euthanasiés puis le liquide d’intérêt est récolté.

Choix des espèces

A l’origine la culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. De plus ces trousses de diagnostic sont considérées comme matériel de référence et sont utilisés en confirmation, c’est-à-dire en deuxième intention (pour éviter un diagnostic erroné). Ils permettent la prise de décision en cas de résultats sur des sera à résultats douteux. Les animaux utilisés sont des souris femelles de réformes d’un poids de 20-39g de souches robustes, calmes et permettent une manipulation aisée. L’utilisation de souris de cette tranche de poids permet d’avoir un liquide d’intérêt de bonne qualité. Des essais menés sur des animaux plus jeunes et d’un poids inférieur ont montré que le liquide d’intérêt était de moins bonne qualité car souvent hémolytique et bien moins concentré . Après une période d'acclimatation les animaux entrent en production.

1 015 mérions vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant dans l'abdomen 80 filaires parasites dont une trentaine survit et douze femelles seront analysées. Un groupe reçoit un antibiotique deux fois par jour pendant quatorze jours à partir du quarantième jour d'infection, un autre un antihelminthique deux fois par jour pendant cinq jours, et tous subissent un prélèvement de sang sous anesthésie locale à 70 puis à 90 jours. La mise à mort sert à récupérer les filaires logées dans les espaces péritonéal et pleural. L'effectif est calculé à l'envers, à partir des 12 180 filaires femelles voulues, ce qui donne le nombre de mérions à infester.

Objectifs

Les parasitoses comme les filarioses affectent des millions de personnes dans les zones tropicales. Les filaires sont des nématodes parasites de l’homme et de nombreux vertébrés terrestres et sont toujours transmis par des arthropodes hématophages, comme des acariens. Le développement de résistance aux traitements actuels et l’absence de vaccin justifient la demande pour de nouvelles études en particulier sur des modèles animaux de références pour analyser le développement parasitaire, les réponses immunitaires, et les pathologies. Nous utilisons un modèle de filariose chez les rongeurs avec la filaire Litomosoides sigmodontis, laquelle présente de nombreuses caractéristiques proches de celles des filaires de l’homme. Les bactéries Wolbachia vivent dans une interaction mutuellement bénéfique dans certains compartiments spécifiques des filaires. Elles sont essentielles pour la survie et la fertilité des filaires et l’élimination de la bactérie par des traitements antibiotiques conduit à des retards de développement, une réduction de la longévité des filaires adultes et à la stérilité des femelles. Pour se déplacer dans les filaires, les bactéries utilisent un réseau composé de microtubules, des assemblages de protéines tubulines. De ce fait tout traitement déstabilisant le réseau de microtubules aura un effet sur les Wolbachia et donc sur la santé des filaires. Le projet a pour objectifs : 1/ d’étudier le réseau de microtubules dans les filaires au cours du développement chez le rongeur ; 2/ d’analyser la localisation et la quantité de Wolbachia dans les filaires au cours du développement de la filaire chez le vertébré ; 3/ d’estimer l’impact sur le développement bactérien et filarien de traitements antibiotiques ou antihelminthiques visant le réseau de microtubules.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance du développement filarien et de la répartition de ses bactéries endosymbiotiques Wolbachia devrait permettre de mieux connaitre le mode d'action de traitements anti-filarien et anti-Wolbachia.

Procédures

Tous les animaux auront une injection intrapéritonéale de parasites (filaires) au temps 0. Un groupe recevra un traitement antibiotique par voie orale qui débute au 40ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 14 jours, un autre groupe recevra un traitement antihelminthique( visant donc les nématodes donc les filaires) benzimidazole par voie orale qui débute au 35ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 5 jours. Un troisième groupe contrôle n’est pas traité. Un prélèvement sanguin de 10µl sous anesthésie locale (lidocaine) pour établir la microfilarémie (nombre de stades sanguins des filaires) des mérions à 70 jours et 90 jours post infection sera effectué.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont liées à l'infection filarienne. Elle est peu symptomatique et on n’observe pas de mortalité augmentée due à l’infection. Une surveillance journalière est opérée pour identifier d'éventuels effets indésirables, comme une perte de poids, une modification de l’aspect physique ou du comportement sur les animaux

Devenir

Euthanasie pour accéder aux filaires qui résident dans l'espace péritonéal et l'espace pleural du mérion

Remplacement

Le recours aux animaux se justifie dans la mesure où il n'existe actuellement aucun modèle alternatif permettant d’étudier les filarioses à tous les stades de développement de la filaire. Le cycle de vie est complexe et les filaires muent difficilement en culture et ne se reproduisent pas dans ces conditions.

Réduction

Le nombre de mérions est estimé au plus près des nombres de filaires femelles attendus et nécessaires pour réaliser toutes les analyses. Pour éviter les problèmes de compétitions en parasitologie (trop de parasites) qui ont un impact négatif sur le développement du parasite, les mérions sont infestés avec 80 filaires; cependant comme pour toutes les filarioses seules une partie des filaires survivent à la réponse immunitaire de l'hôte vertébré; dans le couple mérion-filaire Litomosoides sigmodontis, 30% des filaires inoculées survivent soit 24 filaires par mérion; le sex-ratio est de 50/50 et les études impliquant une caractérisation de l'embryogénèse/l'ovogénèse, seules les filaires femelles seront analysées ce qui représente 12 femelles par mérion. La totalité des analyses nécessite 4860 filaires femelles issues de 405 mérions non traités, 4860 filaires femelles issues de 405 mérions traités par un benzimidazole, 2460 filaires femelles issues de 205 mérions traités par antibiotique. Ces nombres de filaires sont déterminés de façon à avoir suffisamment de matériel en protéine ou en acides nucléiques et une puissance statistique suffisante pour valider le résultat observé

Raffinement

Les mérions sont dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, nourriture, enrichissement, température et cycle jour/nuit). Entre autre, ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Une surveillance journalière des animaux est réalisée par un personnel compétent qui connait bien cette espèce.

Choix des espèces

Le mérion est l'animal le plus proche de l'hôte naturel de la filaire Litomosoides sigmodontis (même durée de l'infection filarienne, charge microfilarienne comparable...) ce qui permet d'étudier le développement de la filaire dans les conditions les plus proches de son environnement vertébré normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte.