Procédures modérées

Pour chercher des marqueurs sanguins précoces de la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats reçoivent huit injections en 25 jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie constitue "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et que les douleurs qu'elle provoque seront mesurées par des tests d'allodynie pouvant durer une heure par animal. Il présente le recours à des stimulations moins intenses comme un raffinement, alors que la douleur reste l'objet même de la mesure. Les résultats seront comparés à une étude menée chez des patients traités par oxaliplatine ou paclitaxel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). Cette neuropathie est une atteinte des nerfs périphériques qui se caractérise par des désordres sensitifs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients. Aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine (un antidépresseur) est recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques. Enfin, le repérage précoce de cette neuropathie est un autre enjeu, car il est admis qu’un repérage précoce des patients permet de limiter la sévérité et les séquelles à de la neuropathie. Le repérage de la neuropathie repose idéalement sur l’association d’un examen médical et d’autoquestionnaires, mais très chronophage en routine. Récemment des marqueurs sanguins, comme le neurofilament light chain, permettrait un diagnostic des neuropathies et des désordres neurologiques. Cependant, selon la littérature scientifique, ce marqueur sanguin n’est pas assez précoce (les modifications de ce marqueurs sanguins apparaissent quand des lésions des nerfs sont déjà bien établies). Enfin et actuellement, aucun marqueur sanguin ne peut être recommandé en routine. Plus récemment, des petits ARN (acide ribonucléique relargué par les cellules) représentent de nouveaux marqueurs d’intérêt, notamment dans le cas de la douleur, et probablement plus précoces. L’objectif de cette étude sera d’explorer les modifications d’expression de ces petits ARN dans le sang d’animaux exposés à des anticancéreux neurotoxiques responsables de neuropathie.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouveaux marqueurs de neurotoxicité chez l'animal. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies induites par les anticancéreux est très limitée, et qu’à défaut un repérage précoce des patients permettrait une meilleure prise en charge de la neuropathie (réduction de dose, arrêt ou switch d'anticancéreux) afin de limiter l'évolution et la sévérité de la neuropathie. Les résultats de ce projet seront confrontés à une étude clinique similaire chez des patients atteints de cancer et exposés à de l'oxaliplatine (cancer colorectal) ou du paclitaxel (cancer bronchopulmonaire). De plus, en identifiant des nouveaux biomarqueurs sanguins communs au rongeur et à l'Homme, ces marqueurs sanguins permettrait d’affiner (« refine ») la qualité des études réalisées chez l'animal, avec un meilleur potentiel de transposition clinique (recherche translationnelle).

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, voie intraveineuse ou intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie sera associée à des douleurs qui seront mesurées dans le cadre de ce projet. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bihebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 4 expérimentations/temps de mesure afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuroapthies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux permettant l'analyse des résultats à l'aide de tests statistiques adéquates. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de trop réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (tests statistiques moins fiables, perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux).

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles douloureux seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant des seuils de douleurs pour des stimuli non douloureux pour un individu sain (on parle d’allodynie). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation douloureuse moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage, dans une salle climatisée (température et hygrométrie controlées) avec un cycle lumière /obscurité 12/12h et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanées tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Nourries douze semaines avec un régime riche en graisses saturées et en sucres, 192 souris subissent trois gavages, trois injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang à la queue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avant d'être toutes tuées. Le porteur décrit des périodes d'isolement en cage, dont deux jours sur une grille de mise à jeun, un jeûne nocturne de douze heures et des contentions de trois minutes dans un tube d'imagerie, gestes qu'il qualifie lui-même de stressants ou anxiogènes. Le surpoids peut gêner leurs déplacements, ce qu'il affirme n'avoir jamais observé après trois mois de régime. Il écarte le remplacement en une phrase, l'étude portant sur plusieurs organes, ce qui rend selon lui le recours au modèle animal "indispensable".

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un excès d’apport énergétique et une élévation de l’inflammation. CD36 est un récepteur membranaire exprimé notamment au niveau intestinal et qui semble contrôler la formation des lipoprotéines synthétisées par l’intestin au cours de la digestion. Ces lipoprotéines véhiculent les lipides alimentaires mais aussi des molécules pro-inflammatoires issues du microbiote intestinal. Dans de précédents projets, nous avons étudié l’impact de régimes hyperlipidiques riches en acides gras insaturés (Isio4) ou saturés (huile de palme). L’objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité induite par un régime de type occidental (riche en graisses et en sucres) aussi appelé Western Diet (WD, 40% acides gras saturés et 30% sucres) car celui-ci représente davantage les habitudes de consommation actuelles. En effet, le CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies associées à un excès de lipides. Pour ce faire nous utiliserons des souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau des cellules intestinales responsables de l’absorption des lipides alimentaires, comparées à des souris contrôles. 96 souris contrôles et 96 souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau intestinal seront nourries soit avec un régime standard (STD), soit avec un régime occidental type Western Diet (WD) durant 12 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Afin d’étudier les variations liées au sexe (comme par exemple le niveau de lipémie postprandiale), l’intégralité de ce projet sera réalisée sur des groupes constitués de 50% de mâles et 50% de femelles. 192 animaux au total seront donc utilisés.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1) Le CD36 intestinal modifie-t-il la dépense énergétique en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 2) Le CD36 intestinal modifie-t-il les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et l’adaptation intestinale à un régime riche en acides gras saturés ? 3) Le CD36 intestinal modifie-t-il l’inflammation et l’écologie du microbiote en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 4) Le CD36 intestinal modifie-t-il l’effet obésogène de l’excès de lipides alimentaires saturés ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaires.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène de type Western Diet) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 pesées sur 12 semaines de régime), ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 0, 2, 4 et 12 (4 mesures par souris au cours du régime). La procédure 1 est appliquée à la moitié de l’effectif pour laquelle des mesures de prise alimentaire et de récolte des fécès dans la cage seront réalisées, en semaines 0 et 11 : 5 jours d’isolement en cage transparente dont 2 jours sur grille de mise à jeun en inox avec pot en verre comme enrichissement. Trois gavages seront réalisés à 3 semaines d’intervalle minimum (S-2, S6 et S9) : les premiers avec du glucose et le troisième avec de l’huile. Le gavage est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé. Trois injections intrapéritonéales seront réalisées à 2 semaines d’intervalle minimum (S-1, S7 et S9) : les premières avec de l’insuline et la troisième avec du tyloxapol). L’injection intrapéritonéale est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé. Des prélèvements sanguins au niveau caudal par simple pression après une légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -1, -2, 6, 7 et 9 (environ 1min par souris par prélèvement). La procédure 2 est appliquée à l’autre moitié de l’effectif où une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 7. Cette mesure est indolore et non invasive et s’effectue dans des cages spécifiques de mesure. Elle nécessite 5 jours d’isolement (3 jours d’habituation et 2 jours de mesure). Une injection intrapéritonéale et un gavage à l’huile seront réalisés une seule fois en semaine 4. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront réalisés en semaines 0 et 4.. A l’issue du régime en semaine 12, l’ensemble de l’effectif sera utilisé pour un dernier gavage à l’huile (le gavage est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé) et prélèvement sanguin sous anesthésie générale, puis sera euthanasié pour réaliser des prélèvements d’organes.

Impact sur les animaux

Les animaux en régime WD peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’est jamais observé après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris lors de la prise alimentaire et lors des CLAMS, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux La mise sur grille de mise à jeun pendant la période de prise alimentaire peut être gênante pour les souris mais un pot en verre leur permet de se reposer sur une surface plane. Les CLAMS (comprehensive laboratory animal monitoring system) nécessitent de placer les souris dans des cages de mesure spécifiques ce qui peut s’avérer anxiogène. Les OGTT (test de tolérance orale au glucose), ITT (test de tolérance à l’insuline) et étude de l’hypertriglycéridémie post gavage nécessitent des mises à jeun de respectivement (4h, 4h et 12h). Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact. La mise à jeun nécessaire de 12h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. L’OGTT et l’étude de l’hypertriglycéridémie post prandiale nécessitent une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides. • Les 2 procédures se clôturent par un test de charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre le nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale (application au bout de la queue pour les prélèvements sanguins à la queue), soit sous anesthésie générale (pour le prélèvement sanguin intracardiaque, , par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours, prise de poids pouvant gêner la locomotion). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie sous anesthésie générale). Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées.Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

Traitées 21 jours par deux médicaments anticancéreux, avec sept injections intrapéritonéales et une administration orale un jour sur deux, 96 souris mâles seront toutes tuées pour prélever leurs organes reproducteurs, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la toxicité peut provoquer une perte de poids et une inactivité, et que l'administration orale peut entraîner des fausses routes, les animaux perdant 15 % de leur poids étant retirés du projet et tués. Le projet vise à décrire l'effet de ces médicaments sur la production de spermatozoïdes, à partir d'une hypothèse sur l'augmentation des mutations. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que la spermatogenèse est trop complexe pour un système in vitro.

Objectifs

Dans ce projet, nous examinerons les effets de 2 médicaments anticancéreux sur la différenciation de cellules sexuelles mâles (spermatogenèse). Nous visons à révéler comment les médicaments anticancéreux affectent la division cellulaire et aussi comment ils affectent la réparation de l'ADN. Nous étudions les médicaments qui ont reçu beaucoup d'attention en raison de leur efficacité dans le traitement du cancer, mais les mécanismes de leur action sur la spermatogenèse normale ne sont pas bien compris. Nous émettons l'hypothèse que les perturbations des mécanismes épigénétiques (qui modifient l'expression des gènes sans altérer la séquence génétique) conduiront à une augmentation des mutations. L'objectif de ce projet est de révéler l'impact des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale afin de développer de meilleures stratégies pour les thérapies anticancéreuses. Nous identifierons également les cibles potentielles affectées par ces médicaments.

Procédures

Les animaux seront traités avec 2 médicaments , séparément, pendant 21 jours. L'administration de la première molécule se fait par injection intra-péritonéale (durée de l'injection : 30 secondes) à la fréquence d'un jour sur 3 (au total 7 injections). le traitement au second médicament se fera par administration orale (durée de l'administration: 30 secondes), à la fréquence d'un jour sur 2, pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale et la toxicité du médicament 1 pourrait avoir des effets indésirables, tels que la douleur et le stress. Nous avons réduit le nombre d'injections, de sorte que les souris ne recevront que 7 injections au total. L'administration orale du second médicament pourraient induire des effets négatifs tels que des fausses-routes. La toxicité de la deuxiéme molécule pourrait induire une perte de poids, une inactivité. Des points limites adaptés sont mis en place.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet: les organes reproducteurs seront prélevés pour les analyses moléculaires.

Remplacement

Le modèle de la souris est couramment utilisé dans les études sur la méiose. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire, ce qui n'est possible qu'in vivo.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant un nombre minimal de souris pour garantir des résultats statistiquement significatifs. La méthode d'injection du premier médicament chez l'animal nécessite 12 animaux par lot (traités et contrôles), en raison du risque d'effets indésirables, liés à sa toxicité. Pour l'exposition au second médicament, nous utiliserons deux groupes de 12 souris ( traités et contrôles), ce qui est suffisant pour les tests statistiques, car les souris consanguines donnent des résultats plus homogènes. Nous prévoyons de répéter une fois l'expérience.

Raffinement

Les composés seront administrés par des personnes formées et compétentes dans cette procédure technique. Les souris ne seront traitées qu'un jour sur deux, ou un jour sur trois ,pendant 21 jours, ce qui permettra de réduire le stress dû à l'administration. Application des points limites : perte de poids maximale de 15% (comparaison avec le groupe contrôle), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lots de 4. Si l'animal montre des signes de souffrance (selon notre grille de suivi des points limites) le traitement sera interrompu et l'animal sera euthanasié. Normalement, les doses de médicament sont faibles (15 fois inférieur à la dose maximale) et les souris la tolèrent bien. Si le traitement provoque des effets limités tels qu'une perte de poids corporel, une réduction des activités et que l'animal montre des signes de souffrance, le traitement sera interrompu.

Choix des espèces

Nous utiliserons une souche de souris pour laquelle de nombreuses données publiques sont disponibles. Nous utiliserons le mâle adulte parce que la méiose est bien établie chez le mâle adulte et que les souris sont sexuellement matures pour produire des gamètes. Le modèle souris est l'un des meilleurs pour étudier la méiose et la recombinaison homologue parce que le mécanisme est très conservé entre l'homme et la souris. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes.

Pour reproduire l'endométriose chez la souris, 1 287 individus sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux. Des cellules endométriales injectées dans la cavité péritonéale forment des lésions sur la vessie, l'intestin et le tissu adipeux, puis les souris reçoivent jusqu'à 46 gavages et subissent des tests de douleur par pression sur les pattes et sur l'abdomen, ainsi qu'un labyrinthe en croix pour mesurer le stress. Le porteur s'appuie sur la littérature pour affirmer que le modèle produit des lésions chez 100 % des souris injectées et une sensibilité accrue à la douleur sans perte de poids. Les thérapies annoncées pour les patientes, à base de composés bactériens, restent renvoyées à des développements ultérieurs.

Objectifs

L’endométriose est une pathologie qui touche environ 10% des femmes et qui est définie par la présence de tissu endométrial à l’extérieur de la cavité utérine. Les mécanismes à l'origine de l’endométriose sont encore largement débattus. Parmi les nombreux symptômes associés à l’endométriose, on retrouve des douleurs pelviennes pendant les menstruations, des douleurs pelviennes et/ou abdominales chroniques, des troubles du transit gastro-intestinal, ainsi que l’anxiété et la dépression. L’endométriose est une maladie chronique, multi-organique, hormonale et inflammatoire dont le traitement reste largement symptomatique, avec la chirurgie en dernier recours. Par conséquent, la compréhension des symptômes et des mécanismes devrait fournir une base pour développer des approches thérapeutiques. Dans ce contexte, le microbiote intestinal et urogénital peut contribuer à des symptômes tels que la douleur et la sensibilisation. En effet, Le dialogue entre le microbiote et les organes est régulé par des composés dérivés de bactéries agissant au niveau de la barrière épithéliale intestinale. Par conséquent, notre projet vise 1) à déterminer si l’induction de lésions d’endométriose chez la souris entraine l’apparition de symptômes identiques à ceux des femmes atteintes d’endométriose, 2) Rechercher des signatures du microbiote intestinal et urogénital associées aux dysfonctionnements intestin-vessie-cerveau au cours de l’endométriose, 3) à identifier la contribution du microbiote intestinal dans ces dysfonctionnements, et 4) tester des composés bactériens pour leurs effets thérapeutiques potentiels.

Bénéfices attendus

L’endométriose représente un problème de santé majeur pour la santé des femmes avec un impact profond sur leur qualité de vie. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de la maladie et en particulier identifier le microbiote intestinal et /ou le microbiote urogénital comme un acteur clé dans les symptômes associés à l’endométriose. Il vise également à proposer des thérapies innovantes basées sur l’utilisation de composés dérivés de bactéries pour améliorer la santé des patientes et traiter cette maladie inflammatoire chronique multi-organes.

Procédures

1 groupe de souris sera soumis à une injection d’estradiol en sous-cutanée et ce geste durera 10 sec. Le métabolite bactérien selon sa stabilité et sa solubilité pourra être administré soit dans l’eau de boisson, soit par gavage quotidien sur animal en contention douce à l’aide d’une sonde de gavage pour rongeurs. Dans le second cas, cela représente 46 gavages du métabolite ou bien de la solution utilisée pour solubiliser le métabolite sur la durée totale de l’expérience et chaque gavage durera moins de 15 sec. Lors des 4 séances d’explorations in vivo nous réaliserons : 1- Une étude de comportement composée de plusieurs tests. le comportement exploratoire des animaux durera 10 min par animal et sera monitoré par une caméra (Pas de contention, pas d’inconfort). Pour l'évaluation du stress, la souris sera positionnée 5 min dans le labyrinthe en croix et son activité sera monitorée par une caméra (Pas de contention, pas d’inconfort). Pour l'évaluation de la douleur, les souris subiront une pression sur les pattes et chaque pression durera 10 sec max. Les souris pourront avoir jusqu’à 3 pressions/test. La même chose sera effectuée sur l’abdomen et les souris subiront 3 pressions de 10 sec chacune. 2- Une exploration des fonctions digestives, pour cela les souris seront gavées (contention+gavage moins de 15 sec) puis 2h après, elles seront à nouveau manipulées avec anesthésie locale (max 30 sec). Les animaux seront ensuite positionnés en cage individuelle pendant 2h supplémentaires.

Impact sur les animaux

Ce modèle murin mime l’endométriose qui peut toucher la femme. Les cellules de l’endomètre injectées dans la cavité péritonéale vont se fixer sur diférents organes (vessie, tissu adipeux, intestin…) et produire des lésions caractéristiques de la maladie. La littérature décrit une sensbilité accrue à la douleur mais pas de perte de poids. Stress et douleur peuvent également être générés par les différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux)

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour divers analyses

Remplacement

L’endométriose est une maladie qui va toucher l’ensemble des organes présents dans la sphère péritonéale. Les lésions provoquées par cette pathologie induisent chez la femme des douleurs, des altérations du fonctionnement des organes pelviens et impacte la qualité de vie. Notre objectif est de mettre en place un modèle murin d’étude de cette maladie afin de caractériser les altérations digestives, la sensibilité à la douleur et les troubles du comportement associés. Cette pathologie met en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinale, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interactions et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Des études réalisées au laboratoire sur des selles de patientes ont permis d’identifier des métabolites bactériens et des vésicules extracellulaires issus du microbiote et potentiellement impliqués dans l’apparition et l’agravation de la maladie. Des expériences de motricité réalisées ex vivo sur des segments d’intestins ont permis d’identifier et sélectionner seulement les métabolites et les vésicules extracellulaires présentant les effets les plus grands. Cette préselection permet de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir des résultats fiables et pertinents. Enfin, ce modèle est décrit dans plusieurs publications comme présentant des lésions de type endométriose dans 100% des souris ayant été injectées avec des cellules endométriales par voie intra-péritonéale.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Les animaux seront réceptionnés 15 jours avant le début des expérimentations afin de réaliser une période d’acclimatation pour les animaux. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place et décrits dans chacune d’elle.

Choix des espèces

Apres une recherche bibliographique sur les modèles murins d’endométriose, le modèle d’injection de cellules endométriales chez la souris est apparu comme le plus pertinent pour notre projet. En effet, d’après la littérature, 100% des souris injectées présentent des lésions qui apparaissent dès le 10 ème jour. De plus, le modèle souris est utilisé dans de nombreux projets au laboratoire. Notre unité possède ainsi une expertise reconnue pour l’étude des fonctions digestives et l’étude du comportement chez la souris. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines. Cet âge correspond à de jeunes adultes et c’est à cette période que cette maladie se déclare chez la femme.

16 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées pour prélever leurs organes, à l'exception de celles dont la tumeur régresse complètement et qui pourront être inoculées une seconde fois. Elles reçoivent des cellules cancéreuses humaines par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique ou intra-mammaire, puis des injections de composés jusqu'à quotidiennes, sur des protocoles pouvant durer cent jours. Le porteur indique que la greffe de cellules immunitaires humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, et qu'un surdosage peut provoquer un orage cytokinique avec atteintes du pelage, plaies et perte de poids. Il qualifie d'"indispensables" les données produites pour faire progresser des candidats médicaments vers les dossiers réglementaires, à raison d'une cinquantaine d'études par an.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place les études et modèles permettant d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires. Le projet se décompose en plusieurs programmes de recherche chacun ciblant un aspect de la fonction du système immunitaire associé à une pathologie donnée pour atteindre un but clinique. 3 grands axes sont utilisés dans ce projet : 1- Evaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’une molécule modulant la réponse immunitaire (environ 15 études par an) 2- Evaluation de l’efficacité d’une molécule sur la réponse immunitaire humaine chez le rongeur pour le contrôle de croissance de tumeur humaine (xénogreffe) (environ 20 études par an) 3- Vaccination visant à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice anti-tumorale (environ 15 études par an).

Bénéfices attendus

En recherche préclinique, les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie (PK/PD) permettent de démontrer le lien direct entre la présence de la molécule d’intérêt dans le tissu et son activité in situ. Le but est de s’assurer qu’après traitement, les expositions de la molécule d’intérêt dans un ou plusieurs compartiments (sang, organes) sont associées à une activité du composé sur sa cible. De plus, certains de ces paramètres de pharmacodynamie mesurés chez l’animal peuvent devenir des biomarqueurs d’activité en clinique chez les patients. Ces modèles sont reconnus comme étant très prédictifs de l’efficacité de composés et permettent de rapidement écarter et abandonner des composés avant de mettre en œuvre un nombre important d’études d’efficacité nécessitant beaucoup d’animaux. Les immunothérapies sont de plus en plus nombreuses en cliniques et leur qualité est de plus en plus raffinées. Les composés développés aujourd’hui visent de plus en plus à être spécifique de protéines humaines et n’interagissant pas avec les protéines de souris. De plus, certains mécanismes immunologiques ne sont pas reproductibles de la souris à l’homme et inversement. Le développement de souris présentant un système immunitaire partiellement humain permet une évaluation pré-clinique plus précise des composés et une meilleure anticipation de possible effets secondaires dû à une sur activation du système immunitaire (orage cytokinique). L’évaluation de l’immunogénicité sur animaux est l’une des méthodes décrites pour démontrer l’efficacité préclinique des candidats vaccins avant d’envisager des études cliniques chez l’homme. Ces tests d’immunogénicité sont également très utiles pour mettre en place des tests libératoires des lots de vaccins pour leur utilisation en clinique humaine (libération des lots et suivi de la stabilité au cours du temps). Les essais d’immunogénicité permettent d’évaluer le bénéfice de différentes préparations vaccinales, d’identifier les composés nécessaires à la formulation vaccinale, d’évaluer les nouvelles voies d’administration, de nouvelles molécules adjuvantes ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin. Enfin, les mécanismes d’action et la caractérisation de la réponse immunitaire doivent être évalués pour comprendre la réponse immunitaire, voire, l’améliorer.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois, 1min) sur animal vigile • Rasage (1 fois, 2min) sur animal vigile • Injection des cellules cancéreuses (1 fois) intra-péritonéale (20s) sur animal vigile ou par voie sous-cutanée (30s), intra-dermique(30s), intra-mammaire (30s), intra-veineuse au niveau de la veine caudale (30s), sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux • Injection de composés, unique ou répétées plusieurs fois (de quotidienne à 1 fois par semaine) sur animaux vigile par voie intra-péritonéale (10s), intra-musculaire (30s) ou Per Os (30s) ou intra-veineuse (30s) à la veine caudale. L’inoculation peut être faite sur animaux anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intra-veineuse à la veine caudale (30s), sous-cutanée (30s) ou intra-dermique (30s). • Pesée (3 fois par semaines) sur animal vigile (1min) • Mesure de la croissance tumorale sur animal vigile (3 fois par semaine) (2min) • Prise de sang (unique à hebdomadaire) à la veine sub-mendibulaire ou la veine caudale sur animaux anesthésie par anesthésie gazeuse (30s). Au total, la procédure 1 dure maximum 72h ;la procédure 2 dure maximum 100 jours. la procédure 3 :8 semaines à 6 mois selon les protocoles.

Impact sur les animaux

L’injection de composés modulant le système immunitaire peut conduire, si utilisé à des doses trop fortes à des effets secondaires indésirables tels qu’une activation excessive des cellules immunitaires conduisant à la libération de cytokines pro-inflammatoires trop forte. Ceci se traduira par des signes cliniques chez la souris tels que atteintes du pelage, perte de poids, apparition de plaies sur la peau. Afin de palier à ces effets, les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal. L’injection de cellules immunitaires humaines dans une souris peut conduire au développement d’une maladie du greffon contre l’hôte qui peut apparaitre dans les 70 à 100 jours après la greffe. Celle-ci se manifeste par des signes cliniques tels que la perte de poids, une apathie, une inattention au pelage. Les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal.. Une réponse immunitaire forte contre une protéine antigénique nécessite que l’antigène soit injecté de façon concomitante avec des adjuvants ; l'adjuvant est par définition une substance qui permet d'augmenter l'immunogénicité d'une protéine qui lui est associée ; les adjuvants choisis sont approuvés en clinique humaine pour leurs effets mineurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Seuls les animaux qui présenteraient une régression complète de la tumeur pourraient être inoculés de nouveau avec la même lignée de cellules tumorale ou une lignée différente dans le cadre d’une utilisation continue pour évaluer la réponse immunitaire mémoire.

Remplacement

Des essais in vitro sur cellules animales et humaines permettent de réaliser une pré-sélection de composés candidats mais ne sont à ce jour pas suffisants pour comprendre leurs mécanismes d’actions. Les tests in vivo sont donc nécessaires et vont également permettre d’évaluer l’efficacité des composés sur l’élimination des cellules tumorales et cellules infectés. De plus, nombres de pathologies comme les cancers impliquent de nombreux tissus et organes dont les voies biologiques sous-jacentes sont encore très peu connues et ne peuvent donc être mimées de façon fiable dans les modèles in vitro. Seul un modèle chez l’animal peut reproduire les interactions entre les différents systèmes biologiques complexes lors de l’évaluation de l’efficacité de composés à tester.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera basé sur des études similaires rapportées par la littérature. Des analyses de puissance statistique seront utilisées sur les données préliminaires pour déterminer si le nombre d’animaux par groupe puisse encore être réduit

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Ils seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse de courte durée. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de l’étude. Des consignes seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous autorité du vétérinaire ou euthanasiés selon les critères définis dans la consigne.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de tumeurs chez la souris (présentant un système immunitaire murin ou humain) existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car son système immunitaire est bien caractérisé. Les études peuvent être réalisées sur des souris immunocompétente avec système immunitaire murin, ou système immunitaire humains et les résultats peuvent être comparés à de souris immunodéficientes permettant de bien comprendre le rôle du système immunitaire. La souris est aussi un modèle pour lequel il existe de nombreux outils adaptés (cytokine, marqueurs cellulaires…). Les souris sont utilisées au stade adulte pour pour avoir un systémè immunitaire développé.

Toutes tuées à l'issue, 264 souris femelles subissent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire et un prélèvement sanguin rétro-orbital, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la tumeur peut gêner leur mobilité lorsqu'elle atteint sa taille maximale. Les tumeurs sont collectées pour analyse et les organes des souris qui n'en développent pas alimenteront une banque de tissus. L'objet du projet reste de valider dans un organisme entier des gènes déjà identifiés sur cellules, le porteur jugeant cette vérification "nécessaire" avant d'envisager des traitements préventifs du cancer du sein.

Objectifs

Le vieillissement est un processus physiologique. En effet après un certain nombre de divisions les cellules arrêtent de proliférer, on parle alors de sénescence. Les cellules sénescentes sont alors éliminées par l’organisme. Depuis de nombreuses années maintenant un processus de sénescence accélérée, sous l’impact de différents stimuli dont le stress oncogénique (expressions anormales de gènes retrouvées dans de nombreux cancer) a été décrit. Si la sénescence est aigüe, sporadique elle a un effet bénéfique en participant à l’élimination de cellules qui ne peuvent plus remplir leur fonction correctement. On parle alors de mécanisme de sauvegarde. Toutefois il arrive également que dans ces cellules une seconde modification empêche l’élimination de cette cellule sénescente qui redevient alors active, se multiplie et peut alors être à l’origine de l’initiation tumorale. C’est dans ce contexte qu'il est important de découvrir des gènes qui permettent l’échappement à la sénescence induite par le stress oncogénique pour ensuite étudier leur implication dans l’initiation tumorale. Le but étant de mettre en évidence de potentielles cibles afin de pouvoir proposer soit des traitements préventifs contre l’initiation tumorale soit des traitements potentiellement curatifs. Les gènes identifiés sont soumis à une série de tests sur cellules pour valider leur implication. L'étape finale de validation de l'implication de ces gènes dans l'initiation et la croissance tumorale passe par l'utilisation d'un modèle animal complexe comme la souris.

Bénéfices attendus

L’un des axes de lutte contre le cancer est d’empêcher l’initiation tumorale par des traitements préventifs chez les sujets à risque. En validant l'implication potentielle de gênes dans l'initiaton tumorale, une des retombées de ce projet sera de pouvoir proposer des cibles thérapeutiques pour un traitement préventif contre le cancer du sein. De plus des études ont montré que ces protéines restent à des niveaux élevés au niveau des tumeurs, c'est pourquoi une autre retombée de ce projet serait de proposer également des traitements curatifs en ciblant ces deux protéines lorsque le cancer est bien établi. Enfin avec ce protocole un nouveau modèle expérimental permettant de tester les solutions thérapeutiques sera alors mis au point. Il permettra également de tester l'implication d'autres gènes dans l'initiation tumorale.

Procédures

Les animaux seront soumis à un seul prélèvement sanguin, réalisé sous anesthésie générale. Le prélèvement durera moins de deux minutes entre l'endormissement de l'animal et la fin du prélèvement . Lors de la greffe des cellules dans la glande mammaire les animaux subiront une chirurgie légère. Pour la chirurgie les animaux seront anesthésiés. L'intervention chirurgicale en elle-même durera au maximum 8 minutes, depuis le maintien de l'anesthésie gazeuse au masque jusqu'à la fin de la suture de l'épiderme avec deux points de suture.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole les animaux subiront un stress lors du prélèvement rétro-orbital, lié à l'anesthésie et au prélèvement lui-même. Ce prélèvement pourra causer de la douleur. De plus lors de la greffe orthotopique les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui pourra générer du stress. L'incision de la peau et les sutures pourront générer de la douleur. Les deux injections en sous-cutané d'analgésique pourront causer une légère couleur. La greffe de cellules dans la glande mammaire générera potentiellement une gêne. La croissance tumorale au niveau de la glande mammaire pourra entraîner une gêne pour la mobilité de l'animal lorsque la tumeur atteindra sa taille maximale.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Les tumeurs seront collectées pour les analyses mloléculaires. Le sang des animaux sera également prélevé afin d'obtenir du sérum. Les organes des animaux ne présentant pas de tumeurs seront prélevés afin de réaliser une banque de tissu d'animaux d'âge différents.

Remplacement

La recherche de gènes responsables des mécanismes de l'initiation tumorale est importante afin de mieux comprendre l'apparition de la tumeur. Des analyses poussées sur des modèles cellulaires ont pu permettre l'identification de certains de ces gènes. il y a un processus important de validation des résultats in vitro. Reproductibilité des données, tests de transformation en 3D, formation de sphéroïdes en condition de culture non adhérente. Toutefois il est nécessaire pour pouvoir valider les candidats potentiels comme cible thérapeutiques de vérifier si dans un organisme complexe, génétiquement très proche de l’Homme, les cibles se comportent comme attendu par rapport aux observations in vitro.

Réduction

Pour ce protocole le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum. Pour cela une première partie permettra de mettre au point les conditions expérimentales. L'expérimentation sur un modèle sera réalisée en une seule fois afin de minimiser le nombre d'animaux dans les groupes contrôles. Si la mise au point permet de mettre en évidence les conditions expérimentales optimales alors dans une seconde partie l'implication des gènes ciblés dans l'initiation tumorale ainsi que dans la croissance de la tumeur sera étudiée. Sinon le protocole s'arrêtera à la fin de la première partie. Dans la seconde partie des tests moléculaires seront réalisés et la croissance de la tumeur observée. Le nombre d'animaux utilisé dans cette procédure est calculé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte des conditions les plus défavorables (% de prise tumorale dans les groupes attendus). Il s'agit bien d'un nombre maximum d'animaux qui pourra être réduit en fonction des observations réalisées pendant la première partie permettant la mise au point du modèle.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) expérimentateurs de 7 jour(s). Les animaux seront alors pesés une fois par semaine. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier et deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs. Une grille de scoring sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés dans des cages présentant des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l’animal car le génôme de la souris est très proche de celui de l'Homme. De plus de nombreux modèles ont été développés chez la souris. Pour cette étude un modèle de greffe de cellules dans la glande mammaire de la souris sera mis au point avec deux modèles cellulaires différents. Des souris femelles âgées de 8 semaines (jeunes adultes) seront utilisées afin que les glandes mammaires soient mâtures. De plus cette étude portant sur le cancer du sein, dans lequel le contexte hormonal est important, seules des souris femelles seront greffées.

Pour vérifier in vivo des résultats déjà obtenus en culture cellulaire, 280 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Elles reçoivent soit une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, soit une injection dans la veine de la queue, sur animal vigile en contention, pour créer des foyers tumoraux dans les poumons. Le porteur conclut à l'impossibilité de modéliser la réponse immunitaire antitumorale en dehors d'un organisme vivant, et prévoit d'analyser rates et tumeurs sur les mêmes animaux au titre de la réduction. Les seuls effets qu'il retient sont le stress de la manipulation et de la contention, avec la mention que les injections "ne sont pas décrites pour être douloureuses", rien n'étant dit de ce que produit une tumeur pulmonaire chez une souris.

Objectifs

Des résultats contradictoires sur l’effet de certaines cellules immunitaires sur la croissance tumorale reposent sur le fait que 2 types de cellules peuvent être observés : les cellules protumorales et les anti tumorales. Le mécanisme qui contrôle la transformation entre certaines cellules protumorales et anti tumorales reste encore inconnu mais pourrait être un outil majeur dans la lutte contre l’immunosuppression médiée par le cancer. L’élucidation de ce mécanisme pourrait nous aider à trouver des médicaments qui pourraient favoriser in vivo la conversion des cellules pro tumorales en cellules anti tumorales. Au regard de nos expériences précédentes réalisées in vitro montrant un rôle essentiel d’un récepteur aux signaux de danger dans la balance entre pro et anti tumorales, il nous paraît aujourd’hui essentiel de les valider in vivo. En effet, la culture de cellules ne permet pas d’appréhender la complexité des organismes vivants, et d’autant plus lorsqu’il s’agit d’immunité. C’est pourquoi, nous souhaitons poursuivre ce projet par des expériences réalisées chez la souris. L’utilisation de modèles animaux nous permettra de mener à bien ce projet et de répondre aux questions suivantes : Les modifications observées in vitro sont-elles vraies in vivo ? Comment s’effectue leur activité antitumorale ? Le récepteur aux signaux de danger peut-il servir de cible thérapeutique ?

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que NLRP3 (récepteur des signaux de danger ) au sein des cellules immunitaires peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Procédures

Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales. Le geste dure +/- 10 secondes. Dans le modèle de foyers tumoraux pulmonaires les souris recevront les cellules par une injection dans la veine caudale dans un système de contention. La procédure dure 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane. Dans le modèle de foyers tumoraux pulmonaires les souris vigiles recevront les cellules par injections dans la veine caudale, dans un système de contention. Les injections ne sont pas décrites pour être douloureuses. Sur la durée de l’expérience, ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort. Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles sous forme génétiquement modifiée.

15 750 épinoches à trois épines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 14 100 tuées, les 1 650 témoins et leur descendance retournant en salle d'élevage. Les géniteurs sont anesthésiés puis tués pour récupérer spermatozoïdes et oeufs, et les deux générations suivantes sont exposées à des perturbateurs endocriniens de l'oeuf au stade adulte avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur attend une perte de qualité des gamètes, des anomalies du développement, une féminisation du sex-ratio, une baisse des défenses immunitaires, une obésité et des effets négatifs sur la croissance et la survie, tout en indiquant que la nature exacte et la durée de ces effets restent inconnues. Les polluants retenus et les doses ne sont pas encore choisis et le seront "en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet".

Objectifs

L'objectif du projet est de mieux appréhender l'impact d'une exposition aux perturbateurs endocriniens tout au long du cycle de vie de l'épinoche. L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme. Au cours du projet les perturbateurs endocriniens retenus ainsi que les doses environnementales proposées seront à définir en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet.

Bénéfices attendus

L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme et de la population dans son ensemble suite à une exposition à des perturbateurs endocriniens. Les impacts sur la croissance et la survie sont également recherchés.

Procédures

Pour les géniteurs, lors des fécondations in vitro, les mâles sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort (quelques secondes) avant de récupérer les spermatozoïdes. Les femelles sont anesthésiées (moins de 10 min) puis leurs oeufs sont prélevés (moins de 2 min) avant d’être mises à mort (quelques secondes). Concernant la première et la seconde génération, les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation (moins de 1 min) et différents organes sont prélevés. Les poissons adultes exposés sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort avant de prélever les organes (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Est envisagé un effet sur : 1. la reproduction : perte de la qualité des gamètes, anomalies du développement, modification de la distribution mâles /femelles en faveur des femelles ; 2. diminution de la défense immunitaire ; 3. augmentation des réserves de gras (obésité) ; 4. effets négatifs sur la croissance et la survie. La durée et la nature exacte des effets n'est pas encore connue actuellement, les nuisances et effets éventuels seront suivis à l'aide d'une grille d'évaluation des points limites.

Devenir

Les individus de la première génération exposés aux perturbateurs endocriniens et leur descendance seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation (=13350), les individus témoins de la première génération et leur descendance (=1650) seront remis en salle d'élevage. Les poissons issus de l'exposition au stade adulte seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation pour les analyses multi-biomarqueurs (=750).

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation animale pour valider l'importance des perturbateurs endocriniens sur les stades de vie précoces (stade oeuf) et sur la physiologie générale des poissons et leurs capacités de reproduction tout au long de leur cycle de vie.

Réduction

Les premières fécondations in vitro, sont réalisées à partir d'animaux d'élevage. Pour chaque procédure, suite aux expérimentations, des tests statistiques seront effectués. Les 2250 oeufs produits seront exposés (150 organismes par aquarium en triplicats = 450 organismes par condition à raison de 4 doses et 1 témoin) et maintenus jusqu'au stade adulte (1 à 1,5 ans). Les 150 organismes par aquarium et par triplicat sont nécessaires, d'après la littérature pour pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Aux différents temps de prélèvement, 10 individus par condition de l'oeuf aux juvéniles et 10 individu par condition et par sexe chez les adultes sont suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique pour les analyses multibiomarqueurs. Ces organismes seront prélevés sur les 150 organismes par aquarium. Lors de la création de la seconde génération, 750 oeufs seront maintenu jusqu'à 1 mois post fécondation des oeufs. Ce chiffre se base sur les données de la littérature afin de pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Concernant le suivi des organismes pour les marqueurs phénotypiques (croissance, mortalité) de la première (100 individus par condition) et seconde génération (50 individus par condition) et les traits d'histoire de vie chez les adultes (15 individus par condition et par sexe), nous avons évalué l'effectif nécessaire en se basant sur des données de la littérature. Pour l'exposition des adultes (indépendante de la première procédure), nous utiliserons : 150 individus = 15 mâles et 15 femelles par condition à raison de 4 doses et 1 témoin : suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique dans l'analyse des traits d'histoire de vie.

Raffinement

Afin de veiller au bien-être animal, les géniteurs, les juvéniles et les individus adultes bénéficieront d’enrichissements (tubes et plantes artificielles). Les poissons seront maintenus dans un environnement optimale dont les paramètres seront vérifiés a minima une fois par semaine. Les animaux seront nourris tous les jours avec une alimentation diversifiée et appropriée à leur stade de développement (3% du poids/jour). Au niveau expérimental, lors du sacrifice des animaux, les poissons sont placés dans un bain anesthésiant pour réduire le stress puis rapidement mis à mort. Tout au long du projet, les animaux adultes sont observés. Afin de limiter la souffrance animale, la mise à mort par balnéation est effectuée par surdose d’anesthésique. Cette étude servira également de base pour mieux définir des points limites applicables aux autres stades de développement (notamment juvéniles) et pourront être proposés à notre Structure chargée du Bien Etre Animal.

Choix des espèces

L’épinoche à trois-épines est une espèce de poisson largement utilisée pour les études écotoxicologiques et présente des intérêts pour l’étude des contaminations environnementales. D'autre part, l'épinoche est une espèce qui s'adapte à tout type de milieu (eau douce, salée et saumâtre). Dans une optique d'étudier de façon spécifique la gamétogenèse, des expositions au stade embryonnaire semblent pertinentes puisque cette fonction physiologique est mise en place dès le stade embryon. De même pour mieux percevoir les relations avec les traits d'histoire de vie, se baser sur les individus adultes et les stades embryonnaires est pertinente. L'exposition de la première génération sera effectuée uniquement du stade oeuf à 40 jours post éclosion afin d'encadrer les stades précoces de développement et la mise en pace des réponses physiologiques précoces. L'exposition suivante sera effectuée sur les individus adultes pour mieux comprendre le lien entre les modifications physiologiques et les réponses sur les traits d'histoire de vie. Les animaux adultes et juvéniles seront tous maintenus en condition d'élevage classique après l'exposition.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome au flanc droit puis un gavage quotidien pendant deux semaines, soit quatorze gavages, certaines subissant en plus trois injections dans l'abdomen. Le porteur indique que la tumeur pourra les gêner dans leurs déplacements et leur causer de la douleur, et que le gavage peut irriter l'oesophage jusqu'à entraîner des difficultés pour s'alimenter, sa réponse étant de déposer de l'aliment au sol. Il affirme que le recours aux animaux est "nécessaire" parce que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier le système immunitaire, alors que l'efficacité de la molécule a déjà été démontrée sur ces mêmes modèles cellulaires.

Objectifs

Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, une molécule capable resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales ainsi qu'un gavage par jour pendant deux semaines (soit 14 gavages). Certains subiront aussi 3 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement et leur générer de la douleur. Le gavage peut provoquer une irritation de l'oesophage, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur). Enfin, les groupes contrôles étant communs aux 2 procédures, nous allons les réaliser qu'une seule fois.

Raffinement

Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Un analgésique sera utilisé si une souris présente l'un de ces points limites. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. De l'aliment sera mis sur le sol si une souris a des difficultés pour s'alimenter.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.