Procédures modérées

Dépilés à la crème jusqu'à dix fois, immunisés jusqu'à douze fois, piqués jusqu'à sept fois pour des prises de sang, 1 500 rats et 750 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de produire des anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d'un seul animal, à la demande de partenaires industriels qui commandent les cibles. Les animaux dont la réponse immunitaire reste faible sont tués sans attendre, les autres partent vivants chez le client, qui prélève ensuite le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Aucun calcul statistique n'a fixé les effectifs, le porteur indiquant s'être entendu avec ses partenaires sur trois à dix animaux par cible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la création d’une grande diversité d’anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d’un seul animal. Pour cela, un antigène (sous forme d’ADN ou de peptide/protéine) est administré à des rongeurs, afin que le système immunitaire produise des anticorps multiples. Le sang (contenant les cellules lymphatiques) et les organes (ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse) de ces animaux seront collectés pour récupérer ces anticorps. Les antigènes en question seront des récepteurs cellulaires humains ciblés et permettront de développer de nouveaux candidats médicaments. La découverte et le développement de ces anticorps appropriés à l'action très spécifique est donc indispensables dans le traitement de maladies infectieuses et des cancers ainsi que dans le diagnostic de ces maladies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'obtention d'outils thérapeutiques afin de traiter des pathologies telles que les cancers, les maladies inflammatoires et neurologiques notamment. Ils constituent donc des solutions thérapeutiques majeures.

Procédures

Les animaux seront soumis aux dépilations (jusqu'à 10), aux immunisations (jusqu'à 12) et aux prélèvements sanguins (juqu'à 7). Chaque intervention dure environs 3 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la douleur des administrations/injections/prélèvements sanguins, la douleur aux niveaux des sites d'administrations/injections (irritations, légères réactions inflammatoires), et le stress causé au moment de la dépilation (crème dépilatoire), des immunisations, des prélèvements de sang et de la contention aux moments de ces interventions.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort. Si aucune réponse immunitaire significative ne peut être détectée chez un animal, l’immunisation est arrêtée et l’animal est mis à mort. Par contre si la réponse immunitaire est présente, les animaux sont expédiés a notre partenaire pour collecter les Anticorps.

Remplacement

La bibliographie montre que le remplacement des anticorps d’origine animale par des anticorps synthétiques a été initié depuis plusieurs années dans différents domaines mais que, dans l’état actuel de la technologie, il reste des situations dans lesquelles soit les anticorps synthétiques restent inadaptés donc inutilisables (anticorps dirigés contres des protéines dénaturées, anticorps anti-peptides), soit l’évolution vers l’utilisation d’anticorps d’origine non animale en production sera un processus de longue durée et les obstacles techniques subsistent (anticorps à usage thérapeutique ou diagnostic). La production d’anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène, nécessite l'interaction complexe de toutes les cellules (surtout des cellules B) et d’organes lymphatiques impliqués dans le système immunitaire d'un organisme vivant mammifère. Le développement d’une grande diversité d’anticorps par leurs séquences n'est pas possible en l'état actuel de la recherche, tant par les techniques de culture cellulaire que par l'utilisation d'organes isolés, raison pour laquelle l'immunisation d'organismes entiers (souris et rats) est nécessaire. Les dernières découvertes oncologiques ont montré que des facteurs individuels dans les voies de signalisation cellulaire humaines qui jouent un rôle central dans le développement du cancer (ou d'autres maladies importantes) sont donc appropriés comme "cibles" de nouveaux médicaments pour combattre ces maladies. Les anticorps conviennent particulièrement bien comme "candidats médicaments", car ils se caractérisent généralement par une spécificité d'action très élevée et une action sélective par rapport à la cible (moins d'effets secondaires), contrairement à de nombreux autres candidats médicaments (par ex. par voie chimique) qui ont des effets secondaires importants, car ils agissent de manière très peu spécifique. C'est pourquoi la découverte et le développement d'anticorps appropriés et très spécifiques sont indispensables pour de meilleures mesures thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer.

Réduction

Nous réalisons ce protocole à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leurs objectifs scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'animaux utilisés par projet d'immunisation varie entre 3 et 10 animaux par immunogène ; le nombre d'animaux utilisés dépend de l'antigène et de l'espèce animale à immuniser. Afin d'obtenir une diversité suffisamment élevée des anticorps à développer, 3 à 10 animaux sont immunisés par groupe et par cible, en fonction de la cible et de l'espèce. Une fois l'immunisation effectuée, les cellules lymphatiques (provenant des organes cibles pertinents pour les cellules immunitaires comme la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) sont prélevées sur les animaux immunisés. Il n'y a pas de groupe d'animaux de contrôle par essai/antigène cible. Les sérums pré-immunitaires des mêmes animaux immunisés servent de contrôle dans les essais. De plus, pour une bonne campagne d'immunisation pour le criblage des cellules B, il est important de prélever les organes des animaux le plus frais possible et de les traiter directement après le prélèvement. Une cryoconservation des organes lymphatiques ou de leurs cellules après le prélèvement serait réalisable, mais serait également responsable d’une très grande perte de matériel cellulaire, en raison de la mort des cellules due au processus de congélation et de décongélation, ce qui nécessiterait l’utilisation de plus d’animaux immunisés pour avoir la quantité d’anticorps voulu. C’est pour cette raison, que les animaux immunisés sont transportés vivants jusque chez notre client, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour une campagne d'immunisation.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant de l'enrichissement (bâtons de bois et matériel de nidification) et une surveillance est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation. Les contentions, épilations, immunisations et prélèvements sanguins sont réalisés par un personnel formé et expérimenté. En cas d'inflammation (au niveau des sites d'administrations/injections), une injection sous-cutanée d'analgésie sera réalisée, elle pourra etre répétée 24 h après si nécessaire.

Choix des espèces

Les animaux à immuniser doivent être des mammifères possédant une réponse immunitaire humorale (anticorps sécrétés par les cellules lymphocytaires B). Pour qu'une immunisation avec un antigène cible humain s'accompagne d'une réponse immunitaire significative de l'espèce immunisée, il est nécessaire que l'homologie de l'antigène cible entre l'animal et l'homme soit suffisamment différente pour que l'antigène cible soit reconnu comme "étranger" chez l'animal et que celui-ci produise des anticorps spécifiques à l'antigène cible. C'est le cas chez le rat et la souris qui produise des anticorps de bonne qualité. Les animaux seront tous utilisés au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines d’âge et maximum 20 semaines (au démarrage du protocole). A cet intervalle d'âge, les animaux présentent une réponse immunitaire particulièrement bien développée et réagissent avec une diversité aussi grande que possible de différents anticorps contre un antigène. Une grande diversité de séquences d'anticorps différentes est importante pour le développement d'anticorps candidats, car l'objectif est de reconnaître le plus grand nombre possible d'épitopes et de liaisons à l'antigène avec différentes affinités. A partir de l'âge d'environ 20-25 semaines, la réactivité et la diversité peuvent diminuer.

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

Déjà utilisés dans d'autres expériences et présents sur le site depuis au moins un an, trois macaques à longue queue vont subir une injection directe dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'IRM et l'injection intracérébrale se déroulent en une seule séance d'environ six heures sous anesthésie générale, après intubation, et le réveil peut s'accompagner de désorientation, de perte d'équilibre, de perte de réflexes et d'hypothermie. Convulsions, tremblements, chutes, ulcères cornéens et œdème aux points d'entrée du cadre stéréotaxique figurent parmi les suites possibles. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune alternative non animale pour vérifier qu'une injection intracérébrale est bien tolérée, et destine ce modèle validé à des études réglementaires de toxicologie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit de référence associé à un agent de contraste et via une évaluation histopathologique complète afin d’évaluer l’impact et qualité de la procédure d’administration intracérébrale nécessaire pour la conduite d’étude de toxicologie générale. Une fois validé, ce modèle sera utilisé sera utilisé dans des études précliniques d'évaluation de la sécurité de candidats médicaments destinés à être administrées par voie intracérébrale chez l'homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intracérébrale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer).

Procédures

L’imagerie IRM et l’injection intracérébrale (1 occasion, d’une durée d’envion 6 heures) seront réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 3 temps (prétest, durant la phase d’observation et à la mise à mort). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigile et seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont pratiquées sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Des événements anesthésiques peuvent survenir (ex : hypothermie, hypotension…). Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains réflexes neurologiques (palpébral…) ains qu’une hypothermie et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie, envion 6 heures) peuvent être observées temporairement. Des signes locaux (oedème) au niveau des points d'entrée des cadres ou des ulcères cornéens pourraient être observés et être associés à de la douleur. Des symptômes neurologiques (risque de pertes d'équilibres ou chutes, tremblement, convulsions,…) peuvent être observé à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisés sur animaux vigiles, ceux-ci pourraient être associés à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée et des hématomes post-prélèvement. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée. Ces signes cliniques devraient être seulement transitoires et seront surveillés par un vétérinaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et une évaluation histopathologique et une analyse de biodistribution seront réalisées au niveau du tissu cérébral à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’administration intracérébrale. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique).

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 3 animaux seront utilisés dans ce projet. Des animaux non-naïfs seront utilisés dans le cadre de ce projet afin de réduire l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Le produit de référence associé à l’agent de contraste sera injecté à une seule occasion (volume maitrisé de 100 µL par hémisphère, débit maximal 3 µL/min) et à une dose bien tolérée sans effet toxique attendu. Les animaux non-naïfs sont présents sur le site depuis au moins 1 an, et sont acclimatés aux conditions de vie dans le laboratoire. Les animaux auront au moins 5 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant le J1. Un entrainement pour les pesées corporelles et des interactions positives seront mis en place. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales (contention, suivi du poids). Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Une protection mécanique préventive des yeux et des soins locaux seront mise en place pré- et post-opératoire afin de réduire le risque d’ulcéres cornéens. L’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie/anti-inflammatoire et antibiothérapie préventive sera mise en place avant (entre 30min et 1h avant l’anesthesie) et après administration (jusqu’à 6h et 7 jours après administration pour l’antibiothérapie et l’analgésie/anti-inflammatoire, respectivement) du produit de contraste et élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. Une évaluation neurocomportementale sera réalisée duant le pretest et à deux occasions après adminisration (+4h et +24h post-procédure). La mise à mort sera considérée pour les points limites suivants : convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée, incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal, perte d'appétit ne rétrocédant pas aux mesures de soutien, perte de poids supérieur à 15% et infection des plaies chirurgicales ne rétrocédant pas aux soins. Des soins locaux quotidiens seront appliqués à la suite de l’administration, jusqu’à 7 jours post-administration. Les animaux sont gardés isolés 2h pour limiter le risque de chutes. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante (et/ou coussin chauffant) sera mise en place. Les primates seront socialisés.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non humain (PNH) pour la conduite des études de sécurité préclinique est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intracérébrale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisées chez le macaque. La validation du modèle d’administration intracérébrale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire. Des animaux d’environ 3 ans seront utilisés pour ce projet.

Les brebis gestantes et les agneaux qui présentent des signes de souffrance ou d'infection après une manipulation peuvent être mis à mort par injection. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au 125e jour d'une gestation de 145 jours, chaque brebis est opérée environ quatre heures sous anesthésie générale et son fœtus reçoit des cathéters vasculaires, puis une anesthésie loco-régionale permet des prises de sang sur le fœtus, huit par journée de manipulation, la même brebis étant utilisée pour plusieurs expériences dès le quatrième jour. L'équipe mesure l'effet d'une anesthésie de césarienne, d'une péridurale ou d'une sédation du fœtus sur son cœur, sa tension et son sang. Le porteur déclare 20 adoptions, tout en écrivant qu'à la fin des procédures expérimentales, les animaux non-humains utilisés sont mis à mort.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés en vue de l’expérimentation chronique. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. après manipulation et si nécessaire, une euthanasie peut être effectué par une injection médicamenteuse des brebis et des agneaux (en cas de signe de souffrance ou d’infection) A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. La réponse des fœtus d’agneau étant habituellement très reproductible d’un animal à l’autre, un effectif faible (environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental) est suffisant.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Pour tester des vecteurs de thérapie génique contre une maladie mitochondriale qui tue la plupart des enfants atteints avant deux ans, 3 892 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des tissus. Les nouveau-nés sont anesthésiés par contact avec de la glace humide pendant trente à soixante secondes, puis injectés dans la veine temporale. Chaque souris peut subir jusqu'à treize échocardiographies sous anesthésie, treize open field et treize grip tests, et un quart d'entre elles, celles chez qui le gène est éteint, développe une cardiomyopathie fatale accompagnée de perte de poids, de difficultés de mouvement et d'une posture anormale. Les trois quarts restants naissent sans la mutation et sont tués comme les autres, l'effectif de 3 892 n'étant justifié que par référence à des travaux antérieurs.

Objectifs

Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le coeur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés.

Bénéfices attendus

À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.

Procédures

-Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ) - échocardiographie (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -open field test (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -grip test (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - anesthésie par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) -biopsie par genotypage (1 min par souris; 1 fois par souris)

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie fatale. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes

Porteurs par construction d'une dégénérescence de la rétine et d'une déficience majeure du système immunitaire, 1 680 rats vont être élevés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur immunodéficience s'accompagne d'une alopécie qui fait s'accumuler des poils sous la paupière, source d'irritation oculaire, et d'une malocclusion dentaire qui peut conduire à la malnutrition. Chaque rat subit une biopsie de queue ou d'oreille dans les dix jours suivant la naissance, et certains une coupe des dents. Une partie sera transférée à trois mois vers un autre établissement pour y recevoir des greffes de cellules humaines, une autre sera gardée pour la reproduction, les rats au mauvais génotype, ceux dont la fertilité baisse, ceux qui atteignent un an et ceux dont la malocclusion devient trop importante étant tués.

Objectifs

La transplantation de cellules comme traitement des maladies dégénératives de la rétine est une des plus prometteuses parmi les thérapies visant à restaurer la vue et l’utilisation de cellules souches humaines, est une des approches les plus prometteuses; L’évaluation de son bénéfice thérapeutique et l’absence d’effet néfaste nécessite sa mise en œuvre et l’évaluation de ses conséquences positives comme négative à l’aide d’un modèle animal présentant des caractéristiques proches de la maladie humaine. Cependant, la transplantation de cellules humaines chez l’animal, donc dans une autre espèce, est par nature source de rejet sévère de la greffe (barrière d’espèce) par le système immunitaire compromettant notre capacité à évaluer son efficacité. Notre projet consiste à réaliser un élevage d’animaux modèles porteur d’une mutation génétique responsable d’une dégénérescence rétinienne et d’une autre mutation, responsable d’une déficience majeure du système immunitaire. cette déficience du système immunitaire empeche le rejet de greffet et permettra par la suite de mettre en place de nouveaux traitements basés sur la greffe de cellules.

Bénéfices attendus

Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des dérivés de cellules souches humaines ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte à court terme. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un suivi dans le temps trop court en raison d’une faible survie des cellules greffées en raison de la barrière d’espèce. L’immunodéficience (système immunitaire défaillant) des animaux qui seront élevés dans ce projet, permettront de réaliser des greffes en limitant significativement le rejet des cellules transplantées. Une survie à plus long terme laisse présager la mise en évidence d’un véritable bénéfice fonctionnel de la transplantation. L’élevage de ces animaux permettra également de s’affranchir des traitements pharmacologiques immunosuppresseurs (traitement visant à réduire voir bloquer la réponse immunitaire) à l’efficacité variable sur le moyen et long terme.

Procédures

Un prélèvement d'un petit bout de queue ou d’oreille (biopsie) pour analyse génétique est réalisé une seule fois dans les 10j jours suivant la naissance. Les animaux qui seront utilisés dans ce projet sont immunodéficients et peuvent présenter un phénotype dommageable due à une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant dans certains cas nécessiter une intervention invasive rapide de quelques secondes (coupes des dents) voir une euthanasie en cas de malocclusion trop sévère.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront utilisés dans ce projet peuvent présenter un phénotype dommageable caractérisé par une malocclusion dentaire (défaut de pousse des dents) pouvant poser des problèmes de malnutrition. Dans certains cas cette malocclusion nécessite une intervention invasive (coupes des dents) qui peut provoquer un certain stress. Par ailleurs, les animaux subiront un prélèvement au niveau de la queue (biopsie) pour identifier certaines caractéristiques génétiques. Le prélèvement est rapide et n’est réalisé qu’une seule fois mais peut être une source de douleur ou d’inconfort au moment du geste. Les animaux présentent une défaillance du système immunitaire (immunodéficient) impliquant un risque accru de maladie. Par ailleurs, l’alopécie caractéristique des animaux présentant une déficience du système immunitaire peut conduire à l’accumulation de poils dans le cul de sac conjonctival (sous la paupière) responsable d’irritation et donc d’une certaine gêne.

Devenir

Une partie des animaux seront transférés (à l’âge de 3 mois) dans un autre établissement utilisateur dans le cadre d’une utilisation continue et rattaché à d’autres projets faisant l’objet d’autorisations distinctes. D’autres permettront de maintenir la colonie (élevage ; reproduction). Les animaux ne présentant par les caractéristiques génétiques nécessaire pour le projet, ceux présentant une baisse de fertilité, ou ayant atteint l’âge d’1 an ou enfin ceux présentant un point limite seront euthanasiés.

Remplacement

Le projet consiste à élever des animaux qui permettront la réalisation d’autres projets (utilisation continue) bénéficiant d’une autorisation et dont l’objectif est de développer une thérapie cellulaire pour des maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Le projet nécessitera 1680 animaux. Il s’agit du nombre strictement nécessaire pour permettre le maintien de la colonie et produire le nombre d’animaux requis pour les autres projets expérimentaux disposant d’une autorisation de projet (dans le cadre d'une utilisation continue). Le nombre d’animaux a été calculé afin d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique. Le nombre total tient compte du fait que certains animaux ne pourront pas être inclus dans l’étude en raison de malocclusions (défaut de pousse des dents) ou d’un profil génétique incompatible avec les projets expérimentaux associés.

Raffinement

L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les animaux sont par ailleurs hébergés par 2 dans des cages de stabulation standard avec enrichissement. Une alimentation et un enrichissement spécifique présentant un risque de malocclusion sera mis en place afin de limiter son développement. Pour protéger les animaux au maximum en raison de leur faible immunité, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (cage, litière, enrichissement) ou irradié (croquettes). La manipulation des animaux s’effectue uniquement sous hotte et les animaux sont hébergés en portoir ventilé à pression positive. L’atteint d’un point limite, principalement une malocclusion trop importante conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

le projet prévoit l’élevage d’animaux génétiquement immunodéficients et présentant une dégénérescence rétinienne Ces rats sont porteurs d’une mutation ayant des conséquence identique à celles retrouvés chez de nombreux patients souffrant de dégénérescence rétinienne. Ces animaux présentent également une autre mutation qui compromet le système immunitaire des rats (immunodéficience) qui a pour conséquence le non rejet des cellules greffées. Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (barrière d'espèce). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme. Enfin, la dégénérescence rétinienne chez ces animaux est rapide permettant de réaliser la transplantation chez des animaux relativement jeunes (3 mois), àge auquel les animaux présentant les caractéristiques génétiques attendues seront transféré sur un autre projet. le transfert d’animaux jeunes (trois mois) permettra de limiter les atteintes liées aux vieillissement tout en permettant un suivie à moyen/long terme des cellules transplantées (prévu jusqu’à 6 mois post-transplantation). Les animaux en élevage et présentant les bonnes caractéristiques génétiques seront mis en accouplement à partir de l’âge de 10 semaines, âge auquel les animaux présentent une fertilité permettant leur reproduction.

Tatouées et biopsiées de la queue avant huit jours, puis injectées quatre jours de suite dans la cavité abdominale, 688 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le tamoxifène injecté peut provoquer chez les mâles un œdème testiculaire, voire une hernie inguinale. Deux à cinq prises de sang et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse au genou suivent l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë, dont le porteur écrit ignorer le délai, et qui dégrade l'état des souris en quelques jours: perte de poids, détresse respiratoire, anémie, masses sous la peau, prostration. Il présente ces prélèvements comme respectant "les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux", tout en indiquant que la ponction du genou peut léser le cartilage et perturber les déplacements.

Objectifs

Sur la base de données scientifiques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques B d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus leucémogène de cette hémopathie, de deux protéines retrouvées dans les cellules leucémiques de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle murin dans lequel ces deux protéines sont exprimées dans les cellules lymphoïdes pour voir si elles sont à l’origine de la maladie. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsable de l’émergence de ce type de leucémie chez l’Homme. Notre projet a pour but : (1) de caractériser les anomalies morphologiques, cellulaires et moléculaires dans le système hématopoïétique des souris qui expriment les deux protéines dans leurs cellules lymphoïdes, (2) de comparer ces anomalies aux anomalies décrites pour ce type de leucémies chez l’Homme, (3) d’étudier expérimentalement la pathogénicité de ces deux protéines. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intégre dans une projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence un sous-type particulier de patients atteints de leucémies lymphoblastique B de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de leucémogenèse de ce type particulier de leucémies permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autre, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.

Procédures

Les souris transgéniques seront tatouées et une biopsie de queue sera réalisée avant 8j. Les animaux au génotype d'intérêt seront soumis à quatre injections dans la cavité abdominale de produits chimiques (1 injection par jour pendant 4 jours sur animal vigile) au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de la leucémie attendue, 2 à 5 prises de sang, à raison d’une prise par ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse réalisés sur animal anesthésié), avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements, pourront être réalisés sur ces souris. Les souris immunodéprimées seront soumises à une injection de cellules de moelle osseuse murine (sur animal vigile en contention). Deux à quatre prises de sang, à raison d’une prise par mois (sur animal anesthésié ou vigile selon la voie de prélèvement choisie pourront être réalisées pour suivre l’évolution de la leucémie.

Impact sur les animaux

Le tatouage et la biopsie de queue induiront une douleur légère de courte durée. Les animaux transgéniques recevront une dose définie de tamoxifène par injection intra-péritonéale. Ceci peut s’accompagner d’une inflammation au site d’injection et de douleur abdominale au moment de l’injection. Chez les mâles, un œdème testiculaire peut apparaître secondairement, voire une hernie inguinale. De même, l’injection intra-veineuse de cellules de moelle osseuse murines dans les souris immunodéprimées peut s’accompagner d’inflammation au site d’injection. Etant donné l’immunodépression des souris , il ne devrait pas y avoir de réaction de rejet. Sur le plus long terme, notre hypothèse de travail est que les souris développeront des leucémies aiguës lymphoblastiques. Nous ne connaissons pas le délai d’apparition des symptômes. Lorsque la maladie se déclare, l’état de santé des souris se dégrade rapidement (quelques jours). Les cellules leucémiques se propagent, se multiplient et envahissent la moelle osseuse. Ceci entraine une forte perturbation de la production de cellules sanguines. Les souris perdent généralement du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de détresse respiratoire, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, et leur pelage n’est plus bien entretenu. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui perturbent ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection au niveau du point de ponction.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La fonction des deux protéines dans la cancérogénèse sera étudiée sur les modèles animaux, en les exprimant dans leur environnement médullaire complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo. Les études mécanistiques seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires humaines exprimant ou non les deux protéines en culture. Nos collaborateurs disposent également de lignées de B-LAL du sous-type CDX2/UBTF. Mais ces lignées ne permettent pas répondre aux questions concernant l’émergence des leucémies dans une moelle saine.

Réduction

Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Comme il s’agit d’études exploratoires, il est difficile de prévoir exactement l’impact des de l’expression des deux protéines étudiées sur la leucémogenèse. Sur la base de notre expérience et de la littérature, et en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, un nombre d’animaux minimum et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été estimé à n=4 à 20 animaux par groupe expérimental en fonction de l’étude. Le nombre d'animaux nécessaire par expérience a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés. Dire seulement qu’une partie du projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (baton, coton et frisure pour faire un nid). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et garantir le bien-être animal en évitant des souffrances inutiles.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un nématode intestinal par gavage et par un Plasmodium responsable du paludisme murin, puis saignées deux fois par semaine par incision de la queue, la croûte de cicatrisation étant retirée à chaque nouveau prélèvement. L'infection détruit leurs globules rouges et provoque une anémie qui culmine autour du quatorzième jour. Le porteur affirme que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier le rôle d’effecteurs immunitaires spécifiques dans la dynamique de l’infection par un nématode intestinal et un Plasmodium murin lorsqu’ils coïnfectent leur hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque le deuxième parasite infecte un hôte préalablement infecté par l’autre espèce (indépendamment de l’ordre avec lequel les deux parasites infectent l’hôte) on constate un rebond de la dynamique de l’infection. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle que joue la réponse immunitaire de l’hôte dans ce rebond.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de l’infection quand les hôtes sont coïnfectés par un nématode intestinal et Plasmodium. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection la dynamique des deux parasites est altérée avec des rebonds qui peuvent affecter la santé de l’hôte. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la réponse immunitaire de l’hôte joue dans ces rebonds et par extension dans le risque encouru par les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des différents groupes expérimentaux): gavage (une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Cependant, l’infection par Plasmodium produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie. Cette anémie est transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection) et après jour 24 les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Le gavage ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animale vigile et sont réalisées en quelques secondes (volume injecté = 100 µl), la nuisance étant donc limitée à cette phase de contention. Les injections intraveineuses sont réalisées à la veine caudale sur animal vigile à l’aide d’un appareil de contention. La nuisance est attendue est donc également liée au stress engendre par la contention. Cependant, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Les prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier prélèvement et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs, ce qui ne devrait pas engendre des nuisances particulières. Les collectes de fèces sont effectuées en isolant les souris. L’isolement peut provoquer du stress, cependant les souris ne sont isolées que pendant 1 heure, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les organes en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de la coïnfection mettant en jeu un nématode intestinal et un Plasmodium murin. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental. Une analyse de puissance montre qu’avec les différences que nous avons observé dans la dynamique de la coïnfection lors d’expériences précédentes, un effectif de 10 souris par groupe confère une puissance de 90% au seuil de significativité de 0.01.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.