Procédures modérées

Pour étudier le rôle de l'acide rétinoïque dans la production des spermatozoïdes, 1 050 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre l'âge de quinze et vingt-neuf jours par perfusion d'un fixateur sous anesthésie létale. Les souriceaux subissent une biopsie de queue dès le premier jour de vie, puis des injections de rétinoïdes, d'inhibiteurs de kinases et d'un traceur cellulaire. Trois mâles sur quatre n'ont pas le génotype recherché et sont tués sans qu'aucun prélèvement soit fait sur eux, et le porteur ajoute 25 % d'animaux pour couvrir un risque qu'il qualifie d'"élevé" d'abandon ou de cannibalisme par la mère, provoqué par la manipulation précoce des nouveau-nés. Il conclut que le remplacement par un système in vitro est "impossible".

Objectifs

La spermatogenèse est le processus de formation des gamètes mâles - les spermatozoïdes, à partir des cellules souches appelées spermatogonies. Ce processus se déroule dans les tubes séminifères du testicule. Une étape cruciale de la spermatogenèse est la méiose, qui permet des échanges entre les gènes, contribuant ainsi à la diversité génétique. Selon la littérature, l'acide rétinoïque, le métabolite actif de la vitamine A, est une molécule essentielle qui régule différentes phases de la méiose. L'inactivation d'un ou plusieurs acteurs de la voie de signalisation de l'acide rétinoïque conduit à un blocage de la spermatogenèse, entraînant par conséquent l'infertilité. L’acide rétinoïque peut exercer des effets génomiques, en se liant à ses récepteurs dans le noyau de la cellule, mais il peut également induire des effets non génomiques, en régulant des protéines kinases présentes dans le cytoplasme de la cellule. Dans ce projet nous utilisons des souris mutantes (pour les voies de synthèse de l’acide rétinoïque) présentant un arrêt de la spermatogénèse. Chez ces souris mutantes, on note également une sur-activation de certaines protéines kinases dans le testicule. En employant une approche pharmacologique, nous déclenchons de manière contrôlée et simultanée la différenciation de toutes les spermatogonies puis nous administrons différentes substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque ou inhibitrices de tyrosine kinases, afin d'étudier leur implication dans le processus de la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de ces différentes voies dans la méiose.

Bénéfices attendus

Des études pharmacologiques montrent un blocage de différenciation des spermatogonies chez l’Homme, lorsque la synthèse de l’acide rétinoïque est bloquée. En comprenant comment les voies de signalisation de l'acide rétinoïque et des tyrosines kinases (potentiellement contrôlées par l'acide rétinoïque) agissent sur les spermatogonies et la méiose chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge entre 10 et 12 jours (1 injection pour les rétinoïdes, 3 injections pour les inhibiteurs des kinases) pour sauver les cellules méiotiques de la mort. - Administration d’une molécule traceuse de cellules à l’âge de 10 jours pour suivre l’évolution d’une cellule. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 29 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à deux types cellulaires du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. La taille de l’échantillon de queue ne dépasse pas 0.5mm pour limiter la nuisance engendrée par cette biopsie. L’administration de substances (rétinoïdes, inhibiteurs de kinases, traceur cellulaire, anesthésique ou analgésique) entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.

Devenir

Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (3/4 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse, est un processus complexe qui implique différentes cellules dans les testicules. Les interactions entre ces cellules sont cruciales pour assurer une production constante de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque – métabolite actif de la vitamine A, et des protéines de type tyrosine kinases, qui sont potentiellement régulées par l’acide rétinoïque, dans un contexte physiologique naturel préservant ces interactions cellulaires. Il est donc indispensable qu’une approche expérimentale avec des animaux soit employée pour répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Notre étude se concentre sur la production des spermatozoïdes, donc seulement les mâles (environ la moitié des naissances) participent aux expériences. On identifie et prélève un petit échantillon de queue le plus tôt possible afin de déterminer le type génétique et sélectionner les mâles mutants. La suite de la procédure n’est réalisée que pour les mâles mutants sélectionnés. Ils représentent un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Il sera donc nécessaire de quadrupler l’effectif (quadruple). Le risque d'abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est élevé dû à la manipulation précoce des nouveau-nés. Afin de prendre en considération ces risques, nous prévoyons d’augmenter l’effectif des animaux de 25%. Cependant, dès que le nombre de mâles requis pour un traitement donné sera atteint, les prélèvements pour le lot correspondant seront arrêtés, 25% représentant une valeur limite maximale. Par ailleurs, au cours de notre étude, nous serons à même d’estimer plus finement le pourcentage de risque lié à la manipulation des nouveau-nés, ce qui permettra d’ajuster les effectifs et de réduire au maximum l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Nous comparons et analysons des groupes de mâles mutants traités de différentes manières (7 conditions au total). Nous analysons l’évolution de la méiose - processus de combinaison des gènes maternels et paternels assurant la formation d’une nouvelle cellule qui va se maturer en spermatozoïde. Nous étudions 2 points clé de la méiose et nous analysons aussi son produit final à un stade plus tardif (3 stades). Nous avons besoin de 10 mâles pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses de tissu et 5 pour des analyses moléculaires. Nous utilisons le deuxième testicule de chaque mâle pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés différemment et utilisés pour deux voire trois types d’analyses, ce qui répond parfaitement à une réduction du nombre d’animaux en accord avec le 2e R de la règle des 3R.

Raffinement

Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance de leur état de santé et des soins appropriés (analgésie) est assurée si nécessaire. En cas de souffrance ou d’altération du comportement des animaux, des mesures correctives nécessaires sont prises rapidement en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli et les cellules germinales du testicule (Ser-/- ; Germ-/-), ce qui n’induit aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité des mâles. Ce génotype d’intérêt concerne un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Les procédures expérimentales commencent par l’identification des mâles suivie de la biopsie de queue en vue du génotypage. Ces procédures sont conduites au stade P0-3, précédant l'administration du Médicament1 afin de permettre une sélection ciblée visant à traiter exclusivement les animaux mutants d’intérêt. Les procédures expérimentales sont conduites de façon à diminuer le stress de l’animal. Ainsi, dans le cadre de la Procédure 1, les injections des molécules destinées à être administrées le même jour (rétinoïdes et traceur) sont espacées d’un intervalle de 8 heures. Pour assurer le bien-être des nouveaux-nés, des nids sont aménagés dans les cages, offrant ainsi un environnement chaleureux et sécurisé pour les souriceaux. Afin de garantir leur confort, les animaux sont maintenus en groupe avec leur mère jusqu'au moment de l'euthanasie. Ainsi, l'intégration totale du raffinement, conformément au principe du 3e "R" de la règle des 3R, est une caractéristique fondamentale de notre approche expérimentale.

Choix des espèces

La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court, génome connu, outils moléculaires). Par ailleurs, la souris partage 99% d'identité génétique avec l'homme, et les mécanismes de la spermatogenèse sont conservés chez les deux espèces. Nous induisons la différenciation de toutes les spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1 : acide rétinoïque) à l’âge de 4 jours (P4). Cet âge a été sélectionné afin de correspondre au mieux à la période habituelle de différenciation des spermatogonies chez les souris sauvages, permettant ainsi une comparaison pertinente. Cependant, chez les mutants synchronisés, la méiose ne se finalise pas et les cellules meurent de par l’absence d’acide rétinoïque ou d’une dérégulation des voies qu’il contrôle en aval. Le traitement avec le Médicament2 vise à préserver les cellules méiotiques de la mort. Pour les rétinoïdes, nous envisageons une seule injection à P10 (Médicament1+6 jours). Cet âge a été choisi en raison de l'émergence des premières cellules méiotiques productrices d'acide rétinoïque chez les souris synchronisées, correspondant ainsi à la période propice. En revanche, pour les inhibiteurs des kinases, nous prévoyons une injection quotidienne entre P10 et P12 (Médicament1 + 6 à 8 jours). Cette fréquence de traitement a été délibérément choisie pour garantir une inhibition constante des kinases juste après la période de production d’acide rétinoïque. La méiose dure environ 15 jours chez la souris. Nous analysons l'évolution de la méiose à deux points clé (à P15 et à P19) et nous analysons aussi son produit final (à P29).

Opérées du crâne pendant 45 minutes pour recevoir dans le cervelet un vecteur qui y fait sécréter une molécule inflammatoire, 59 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq injections abdominales d'une molécule supprimant les cellules régulatrices de l'immunité, un prélèvement de sang dans le sinus de l'œil, puis une injection cardiaque de fixateur sous anesthésie profonde sans réveil. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant le point limite pourrait survenir si cette molécule se révèle toxique, et qu'un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient apparaître si l'inflammation se disséminait dans le cerveau. Les tests de motricité sont précisés, avec traversée sur barre, cage refuge et récompense en fin de test, et le porteur conclut qu'un modèle animal est "indispensable" faute d'échantillons de patientes en nombre suffisant.

Objectifs

La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.

Procédures

Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.

Impact sur les animaux

-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.

Remplacement

La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.

Réduction

Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.

Raffinement

-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.

Choix des espèces

La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau, puis jusqu'à quatre injections hebdomadaires d'un composé bactérien immunostimulant encapsulé, avec des mesures de tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique une gêne à la locomotion et des nuisances possibles quand le volume de la tumeur atteint le point limite, ainsi qu'un risque d'infection pour les souris génétiquement modifiées. Il affirme que la diffusion du composé et la réponse immunitaire qu'il déclenche imposent de travailler sur un "organisme entier", après une validation préalable in vitro.

Objectifs

Le rôle du système immunitaire dans l'évolution des cancers est indéniable. Ces dernières années, des avancées significatives ont été réalisées dans le traitement des patients grâce à de nouvelles immunothérapies qui modulent le système immunitaire. Une molécule présente dans les bactéries a été identifiée comme particulièrement efficace pour stimuler le système immunitaire. Cependant, en dépit de ses bienfaits, sa toxicité a empêché son utilisation clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. Il a été décrit que le composé activait deux voies différentes pour stimuler l’immunité, ayant différentes finalités lorsqu’elles sont activées. Ainsi, le but de cette étude serait de mettre en évidence l’efficacité du composé encapsulé seul, ou en combinaison avec un anticorps thérapeutique utilisé en clinique, lorsque l’une de ces voies est entravée. Cela pourrait également permettre de discerner 1) si l’efficacité antitumorale est liée à l’une ou l’autre des deux voies, et 2) si une des deux voies est privilégiée par le composé encapsulé. Également, cette étude pourrait caractériser si des mécanismes alternatifs sont mis en place pour compenser ces entraves.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes d’action du composé immunostimulant encapsulé, en monothérapie ou en combinaison, à savoir 1) les voies activées par le composé, 2) si le composé est toujours efficace malgré les inactivations, 3) si des mécanismes alternatifs sont mis en place lorsqu’un élément de ces voies n’est plus fonctionnel.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection du composé testé dans la veine de la queue et/ou 1 injection en intra-péritonéale /semaine - durée < 5 minutes. - Mesures de volumes tumoraux 3x/semaine- durée < 1 minute Pour les souris non génétiquement modifiées : 3 injections en intra-péritonéale sous anesthésie - durée < 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour toutes les souris (génétiquement modifiées ou non) Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes). Douleur lors d’injection : - Pour toutes les souris : lors de l’implantation des cellules tumorales (durée de quelques minutes, une fois), et lors de l’injection du/des traitement(s) (durée de quelques minutes, maximum 4 fois, chaque semaine). - Pour les souris non génétiquement modifiées : lors de l’injection du réactif entravant les voies activées par le composé encapsulé (durée < 1 minute, 3 fois). Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec le modèle tumoral utilisé. Risque d’infection pour les souris génétiquement modifiées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la présence de cellules tumorales

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activées par le composé, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences dans les mêmes conditions de traitement et de contrôles avec des souris non génétiquement modifiées, nous avons pu déterminer grâce à un logiciel statistique le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Pour les souris génétiquement modifiées, celles-ci seront manipulées stérilement pour éviter les infections. Une double paire de gant ainsi que des manchettes seront utilisées, et changées entre chaque cage manipulée pour éviter la transmission de germes. Les maisons, tunnels, nids de cotons et paillage, l’alimentation et la litière sont stérilisés. L’eau, distribuée via des poches à usage unique, est filtrée et stérilisée. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. Nous prévoyons d’utiliser des souris mâles et femelles afin de s’affranchir des biais et des différences d’effet du traitement qui pourraient être liés au sexe. Le modèle de souris immunocompétent va permettre d’étudier l’efficacité du composé immunostimulant dans des cancers induits chez les souris puisque la réponse immunitaire complète y est représentée. Les souris génétiquement modifiées choisies sont commercialisées et bien décrites dans de nombreuses publications scientifiques. Elles vont permettre de répondre aux problématiques posées de par leur particularité, en rapport avec les mécanismes et réponses ciblés par le composé immunostimulant. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 6 à 12 semaines en fonction des lignées. En effet, il s’agit parfois de petites colonies d’animaux et le fournisseur ne peut garantir l’âge exact des animaux. Cette tranche d’âge permet néanmoins aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale.

Pour étudier des combinaisons de radiothérapie, d'immunothérapie et d'un modulateur de la matrice tumorale, 2 696 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ou dans le gras mammaire, des mesures de tumeur au pied à coulisse, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ouverture du thorax suivie de trois heures et demie d'imagerie sans réveil. Le porteur indique que la croissance tumorale dégrade la condition physique, provoque des douleurs et peut entraîner la mort, et que l'anesthésie prolongée peut causer une détresse respiratoire jusqu'à l'arrêt cardio-respiratoire. Il reconnaît que le remplacement est "la notion la plus limitante" du projet, tout en concluant que l'utilisation d'animaux non-humains est "nécessaire".

Objectifs

Notre programme de travail repose sur l’observation fondamentale que deux populations du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations immunitaires sont nécessaires pour comprendre comment elles interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. Les objectifs du projet sont ici de caractériser les effets combinatoires de la radiothérapie avec une immunothérapie qui stimule l'activité d’une de ces deux populations ou une pharmacothérapie qui perturbe la structure de soutien entourant les cellules tumorale pour faciliter l'activité anti-tumorale qui est, dans la plupart des cas, empêchée par l'interaction entre les deux populations immunitaires.

Bénéfices attendus

Les thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie) sont utilisées depuis les débuts de l'identification de la pathologie cancéreuse. Elles ont considérablement augmenté en qualité, plus précises, plus variées et l'émergence des immunothérapies a suscité un nouvel espoir pour les cancers incurables. Cependant dans encore trop de cas, ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et entrainent des effets secondaires très lourds. En effet les cancers répondent très rapidement à ces thérapies et développent des résistances. Ce projet de recherche vise à mettre en lumière les mécanismes par lesquels les cellules du système immunitaire participent à la croissance tumorale et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. Cette compréhension permettra dans un premier temps de tester efficacement des nouvelles combinaisons de thérapies anti-cancéreuses afin d'améliorer leur efficacité mais aussi de réduire les effets secondaires chez le patient. Nous pensons également qu'il permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces cancers.

Procédures

Dans le cadre de notre étude, nous effectuons plusieurs procédures pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements. Tout d’abord, nous réalisons des biopsies de tissus pour l’identification génétique, en utilisant une méthode rapide et peu invasive. Ces biopsies sont issues de l’extrémité de la queue de l’animal ou d’une goutte de sang prélevée par poinçon à la joue. Le processus dure environ une minute sur animal vigile. Ensuite, nous procédons aux injections de lignées tumorales. Pour cela, nous avons deux options : une injection au niveau de la veine caudale sur l’animal vigile, ou une injection dans le gras mammaire sur animal anesthésié. Cette étape prend environ deux minutes. Pour surveiller la croissance tumorale, nous utilisons une technique d’imagerie sur animal anesthésié (environ dix minutes) ou mesurons directement la masse tumorale à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile (cinq minutes pour cinq souris). Nous administrons également des traitements cellulaires par injection, avec deux injections par animal sur deux jours consécutifs, chacune prenant environ une minute. Enfin, nous réalisons des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pendant quatre heures accompagnée d'un traitement analgésique par injection (1min) pour l’imagerie, impliquant une chirurgie de trente minutes suivie d’une imagerie de trois heures et demie. Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour procéder aux prélèvements des tissus et analyses. Ces étapes sont essentielles pour notre recherche sur les tumeurs et les thérapies associées.

Impact sur les animaux

Dans un premier temps, les animaux subiront très tôt une biopsie de l’extrémité de la queue et/ou un prélèvement de sang (une goutte) pour identification génétique. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les effets indésirables les plus lourds pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement dus à la croissance tumorale. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs entraînant une dégradation de la condition physique, des douleurs et pouvant provoquer la mort. Aussi, la procédure d’imagerie peut engendrer des effets indésirables de par l’utilisation prolongée d’anesthésique pouvant provoquer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire pouvant conduire à un arrêt cardio-respiratoire. La thoracotomie est également une chirurgie lourde même si celle-ci sera sans réveil. Dans une moindre mesure, les anesthésies répétées des animaux pour le suivi de croissance tumorale par imagerie ou pour la radiothérapie ainsi que les injections de solutions contenant les traitements peuvent également être une source de stress pour l'animal et provoquer des douleurs de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure. Dans la majorité des cas il n'est pas attendu de rejet tumoral complet ainsi les animaux seront euthanasiés suivant les points limites à l'issu de la récidive tumorale ou suivant les besoins de l'étude. De plus, des prélèvements pour analyses post-mortem sont nécessaires dans le cadre du projet et implique donc l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Le sujet reposant essentiellement sur des réponses aux traitements anti-tumoraux par le système immunitaire, l'utilisation d'animaux est nécessaire. La notion de remplacement est la plus limitante dans le cadre de ce projet, cependant nous avons mis au point des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales avec des lignées de macrophages permettant d'analyser les interactions avec les cellules tumorales. De plus, nous complémentons nos études sur des échantillons humains ce qui nous permet de focaliser sur des cibles ayant un minimum de relevance déjà établie chez l'homme.

Réduction

Notre approche la plus efficace dans la réduction des animaux repose sur l'utilisation de techniques moderne d'analyse à haute dimension permettant d'avoir un jeu de données le plus large d'un seul coup sur les mêmes animaux. La deuxième approche est de réaliser les expériences sur l’ensemble des groupes d’étude en même temps afin de comparer les différents groupes par rapport au même groupe contrôle. Nous mettons aussi en place une stratégie d’optimisation des animaux euthanasiés. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver les données pour l’ensemble des tissus. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment dès que possible. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés. Selon notre expérience, cela représente une option majeure de Reduction des animaux. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet s’élève à 2696 sur 5 ans. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, il sera donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour,nuit 12-12, avec au maximum 5 animaux par cages. La génération de ces modèles tumoraux est sans risque infectieux. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement : nid en carton, tunnel ou maisonnette. La surveillance quotidienne est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation et un suivi complémentaire (points limites : mesure de la charge tumorale, mesure de poids, détection de signes clinique) fréquent allant de tous les 5 jours en début de procédure (avant les risques d'apparition de signe de souffrance) à 3 x/semaine en milieu de procédure (lorsque le risque d'apparition de signes d'inconforts peut survenir). Cette surveillance permet de réduire la souffrance animale. Dans la plus grande majorité des cas nos approches de raffinement reposent sur l'utilisation d'anesthésiant/analgésiant pendant les procédures. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires dans certains cas.

Choix des espèces

Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de traitements anti-tumoraux sur l'organisme entier. Les modèles de souris utilisés sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de suivre les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie. Le projet utilise différentes lignées de souris qui combinent un certain nombre de gènes d’intérêts ainsi que des cellules tumorales murines justifiant le choix de cette espèce. On distingue les modifications génétiques qui apportent une fluorescence sur les cellules ne générant pas de caractéristiques génétiques néfastes, à l’exception du modèle développant des tumeurs mammaires spontanées. Ce modèle représentatif des tumeurs humaines pour lequel, malgré l’apparition de la tumeur, aucune souffrance animale n’est observée tant que la tumeur est contrôlée. Les animaux sont utilisés entre 10 et 14 semaines d’âge (maturité immunitaire) sauf pour le modèle de tumeur spontanée du sein dont la progression est lente qui seront utilisés entre 6 et 12 mois d’âge (à l'apparition de tumeur palpable).

Toutes tuées à l'issue parce qu'elles ne sont plus "naïves" et ne peuvent servir à d'autres projets, 720 souris subissent des douleurs inflammatoires et neuropathiques provoquées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est injecté dans leur queue, une chirurgie de vingt minutes lèse la patte d'un autre groupe, puis viennent jusqu'à dix-sept tests de douleur thermique et huit tests de douleur mécanique, avec sept injections quotidiennes du composé testé. Le porteur indique attendre un abaissement du seuil douloureux, des œdèmes, des infections et des troubles de la locomotion. Il affirme que la nociception ne s'évalue que sur "l'animal entier et vigile" et présente la souris comme un modèle "incontournable" en neurosciences.

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs malgré leurs nombreux effets indésirables. Des résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide, et notamment le récepteur GPR103, sont impliqués dans ces effets indésirables. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques et anti-hyperalgésiques sur cette cible peu ou pas caractérisée jusqu'à présent le récepteur GPR103. Pour ce faire, nous avons récemment identifié deux composés capables de bloquer sélectivement ce récepteur RFamide. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur (inflammatoire et neuropathique), et parfois en co-administration avec la morphine, chez la souris nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation du signal nociceptif. Nous espérons que ces nouveaux traitements permettront seuls de soulager la douleur chronique et/ou de diminuer les effets secondaires de la morphine lorsqu’ils sont donnés en co-administration avec cette dernière. Ce projet est un projet complémentaire d’un autre projet déjà autorisé.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet permettront d’affiner le rôle du récepteur GPR103 dans la modulation de la nociception et le développement de la tolérance induite par un traitement chronique par les opiacés. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur notamment en combinant l’utilisation de morphine à l’un de ces 2 composés afin de réduire les effets indésirables de cette dernière.

Procédures

Un lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 17 tests nociceptifs thermique d’une durée de 30 secondes espacés de 1h minimum. Un second lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après 1 test nociceptif thermique d’une durée de 30 secondes puis une injection sous-cutanée de composé (sur animal vigile). 30 min après cette injection sous-cutanée, ils subiront 7 prélèvements sanguins de 5 µL, à la queue, sous anesthésie locale, espacés d’au minimum 30 min. Un troisième lot d’animaux subira des tests nociceptifs mécaniques pendant une semaine (20 min environ, espacés de 24h minimum) puis une chirurgie sous anesthésie générale au niveau de la patte d’une durée de 20 minutes environ. Puis 10 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 8 tests nociceptifs mécaniques d’une durée de 20 min environ, espacés de 24h. Un quatrième lot d’animaux subira 2 injections par jour (10 secondes) espacées de 4h pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Les 2 molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier et vigile ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour le récepteur RFamide GPR103 disponible au laboratoire collaborateur de ce projet dans les mêmes modèles de douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux sont requis pour obtenir une analyse statistiquement robuste au vu du pourcentage de variation attendu. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et les femelles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation et une habituation à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux de 2 semaines sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées, un gel ophtalmique sera appliqué et un tapis chauffant servira à réduire l’hypothermie des animaux. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Une analgésie sera mise en place pour les prélèvements sanguins. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands du récepteur RFamide GPR103 la tolérance induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

128 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques du cerveau. Certaines subissent une chirurgie d'environ une heure pour recevoir une injection dans l'hippocampe, d'autres, porteuses de la mutation du syndrome de Dravet, sont exposées à 43 degrés pour déclencher des crises d'épilepsie, puis toutes passent quatre séances d'IRM sous anesthésie pouvant atteindre quatre heures. Le porteur indique que ces inductions peuvent entraîner des douleurs et une perte de poids, et que les anesthésies répétées peuvent fragiliser les animaux. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et qu'il n'a donc "pas d'autre choix", l'objectif restant de calibrer une méthode d'IRM avant un éventuel passage chez l'humain.

Objectifs

L’épilepsie est une maladie neurologique courante, et malgré les multiples molécules antiépileptiques disponibles, environ 30% des patients présentent une résistance aux médicaments. La chirurgie cérébrale visant à enlever les zones épileptogènes (ZE) est une thérapie efficace pour un grand nombre de ces patients mais nécessite une identification précise de ces ZE, caractérisées par une excitation neuronale accrue. La stéréo-encéphalographie, technique d’enregistrement des activités intracérébrales à l’aide d’électrodes implantées à l'intérieur du cerveau, est à ce jour la méthode de choix utilisée pour l’exploration des ZE. Cependant, cette technique présente des limites de par son caractère invasif et son échantillonnage limité du volume cérébral à l'aide des électrodes. L’amélioration de la localisation des ZE et la cartographie des altérations fonctionnelles cérébrales restent un besoin non satisfait. Des techniques permettant une évaluation précise de ces altérations permettraient d'approfondir notre connaissance de la maladie. Une approche IRM alternative a été mise au point pour aider à localiser les ZE par quantification du glucose et du glutamate. Malheureusement, la validation d'un protocole clinique robuste n'a pas encore été effectuée. L’objectif de ce projet est donc de faire progresser l'utilisation de l'IRM pour localiser les ZE dans des modèles animaux et pouvoir par la suite l’appliquer chez l’homme et ainsi leur permettre d’avoir accès au traitement chirurgical.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de faire progresser l'utilisation de l'IRM de nouvelle génération pour localiser les ZE dans des modèles animaux d’épilepsie. Si nous arrivons effectivement à calibrer chez la souris cette nouvelle méthodologie IRM alors c’est un grand espoir pour un passage en clinique, ce qui facilitera la prise en charge de tous les patients qui nécessitent une chirurgie cérébrale.

Procédures

Les souris que nous utiliserons seront anesthésiées pendant quelques minutes pour la pose d'un cathéter à demeure. Ensuite, certaines souris subiront une intervention chirurgicale pour induire l'épilepsie ou bien les souris modèle du syndrome de Dravet (une pathologie génétique qui provoque des crises d’épilepsie graves chez l’enfant) seront exposées à 43 degrés pendant quelques minutes pour induire des crises d'epilepsie. Les chirurgies seront d’environ 1 heure et les inductions des crises pour le modèle du syndrome de Dravet quelques minutes. Pendant toute la durée du protocole, les souris subiront quatre examens IRM pour lesquels elles devront être anesthésiées. Ces scanners n’excéderont pas un par semaine. La durée des séances d’IRM sera de 4 heures maximum.

Impact sur les animaux

Les inductions du phénotype épileptique, que ce soit par des injections intra-hippocampiques de substance pro-épilepsie ou bien par hyperthermie, ainsi que les chirurgies nécessaires pour placer un cathéter da façon pérenne, pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. Les souris modèles du syndrome de Dravet sont prédisposées à l'épilepsie, mais seulement si elles sont exposées à des hyperthermies de manière répétée. Dans le cas contraire, il s'agit de souris que l'on peut considérer comme non malades. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux induisant une modification du comportement et/ou une perte de poids. L'anesthésie est nécessaire pour éviter à l'animal le stress de la position contraignante et pour éviter tout mouvement qui invaliderait les acquisitions IRM.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des analyses histologiques du cerveau avec la réalisation notamment de marquages histologiques de coupes de cerveau pour caractériser leurs propriétés moléculaires. Les analyses ex vivo sont nécessaires pour confirmer que les ZE indiquées par l'IRM sont bien des ZE.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro du fonctionnement normal ou pathologique du cerveau ainsi que de son organisation anatomique, tissulaire et cellulaire. Pour mettre au point une nouvelle méthode de diagnostic d’épilepsie, nous n’avons pas d’autre choix que de recourir à des modèles animaux de l’épilepsie. Notre choix s’est porté sur deux modèles animaux très couramment utilisés. La souris constitue un modèle adapté pour les expériences proposées, où le couplage entre neurones et vaisseaux sanguins complètement fonctionnels est requis pour investiguer les effets des crises. De plus, un des modèles utilisés est issus de lignées génétiquement modifiées ayant la même mutation génétique que les patients.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux a été soigneusement calculée sur la base d'études similaires déjà publiées, afin de minimiser leur taille. Comme les analyses basées sur l'IRM visent à identifier les régions du cerveau responsables des crises d'épilepsie, si nous obtenons de bons résultats dans la localisation, nous n'utiliserons pas la totalité du nombre d'animaux prévu. De plus, un examen minutieux de la littérature scientifique qui sera publiée pendant ce projet permettra d'éviter d'éventuelles expériences redondantes.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés au quotidien par les zootechniciens et, si nécessaire, par le vétérinaire, tout au long de la procédure. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, en fonction de son état, par de l'analgésie ou bien une sortie d'expérimentation. Des critères précis ont été établis, en accord avec le vétérinaire de l’installation, pour évaluer le bien-être des animaux selon une grille de score établissant des points limites. Pendant les interventions chirurgicales les souris sont anesthésiées et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthétiques locales. Pour le suivi post chirurgie d’injection intra-hippocampique ainsi que pour le suivi post induction par hyperthermie des souris, là aussi des critères ont été établis en accord avec le vétérinaire pour évaluer l’état de l’animal. Si l’un des critères n’était pas respecté, alors une prise en charge adaptée sera mise en place, allant de l’analgésie jusqu’à une sortie possible d’expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. La littérature fournit des preuves de la fiabilité des approches in vivo pour l'évaluation des modifications patho-physiologiques des tissus et de la réponse à des traitements antiépileptiques. Les animaux seront des adultes âgés de 6-10 semaines, l'âge idéal d'induction de l'épilepsie. La préférence pour l'induction du phénotype à l'âge adulte est due aux risques inhérents de mortalité chez les souris plus jeunes. Des études antérieures ont montré des phénotypes très similaires induits à différents âges.

Pour ouvrir par ultrasons la barrière qui protège le cerveau, 32 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tissus. Elles passent des séances d'imagerie sous anesthésie allant jusqu'à deux heures, répétées jusqu'à deux fois par semaine, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue et injections dans l'abdomen. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière provoque de légers dommages cérébraux chez moins de 10 % des animaux, pouvant entraîner des douleurs transitoires, et qualifie par ailleurs ces gestes de contraintes légères n'engendrant "pas de souffrance ou de stress". Il présente les ultrasons comme un "espoir majeur" contre les maladies génétiques du cerveau, en s'appuyant sur des essais cliniques déjà en cours chez l'humain.

Objectifs

La principale limite à l'efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison de la barrière protégeant le cerveau de tout élément pouvant être toxique, mais limitant aussi le passage de la majorité des médicaments. Récemment, une technique utilisant des ultrasons a attiré l'attention en tant que moyen non invasif pour perturber temporairement cette barrière. Les ultrasons permettent de perturber cette barrière à travers le crâne et donc sans opération chirurgicale nécessaire. Dans cette étude, nous évaluerons chez la souris le potentiel thérapeutique de cette approche. En plus des données que nous obtiendrons avec des séances d'imagerie médicale, reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons la durée d'efficacité du traitement. Enfin, nous étudierons les modifications provoquées dans le cerveau après avoir reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer l'intégrité après traitement.

Bénéfices attendus

Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales tel que les maladies génétiques. Des essais cliniques utilisant cette technique chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient bénéficier d'un transfert rapide vers l'homme. Dans le cas de maladies génétiques, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour administrer un traitement efficace et durable dans le cerveau. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies au niveau cérébral, ce qui représente un espoir conséquent pour les personnes atteintes de ce type de maladie, qui ne disposent à ce jour d'aucun traitement efficace, à l'exception de traitements de leurs symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront exposés à une séance d'imagerie médicale anatomique pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection permettant d'améliorer la qualité de l'image. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse de notre traitement. Tous les animaux seront également exposés à des séances d'imageries servant à évaluer l'efficacité du traitement et nécessitant une injection dans l'abdomen, ces séances pouvant être répétées jusqu'à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

De possibles douleurs transitoires pourraient apparaître suite à l’apparition de légers dommages dans le cerveau provoqués par l'ouverture de la barrière le protégeant, visualisables par imagerie médicale (fréquence observée inférieure à 10%). Notre protocole nécessite une pose de cathéter dans la veine de la queue, ainsi que des injections dans l'abdomen qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentant des contraintes de classe légère pour les animaux et n’engendre pas de souffrance ou de stress. Le transport entre les laboratoires du projet peut également générer un léger stress ou inconfort chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'en analyser les tissus.

Remplacement

Le projet portant sur l’étude de la réponse du cerveau, et plus particulièrement la barrière le protégeant, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude du passage de particules virales à travers cette barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses du cerveau afin d'évaluer l’impact cellulaire des ultrasons qui ne sauraient être remplacées par un modèle informatique ou cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats. Le suivi de l'efficacité du traitement se faisant sur plusieurs semaines pour chaque animal, notre étude nécessite très peu de groupes de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie médiale et de traitement par ultrasons. L'imagerie médicale nous permettra également de visualiser l'apparition d'éventuel dommage au cerveau avant le réveil de l'animal, permettant une administration préventive d'un analgésique dans ce cas. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. De plus, dans le cas où certains signes de douleurs seraient observés, sans dépassement des points limites, un traitement sous-cutané avec un analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

L’ensemble des animaux utilisés seront des souris à l'âge adulte, soit à partir de 6 semaines. Nous avons optimisé les protocoles pour des animaux de ce calibre, ce qui nous permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.

Irradiées sans anesthésie puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, 1 600 souris dépourvues de système immunitaire seront toutes tuées pour prélever rate et moelle osseuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse dans la patte, six prises de sang à la joue et des cycles de traitement quotidien de 28 jours répétés jusqu'à trois fois. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en indiquant que la prolifération des cellules leucémiques peut faire souffrir l'animal, avec perte de poids et diarrhées. Il juge le recours à un animal entier vivant "nécessaire et indispensable" au motif que les lignées cellulaires ne reproduisent pas la diversité des leucémies des patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 6 fois. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines en cas d’échec de greffe afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de passage de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.