Procédures modérées

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.

Objectifs

Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie rare, elles subissent des tests de force répétés chaque mois, des prises de sang sous anesthésie, des injections du traitement et une mesure terminale de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que les souris malades sont plus petites et présentent des atteintes du muscle, de la peau, de la rate et des os. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur "l'organisme entier".

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes mutisystémiques. Nous avons l’intention d'inverser les symptômes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des études cellulaires et déterminé une réduction de l'expression du gène d'intérêt. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche dans un modèle murin de la maladie, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.

Bénéfices attendus

Il est attendu que cette étude apporte la première preuve que ce concept de traitement soit efficace pour la TAM/STRMK. Etant donné que nos résultats préliminaires ont montré un effet au niveau cellulaire, il reste à démontrer qu'il en est de même au niveau musculaire après l'administration du traitement, avec la même efficacité. Et vérifier egalement l'amélioration du phénotype des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os, après traitement par injections systémiques. L'étape suivante sera de vérifier l'effet thérapeutique chez des patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant, à partir de l'âge de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportement permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 2 fois dans la vie de la souris. Le test nécessitant le prélèvement de sang est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésions vasculaires. L'animal sera anesthésié avant chaque prise de sang afin de réduire la douleur et le stress que cela pourrait causer. Le prélèvement du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections musculaires et intraveineuse seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les souris malades sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme ce qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la nécéssité de la présence d'une poche de lait sera faite tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environnement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre d'évaluer les changements des propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.

408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale de trente minutes et des injections intracérébrales, et 288 d'entre elles un test de mémoire où l'on mesure leur temps d'immobilité après un apprentissage. Le projet étudie les mécanismes moléculaires de la mémoire dans une région du cortex, en lien affiché avec le stress post-traumatique. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation et que le système nerveux de la souris est assez proche de celui de l'humain pour extrapoler.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier les mécanismes moléculaires dans le cortex cingulaire antérieur qui sont responsables du maintien de la mémoire récente et ancienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir les mécanismes moléculaires qui sont responsables de la formation et du maintien de la mémoire et ouvrira de nouvelles perspectives quant à la compréhension et au traitement des pathologies mnésiques. A terme, il pourrait contribuer au développement de nouveaux outils pharmacologiques dirigés vers le traitement des déficits mnésiques. Ce projet s'inscrit dans un grand projet de recherche visant à développer de nouveaux traitements pour réduire les symptômes de la mémoire traumatique observés dans le cas du stress post-traumatique.

Procédures

408 souris seront soumises à une procédure de chirurgie d'une durée de 30 minutes environ sous anesthésie et 288 de ces 408 souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation. Le test comportemental dure 5 minutes pour la séance d'apprentissage et 6 minutes pour le test de rappel de la mémoire au cours duquel nous mesurons le temps d'immobilité des animaux. Les injections intracérébrales seront faites chez les 408 souris et dureront 3 minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie est un acte expérimental de classe modérée. Les douleurs post-opératoires sont minorées par l'administration d'antalgiques. 288 souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation, qui peuvent induire un faible stress: un acte de classe modérée. Les injections intracérébrales nécessite d'immobiliser les souris (488) une minute et peut provoquer un faible stress: un acte de classe modérée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse des cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif de 408 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suite aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux. Notre expérience des approches comportementales indiquent que des effectifs d’au moins 12 animaux par groupe s’avèrent nécessaires pour atteindre le seuil de significativité . Un nombre inférieur de souris par groupe à la fin de l'étude comportementale pourrait impliquer une réplication de l'expérience.

Raffinement

Tout au long du projet, les animaux seront surveillés par du personnel qualifié, des points limites spécifiques seront établis et des critères d'arrêt seront prévus pour éviter toute souffrance inutile. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous couverture anesthésique et antalgique et des méthodes de raffinement (réchauffement, asepsie) adaptées. En cas de problème constaté, les animaux seront traités selon l'arbre décisionel prévu.

Choix des espèces

La souris adulte (8 à 15 semaines): -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte: pour une comparaison des résultats, l’étude des réseaux impliqués dans la formation de le maintien d'une mémoire implique l’utilisation de cette espèce. -permet d'accéder au niveau cellulaire grâce à des procédures qui permettent d'étudier l'activation des cellules dans le cerveau. Tous les animaux utilisés seront âgés de 8 à 15 semaines, ce qui correspond au stade jeune adulte chez la souris. Etant donné que les études comportementales et pharmacologiques réalisées précédemment dans l'équipe ont été réalisées chez des souris jeunes adultes, dans un souci de cohérence, ce stade de développement a été sélectionné .

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hébergée seule pendant huit semaines, condition dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer anxiété, agressivité et baisse des capacités cognitives, avant des tests d'interaction sociale avec un congénère. L'étude cherche à savoir si l'isolement modifie la myéline chez des souris porteuses d'une mutation, en écho à l'isolement social des personnes âgées. Le porteur affirme que ces questions "intégrées" rendent les études sur l'animal "incontournables".

Objectifs

Notre groupe étudie la physiopathologie de maladies du cerveau, avec un intérêt plus particulier pour certaines maladies dans lesquelles sont observées des anomalies de la myéline, une structure qui entoure les axones des neurones et permet d’optimiser la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Nos travaux ont montré qu’une mutation dans un gène que nous étudions conduit à des anomalies de la myéline chez des souris génétiquement modifiées. L’objectif du projet proposé ici fait suite à ces observations et vise à déterminer si les anomalies de la myéline chez ces souris peuvent être modifiées en fonction des conditions de vie, en particulier dans le cadre d’un hébergement individuel.

Bénéfices attendus

La myéline joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau. Des modifications de la myéline ont été associés à de multiples conditions physiologiques et pathologiques tout au long de la vie, notamment au vieillissement normal du cerveau, et à des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques (schizophrénie, troubles bipolaires, troubles du spectre autistique), des maladies dégénératives (maladie d'Alzheimer) ou démyélinisantes (sclérose en plaques). L’un des enjeux actuels majeur est d’identifier des éléments qui pourraient améliorer ou défavoriser la condition des patients et/ou personnes âgées. Plusieurs études ont démontré, chez l’homme comme chez la souris, que l’état structurel et fonctionnel de la myéline est influencé par les conditions de vie. Par exemple, des modifications structurelles « favorables » de la myéline ont été observées dans le cadre de l'apprentissage d'une nouvelle langue ou de nouvelles tâches motrices, telles que la pratique du piano et du jonglage. À l'inverse, il a été montré que certaines formes de privation sensori-motrice, comme l'isolement social, entraînent une diminution de la myéline et une réduction de l'interaction sociale. De nombreuses mutations du gène que nous étudions ont été identifiées dans la population générale. Nos études ont montré qu’elles pourraient constituer un facteur de variabilité interindividuelle au niveau de la structure de la myéline. Notre projet va permettre d’évaluer leur impact potentiel chez les patients et les personnes âgées qui souffrent fréquemment d’isolement social (Croix Rouge : 23 pourcents des personnes isolées, sans contact social régulier, sont des personnes âgées de plus de 75 ans).

Procédures

1) Hébergement individuel d’animaux vigiles pendant 8 semaines, puis regroupement 4 par cage pendant 4 semaines pour une partie des animaux. 2) Hébergement en groupes (4 par cage) d’animaux vigiles pendant 8 semaines ou 12 semaines. 3) Test d’interaction sociale d’animaux vigiles avec un congénère de même âge et de même sexe : 3 fois 30 minutes par animal. 4) Chirurgie sans réveil sous anesthésie/analgésie : 1 fois par animal, temps inférieur à 2 minutes

Impact sur les animaux

Les souris hébergées en individuel peuvent présenter des comportements anxieux plus importants, de l’agressivité et une diminution de la cognition. Le test de comportement (interaction sociale) peut également induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’administration des anesthésique et antalgique avant la chirurgie sans réveil peut induire un stress et une légère douleur chez l’animal au point d’injection.

Devenir

L’analyse d’état de la myéline sera réalisée par des techniques qui nécessiteront d’euthanasier les souris par des méthodes réglementaires.

Remplacement

Les questions que nous posons dans ce projet concernent des aspects très intégrés pour lesquels les études sur l’animal sont incontournables. La souris constitue un modèle de choix dans la mesure où : 1) le développement et la structure de la myéline sont très bien conservés entre l’homme et la souris; 2) Des études scientifiques ont montré que les conséquences sur la myéline de l’hébergement individuel chez la souris miment les conséquences observées chez l’homme ; 3) le développement et la structure de la myéline ont été extrêmement bien caractérisés chez la souris, favorisant l’identification de phénotypes robustes.

Réduction

Nous veillerons à réduire au maximum le nombre de souris utilisées : 1) en combinant plusieurs approches expérimentales ; ainsi, les couples de reproduction seront réalisés de façon à ce que tous les souris soient utilisées et réparties dans les différentes procédures ; 2) en optimisant au maximum les données obtenues à partir d’une expérience donnée. Par ailleurs : 1) La transmission de la mutation pour la lignée transgénique que nous étudions étant mendélienne, nous serons en mesure de comparer les souris sauvages et mutantes issues d’une même portée ; 2) Tous les animaux générés, mâles ou femelles, seront informatifs ; 3) Nos très bonnes connaissances des protocoles, ainsi que la littérature scientifique, nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse et reproductibilité des résultats qui seront analysées avec des tests statistiques. Nous utiliserons pour ce projet 288 souris.

Raffinement

Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux seront stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Afin de minimiser l’impact de l’hébergement individuel, les souris seront hébergées dans un environnement sécurisant (maisonnettes/nid/bâton à ronger) et des observations du bien-être seront réalisées 1 fois/jour. En cas de comportements anormaux des points limites sont définis : manque de toilettage, prostration, léthargie ou manque d’intérêt pour la nourriture, agitation excessive, stéréotypies et/ou de perte de poids. Si un point limite est détecté, l’état des animaux sera surveillé plusieurs fois par jour. En cas de souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées. L’acte de chirurgie sera réalisé sous anesthésie/analgésie conformément aux bonnes pratiques vétérinaires en vigueur.

Choix des espèces

Choix des souris : 1) Le développement et la structure de la myéline sont très bien caractérisés chez la souris, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. 2) Les conséquences de l’hébergement individuel / réintégration sociale sur la structure de la myéline ont été bien caractérisées chez des souris de type sauvage, constituant une référence pour notre étude et permettant d’optimiser les conditions expérimentales pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées. 3) Nous pouvons également comparer des souris sauvages et mutantes issues d’une même portée dans la mesure où la transmission de la mutation que nous étudions est mendélienne. Stade de développement : Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines, âge auquel la mise en place de la myéline est terminée, la rendant sujette à modification au cours de l’hébergement individuel. Nous suivrons en ce sens un protocole publié, montrant pour la première fois l'impact de l'hébergement individuel sur la myéline chez des souris adultes.

800 souris vont être utilisées dans la création et le maintien de lignées de vieillissement prématuré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux porteurs d'une seule copie de la mutation sont transférés vivants vers un autre site avant six mois, ceux qui en portent deux copies sont tués avant l'âge de deux mois. Le porteur indique que la mutation entraîne à terme perte de poids, dos voûté et atteintes cardiaques, et fixe un point limite fondé sur des tests de réflexe de retournement et de préhension. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces mécanismes et qu'une étude sur "l'organisme entier" est "nécessaire".

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer chez l'animal comment le vieillissement, et plus spécifiquement l’induction du vieillissement au niveau de la cellule, perturbe les fonctions métaboliques, et en particulier le contrôle du métabolisme glucidique ainsi que les adaptations métaboliques du foie liées au jeûne alimentaire. Au regard d’autres études préalables menées sur le modèle de veillissement prématuré utilisé dans cette étude, les phénotypes dommageables envisagés ici sont de classe modérée. Néanmoins, pour limiter l’impact de ces phénotypes au moment des analyses prévues dans le projet, ainsi que leur survenue trop précoce, seuls les animaux porteurs de la mutation d'intérêt à l’état hétérozygote (une seule copie du gène muté) seront maintenus en élevage et transférées dans des zones d’expérimentation dédiées avant l’âge de 6 mois. Des études précédentes indiquent que ces animaux présentent un poids et une fertilité normale jusqu’à l’âge de 8 mois et une survie moyenne de 15 mois. Les analyses du métabolisme seront réalisées sur des animaux agés de 6 mois.

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre de générer des connaissances permettant d’ouvrir de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement des maladies associées au vieillissement. Cette étude aidera à mieux comprendre les changements biologiques qui accompagnent le vieillissement et à éviter les déficiences métaboliques des tissus des personnes âgées tel que le diabète de type 2.

Procédures

Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux, en dehors des actes à des fins d'élevage, de la biopsie prélevée pour le génotypage, ainsi que des actes nécessaires à la prise en charge d'un vieillissement prématuré.

Impact sur les animaux

Les souris seront élevées jusqu’à l’âge de 6 mois, moment où les phénotypes dommageables envisagés ne sont pas détectables selon les données déjà publiées. Les phénotypes plus tardifs (au-delà de 8 mois) liés à cette altération génétique incluent de nombreux signes de vieillissement prématurés, incluant une perte de poids, des perturbations métaboliques, un dos voûté, des problèmes de pigmentation du pelage, des atteintes cardiaques, etc... Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux.

Devenir

Les individus seront produits uniquement à des fins d'élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux présentant l’altération génétique en deux copies (homozygotes), associé à la survenue très précoce des phénotypes liés à l'âge, seront euthanasiés avant l'âge de 2 mois.

Remplacement

Les analyses que nous allons réaliser nécessitent l'utilisation d'animaux puisqu'à l'heure actuelle, aucun modèle in vitro ne permet de récapituler la complexité des mécanismes physiopathologiques (et notamment ceux liés à la perturbation du métabolisme) associés au vieillissement. Aussi, dans le cadre de ce projet, une étude sur l’organisme entier est nécessaire.

Réduction

Le total d'animaux a été définis d'après des analyses statistiques comme nécessaires et suffisants (ni trop, ni trop peu) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs qui nous permettront de conclure. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, 2 tests métaboliques différents seront réalisés à 48h d’intervalle sur les mêmes animaux en suivant une approche de randomisation des animaux pour ne pas introduire de biais expérimental. Par ailleurs, les animaux utilisés pour les tests en cages métaboliques seront également utilisés pour des analyses tissulaires et moléculaires. Du fait de différences possibles liées au sexe décrites dans la littérature, il est nécessaire de constituer des groupes de mâles et de femelles. Le nombre d'animaux par groupe expérimental est fixé à 10 pour les tests métaboliques choisis et les analyses en cages métaboliques, et à 5 pour les études moléculaires et tissulaires.

Raffinement

Cette lignée présente des caractéristiques phénotypiques spécifiques de vieillissement accéléré dont il faudra tenir compte mais qui ne devraient pas être limitants à l’âge auquel les animaux seront élevés puis transférés vers les zones d’expérimentation (l’espérance de vie moyenne est de 15 mois pour les animaux portant l’altération génétique en une seul copie (hétérozygotes)). De fait, la principale stratégie de raffinement consistera à utiliser des animaux de moins de 6 mois, âge au-delà duquel certains phénotypes de vieillissement pourraient apparaître. Les animaux feront néanmoins l’objet d’un suivi quotidien pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies (isolement, absence de mobilité, perte d’appétit, hérissement des poils, dos voûté…). L’état de santé général sera évalué par le test de réflexe du retournement et par la capacité d'agrippement qui constitueront un point limite entrainant la mise à mort de l’animal. Si les animaux sont stressés et ne se nourrissent pas convenablement, de la nourriture gélifiée sera placée dans la cage pour faciliter leur réhydratation et pour diminuer leur stress avant euthanasie. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (batonnets en coton, frisottis, cabane en carton ). Le change est fait de façon hebdomadaire.

Choix des espèces

Les génotypes complexes nécessaires à cette étude ne sont accessibles que chez la souris. Les souris utilisées seront des souris adultes, l'optique étant de favoriser l'émergence des caractéristiques phénotypiques du vieillissement.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit jusqu'à quatre injections et subit jusqu'à quatre séances d'imagerie TEP sous anesthésie générale sur quatre semaines, avant un prélèvement d'organes post mortem. Le projet cherche à mesurer la biodistribution de quinze peptides candidats, dont huit seulement sont disponibles, pour orienter de futures applications médicales. Le porteur affirme que l'étude in vivo de l'élimination et de l'accumulation dans les organes ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

Au cours des dernières années, les peptides ont connu une augmentation de leur utilisation en médecine que ce soit pour des applications en tant agents diagnostiques ou comme composés thérapeutiques. Ils bénéficient d’une meilleure bio-distribution et bio-disponibilité que les anticorps tout en possédant une plus forte affinité et sélectivité que les “petites molécules”. Cependant, les peptides naturels sont souvent difficilement utilisables sans modification préalable de leurs structures en raison de leurs temps de demi-vie faibles in vivo. Les modifications chimiques permettent de générer des peptides ou des pseudo peptides (endo thio-peptide, uréido-peptides par exemple) ainsi que des peptides portant des chaines carbonées ou fluorées qui améliorent considérablement leurs demi-vies mais qui modifient aussi leurs bio-distribution in vivo. L’objectif de ce projet est de déterminer par imagerie non invasive la biodistribution et la biodisponibilité de ces peptides après une administration par voie intra-veineuse, intra-péritonéale ou en sous cutanée et également de définir précisément les voies d’élimination et les zones potentielles d’accumulation afin d’anticiper une toxicité potentielle de ces peptides et de sélectionner les meilleurs candidats pour de futures applications en médecine. L’imagerie in vivo nous permettra également d’étudier la capacité de peptides modifiés à traverser les membranes (paroi intestinale, barrière hémato- encéphalique, peau). Les résultats seront comparés à ceux obtenus avec les peptides natifs mais aussi comparés entre eux selon les méthodes d’administration. Retombées attendues : ce projet doit ouvrir la voie à l’utilisation des peptides comme outil thérapeutique pour le traitement de maladies ou comme agents d’imagerie pour le diagnostique. Le 2eme objectif de ce projet est de permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c mâles ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.

Bénéfices attendus

est doit permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c males ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.

Procédures

Les animaux recevront au maximum 4 injections de produit selon 3 voies maximum d'une durée de 1 minute chaucune sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale isoflurane. Chaque animal aura 4 examens d'imagerie maximum d'une durée de totale de 120 minutes et minimale de 10 minutes sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale. Pas de chirurgie ni de prélèvement sur animal vigile ou anesthésié dans ce projet.

Impact sur les animaux

Les doses de radio-activité injectées et les doses de rayons X reçues n'induisent pas d'effets indésirables sur la durée de l'étude .Un léger hématome peut apparaitre au site d'injection intraveineux mais qui se résorbe en 48 h selon notre expérience.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure car différents organes d'intérêt seront prélevés post mortem pour des analyses ex vivo ultérieures.

Remplacement

L'objectif de ce travail étant d’évaluer in vivo la biodistribution, l’élimination et/ou l’accumulation dans des organes de différents petpides elle ne peut se faire que sur des animaux.

Réduction

L’imagerie TEP/TDMX est non invasive, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. En effet, chaque animal recevra le peptide selon les 3 modalités d'injection après une période wash out de 24 heures minimum. En fin de protocole, les organes seront prélevés pour des études ex vivo complémentaire sans augmenter le nombre d'animaux. Nous utiliserons 10 à 15 souris par groupe pour pouvoir faire des statistiques sur les résultats obtenus. Ce nombre d'animaux par groupe est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité.

Raffinement

Avant le début du protocole, les animaux sont habitués à la présence du personnel pendant une période minimale de 7 jours et maximale de 14 jours. En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés le moins possible tout en faisant attention à minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les intercations sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Un gel ophtalmique est appliqué sur la rétine pour éviter le déssechement occulaire et une injection sous cutané de NaCl 0.9% à température corporelle (10 ml/kg) pour éviter la déshydratation lors des anesthésies (examens TEP/TDMX et injection). La température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorés en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax respectivement pendant les examens d'imagerie afin de déceler tout signe précoce de mal être. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés .

Choix des espèces

Le projet vise à déterminer les voies d’élimination, le stockage dans des organes cibles ainsi que des paramètres pharmacologiques. Etant donné que notre objectif n’est pas de déterminer l’efficacité de chaque produit, sur un modèle spécifique, des souris blanches peuvent être utilisées pour cette étude. Les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines (adulte) lors de l’injection des radiotraceurs.

564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie de Sjögren leur est induite, puis elles subissent des injections intrapéritonéales cinq jours de suite, des anesthésies générales répétées pour mesurer la production de salive sur un suivi allant jusqu'à dix mois, et un génotypage par poinçon d'oreille. Le porteur indique que l'induction peut provoquer une sécheresse oculaire et des signes de kératite, et prévoit un prélèvement d'organes terminal. Il affirme que les modèles in vitro ne capturent pas la complexité des interactions cellulaires et justifie par là le recours aux animaux.

Objectifs

Le syndrome de Sjögren (SS) est une maladie auto-immune complexe et chronique qui se caractérise par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, conduisant à une sécheresse notable de la bouche et des yeux. Bien que cette affection ne soit généralement pas mortelle, elle peut avoir un impact significatif sur la qualité de vie des patients en raison des symptômes persistants tels que la sensation de sécheresse, les problèmes oculaires, la fatigue et les douleurs articulaires. Les recherches actuelles, à la fois basées sur nos propres données et la littérature existante, soulignent de manière convaincante l'implication du système immunitaire dans la pathogenèse du syndrome de Sjögren. Il semble que des dysfonctionnements du système immunitaire puissent entraîner des attaques contre les glandes salivaires et lacrymales, provoquant des lésions et compromettant ainsi la production de salive et de larmes. Cette perturbation du fonctionnement des glandes exocrines contribue directement aux symptômes caractéristiques du SS. Dans le cadre de nos objectifs de recherche, nous nous efforçons de mieux comprendre le rôle spécifique du système immunitaire dans le déclenchement et le développement du syndrome de Sjögren.

Bénéfices attendus

À court terme, notre objectif principal est d'approfondir notre compréhension des mécanismes immunologiques sous-jacents au syndrome de Sjögren (SS). En analysant de manière approfondie les réponses immunitaires spécifiques liées aux lésions des glandes salivaires et lacrymales, nous cherchons à élucider les détails moléculaires et cellulaires qui déclenchent et perpétuent cette maladie auto-immune. Cette compréhension approfondie à court terme devrait nous permettre d'identifier de manière plus précise les points faibles du système immunitaire impliqués dans le SS. Ces informations sont cruciales pour orienter nos efforts vers le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. En ciblant spécifiquement les mécanismes responsables des lésions glandulaires, nous pourrions concevoir des interventions plus précises et efficaces pour moduler la réponse immunitaire et atténuer les symptômes du SS. À moyen et long terme, notre objectif évoluera vers l'amélioration de la prise en charge et du suivi clinique des patients atteints du syndrome de Sjögren. En utilisant les connaissances acquises sur les mécanismes immunologiques, nous chercherons à développer des outils diagnostiques plus précis et des marqueurs biologiques permettant de surveiller l'évolution de la maladie au fil du temps.

Procédures

Les interventions possibles incluent des injections intraperitoneales de molecules pendant 5 jours consécutifs, réalisées sous anesthésie locale, avec une durée de moins de 5 minutes par animal. Le suivi à long terme de la maladie s'étend jusqu'à 10 mois, avec une évaluation à court terme (12 semaines) et moyen terme (24 - 30 semaines) de l'homéostasie immunitaire dans les glandes salivaires, impliquant des souris sous anesthésie générale par voie gazeuse, sans réveil et de la production de salive (une fois/mois – pour 15 minutes) sous anesthésie générale par voie gazeuse et par voie intrapéritonéale. Une partie des souris sera genotypée par poinçon d'oreille vers 3 semaines d'age.

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. L'induction de la maladie pourrait aboutir à de la sécheresse oculaire et signes de kératite comme observé chez l'homme. Le suivi attentif des réponses comportementales et physiologiques permettra de s'assurer que les souris récupèrent de manière optimale après chaque procédure, contribuant ainsi à leur confort global. Les souris genotypées par poinçon d'oreille peuvent avoir une douleur légère de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du Syndrome de Sjögren est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Cette maladie implique une dysfonction des glandes salivaires et lacrymales, qui ne peut être pleinement appréciée qu'en observant les interactions complexes entre différents types de cellules dans leur environnement tissulaire. Des resultats in vitro ont montrés que les cellules epitheliales des glandes salivaires jouent un rôle cles dans la maladie. Cependant, les modèles in vitro ne capturent pas la complexité et la dynamique de ces interactions cellulaires dans un environnement physiologiquement pertinent.

Réduction

Le nombre maximal d'animaux pour ce projet a été déterminé en prenant en considération la distribution théorique présente dans les données bibliographiques et les test statistiques. Ce nombre limité est crucial pour parvenir à des conclusions quant à l'efficacité d'un traitement. L'évaluation de l'effet du traitement sera effectuée à chaque étape à l'aide de tests statistiques. Avant chaque phase, un calcul de l'effectif sera réalisé pour ajuster et réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la mesure du possible. De plus, lorsque les procédures le permettront, des évaluations non invasives seront privilégiées tout au long du projet pour améliorer le bien-être des animaux et éviter toute euthanasie inutile. Ainsi, Le calcul du nombre (n) d'animaux prévoit l’utilisation de 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront appropriés pour réduire la douleur, le stress, l'angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : hébergés dans une pièce respectant le cycle nycthéméral et une température maintenue à 22°C, dans des cages adaptées à l'animal et à sa taille enrichies avec des copeaux de bois, des tunnels en carton, des bâtons de bois à ronger et des cotons pour nidifier, et avec un accès à la nourriture et à l'eau libre Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et par les personnes en charge de l'étude. Les points limites et les critères d’arrêt précoces de souffrance qui ont été définis seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques, anatomiques et métaboliques largement documentées dans la littérature scientifique. Cette connaissance approfondie facilite davantage l'extrapolation des effets sur la glande salivaire à l'homme. De plus, les modèles expérimentaux de cette pathologie, largement utilisés et décrits dans la littérature spécialisée, sont basés sur ces espèces. Les souris ont été choisies pour ce projet en raison de leurs particularités anatomiques et physiologiques, visant à accroître les chances de réussite du projet. Les souris incluses dans l'étude seront âgées de 3 à 6 mois ou de 8 à 10 semaines, conformément aux publications de référence qui soustendent les modèles et qui définissent le moment de l'induction de la maladie chez ces animaux.