Procédures modérées
ONCO-Disséminé. Evaluation de composés thérapeutiques sur les animaux porteurs de tumeurs disséminées
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 200
2000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des traitements répétés par voies orale, intraveineuse ou intracardiaque, des prélèvements de sang et de moelle osseuse, et pour certains une mesure de mécanique pulmonaire par trachéotomie sous anesthésie profonde avant euthanasie. Le porteur prévoit une cinquantaine d'études sur cinq ans pour évaluer des médicaments anticancéreux sur des cancers disséminés, en admettant que les modèles alternatifs in vitro restent "marginaux" et difficilement transposables. Le développement tumoral peut provoquer perte de poids, difficultés locomotrices et respiratoires, la mise à mort étant déclenchée à des points limites définis.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, - l’impact du développement de métastases pulmonaires sur les paramètres ventilatoires fonctionnels (pléthismographie) Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Induction tumorale sous anesthésie (moins de 10 minute s, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 5 heures aller, 5 heures retour). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 heure). Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 10 minutes) . Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 10 minutes). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 10 minutes) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Transport vers le site où est réalisée l’éventuelle irradiation ou l’éventuelle imagerie ou l’éventuelle radiothérapie -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale par IV -Traitements -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique -Induction en intraartérielle et intracardiaque. Si nécessité d’incision Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : -Prélèvements de sang par ponction dans une veine. -Prélèvements de sang sous contention. -Prélèvement de moelle osseuse Les prélèvements de moelle osseuse pourraient générer des fractures dans de rares cas (point limite). Le développement tumoral induira une perte de poids, des difficultés locomotrices. En cas de développement de métastases pulmonaires, des difficultés respiratoires pourraient éventuellement apparaître. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de collecter de grands volumes de sang et les organes pertinents.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Nous prévoyons environ 50 études sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 10 études sont réalisées chaque année , mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum d’animaux surnuméraires La taille des groupes nécessaires pour obtenir des modifications statistiquement significatives de paramètres mécaniques pulmonaires ou de saturation en oxygène sera optimisée suite à des études pilotes utilisant ces technologies. En première approximation, 10 animaux par groupe seront utilisés, s’agissant du nombre qui a été déterminé pour les mesures similaires dans d’autres modèles. S’agissant d’une mesure terminale, s’il est nécessaire d’évaluer la mécanique pulmonaire à plusieurs points de temps, un groupe d’animaux par point de temps sera constitué.
Raffinement
Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la SBEA. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis et des antalgiques pourront être prescrits. Dans la mesure du possible, les animaux seront achetés déjà irradiés. Cependant, dans ce cas, la période d’acclimatation devra être réduite à 24h minimum, avec implantation dans les 24-72h suivant l’irradiation. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse (Intradermique, intramusculaire), les animaux recevront une antalgie adaptée. L’induction en intraartérielle et intracardiaque se fera sous anesthésie En cas d’ouverture chirurgicale, une administration de buprénorphine (30 minutes avant minimum) sera prévue. Les injections intracardiaques seront accompagnées d’une analgésie (alpha2 agoniste et un opiacé).. Des soins opératoires (maintien de la température) seront apportés, et feront l’objet d’une surveillance et de soins post opératoires adaptés. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations de la SBEA en termes de volume, fréquence et antalgie. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie avec l’analgésie appropriée (administration d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens et/ou d’antalgiques opiacés/alpha-2 agoniste). Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux et un scoring sera mis en place. Dans toutes les cages, un gel nutritif sera rajouté, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires (cf procédure). Les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront un point limite. Des points limites adaptés et prédictifs permettant de limiter la souffrance des animaux sont indiqués dans les procédures.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.
Effet de l’enrichissement de l’environnement et de l’activité physique sur une maladie du cerveau EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 souris porteuses d'un modèle de maladie du cerveau vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées en cage individuelle jusqu'à trois mois, certaines avec une roue d'activité, et soumises à des tests comportementaux et mnésiques, dont une immersion dans l'eau à 22°C pouvant provoquer un stress thermique et une hypothermie transitoire. Le porteur cherche à identifier les marqueurs génétiques et épigénétiques des effets de l'environnement enrichi et de l'exercice sur un modèle de type Alzheimer, les bénéfices pour la santé humaine étant annoncés comme des pistes à long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et qu'il faut recourir à "l'animal entier".
Objectifs
L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.
Procédures
240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.
Impact sur les animaux
L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les souris sont maintenues sous anesthésie lors des procédures d'imagerie pour réduire au maximum le stress de l'animal. Enfin, par mesure de raffinement lors de l'examen terminal, la combinaison anesthésie/analgésie générale sera renforcée par un analgésique locale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Etude des effets d’un facteur de croissance sur le métabolisme et le muscle de la souris obèse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
45 souris obèses et diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des probiotiques dans l'eau de boisson pendant quatre semaines, subissent deux jeûnes de six heures et une incision au bout de la queue pour mesurer la glycémie, puis une anesthésie et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. Le porteur teste une nouvelle voie d'administration d'un analogue d'un facteur de croissance contre la fonte musculaire, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible et que cette lignée génétiquement modifiée est la seule à combiner trouble du métabolisme et fonte musculaire.
Objectifs
Le facteur que nous étudions sera appelé facteur X dans cette demande de projet. Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaires liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation : (i) sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie et (ii) il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, un analogue du facteur X a été développé. Celui-ce ne favorise plus le développement de tumeurs, conserve les propriétés de régulation du métabolisme et est capable d’augmenter la taille des cellules musculaires dans des modèles en culture. Cependant, à ce jour, aucune équipe n’a encore vérifié sa capacité à lutter contre la sarcopénie ni trouvé d’alternative à l’administration par injections. Les objectifs de ce projet sont : -de valider une nouvelle méthode d’administration de l’analogue du facteur X. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence ADN de l’analogue du facteur X ont été préparées. Elles seront données par voie orale (dans l’eau du biberon) aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes l’analogue. -de démontrer que cet analogue du facteur X produit dans l’intestin des animaux est produit en quantités suffisantes pour réguler le métabolisme et augmenter la taille des muscles et ce dans un modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques (souris ob/ob).
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que l’analogue possédait toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que l’analogue est capable d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger une nouvelle molécule candidate pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration de l’analogue du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.
Procédures
Les 45 souris recevront des probiotiques dans leur biberon (durée= 4 semaines). A deux reprises (avec deux semaines d’intervalle), les 45 animaux seront mis à jeun (sans nourriture) pendant 6 heures (durée nécessaire pour obtenir des mesures fiables). Suite à ce jeûne, une petite incision sera réalisée à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang prélevée pour mesurer le glucose. Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles et sans besoin de contention (durée= moins de 30 sec). Avant la mise à mort, les 45 animaux seront à nouveau mis à jeun pendant 6 heures. Suite à ce jeûne, ils seront anesthésiés par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure entraînera des nuisances modérées sur les animaux. En effet, le modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques est un modèle génétiquement modifié associé à un phénotype qualifié de dommageable. La mutation génétique donne lieu à une obésité massive à l’origine de la sarcopénie. Cette obésité massive peut réduire la mobilité des animaux, créant ainsi stress et inconfort. A l’âge où les animaux seront utilisés (entre 5 et 10 semaines de vie), aucune altération de la mobilité n’est attendue. Le jeûne nécessaire avant les mesures de glycémies et avant la mise à mort peut entraîner un stress et un inconfort des animaux. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer le glucose peut générer du stress et une douleur chez l’animal. L’injection d’anesthésiques nécessaire pour le prélèvement de sang final peut générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques est attendu.
Devenir
Les 45 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire l’analogue, et enfin la capacité de celui-ci à agir sur les muscles et le métabolisme. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que l’analogue a été testé en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés. Le modèle de souris génétiquement modifié ne peut pas être remplacé par un autre modèle de souris car il est le seul à combiner une altération du métabolisme et une fonte musculaire.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 2X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 2X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. De la nourriture sera disposée dans les mangeoires mais aussi directement au fond de la cage pour palier aux difficultés de mobilité des animaux obèses. Les souris seront anesthésiées par injection pour permettre un prélèvement de sang avant la mise à mort. Surveillance des animaux, pesées, incisions du bout de la queue et injections seront réalisées par une personne expérimentée, si possible toujours la même, pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production de l’analogue par les cellules de l’intestin ainsi que ses effets sur la taille des muscles et le métabolisme. Des souris âgées de 6 semaines seront utilisées. A ce stade, les souris obèses présentent les altérations du métabolisme et la sarcopénie qui sont les deux paramètres à améliorer grâce à l’action de l’analogue.
Perturbations vasculaires d’origine inflammatoire dans un modèle d’accident vasculaire cérébral thrombo-embolique ou thrombotique : une opportunité thérapeutique ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère du cerveau, après pose d'une prothèse crânienne, avec suivi par imagerie puis exsanguination par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les lésions post-AVC. Le porteur indique des douleurs postopératoires et des déficits fonctionnels, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score de douleur élevé. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, les stratégies d'amélioration de la reperfusion restant à développer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. L'inflammation est connue pour jouer un rôle central dans l’extension de l’atteinte vasculaire au parenchyme. Ainsi, Ddans ce projet, nous allons identifier, dans un premier temps, l’impact d’une inflammation systémique sur le débit sanguin cérébral. Dans un second temps, nous caractériserons l’influence de l’inflammation ischémique sur la modulation de la reperfusion cérébrale post-ischémie dans deux modèles d’AVC (thrombo-embolique et thrombotique). Enfin nous chercherons à limiter les effets de cette inflammation pour améliorer le devenir post-AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur la modulation de la reperfusion post-ischémie par l’inflammation périphérique, afin de développer des stratégies thérapeutiques d’amélioration de la reperfusion.
Procédures
Procédure 1 : injection intrapéritonéale de Lipopolysaccharide (ou sérum physiologique) + évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min) et exsanguination par perfusion intracardiaque. Procédures 2 & 3 : J-10 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 40min). J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes ou 4 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50min). +10min, +1h, J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle et moléculaire (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min). J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5min). J+5 : Exsanguination par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacés par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Durant la pose de prothèse, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas éblouir les animaux et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post-opératoires chauffées puis remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles pré-clinique.
Validation de l’efficacité anti tumorale de la combinaison des acides nucléiques délivré par le dendrimère pour les cancers du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
756 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pancréatiques humaines, puis on injecte des molécules par la veine de la queue avant de les mettre à mort pour prélever tumeurs et organes, afin de tester un traitement à base d'ARN transporté par un dendrimère. Le porteur suit la taille des tumeurs et prévoit une mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Il affirme avoir essayé des approches cellulaires en deux et trois dimensions sans pouvoir se passer de l'animal, invoquant l'étude au sein d'un "organisme entier", les retombées contre ce cancer restant conditionnées à l'efficacité du modèle.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostique. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace, et l’espérance de vie du patient excède rarement 6 mois. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer le traitement personnalisé à base de l’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents (siARN) et de petits ARN d'activation (saARN) pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précise, offrant une thérapie efficace et personnalisée.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est l’évaluation et la validation d’un nouveau traitement pour le cancer du pancréas, une maladie de très mauvais pronostic sans traitement efficace à ce jour. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ce modèle tumoral, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d’autres cancers résistants à la chimiothérapie classique ou à la radiothérapie, ou sur d’autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.
Procédures
Pour atteindre les objectifs de ce projet, les souris seront étudiées pour la biodistribution et l’efficacité anti tumorale après injection intraveineuse, dans la veine de la queue, de molécules fluorescentes sous anesthésie générale. À terme, les souris seront mises à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes.
Impact sur les animaux
Les souris seront sous anesthésie générale par gaz lors de l'implantation des tumeurs afin de faciliter la manipulation tout en réduisant le stress et la douleur des animaux. Les animaux recevront, si nécessaire, un antidouleur. L’efficacité et la toxicité de des combinaisons seront étudiées en mesurant les tailles des tumeurs, les poids et les comportements des souris. À terme, les souris seront mise à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes pour l’analyse biochimique et histologique
Devenir
Les animaux seront mise à mort sous anesthésie générale à la fin de cette étude ou lorsqu’un des points limites suscités sera atteint (voir annexe I). Le sang et les tumeurs seront prélevées, tout comme le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins, le pancréas et le cerveau afin de chercher des lésions éventuelles sur ces organes.
Remplacement
Dans le respect de la règle des 3R et concernant le remplacement, nous avons tenté d'utiliser toutes les méthodes substitutives possibles notamment les approches cellulaires 2D et 3D, mais nous ne pouvons pas nous passer du recours à l’animal pour l’étude de l’efficacité et la bio-distribution de nos traitements. Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation de souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale et ont fait l’objet de plusieurs milliers de publications, est justifiée et ne peut être remplacée pour plusieurs raisons. Le fait que ces souris ai un système immunitaire diminué facilite la prise de la greffe de cellules tumorales pancréatique humaine, et limite le phénomène de rejet. De plus, l’utilisation de ces modèles de souris immunodéficientes permettent le maintien des caractéristiques moléculaires, histologiques, phénotypiques et génotypiques des tumeurs pancréatiques d’origine, ce qui ne peut pas être obtenu in vitro. Ces souris nous permettront d’étudier au sein d’un organisme entier l’efficacité et la bio-distribution de nos nanomédicine, et obtenir des résultats fiables représentatifs de la tumeur d’origine.
Réduction
Concernant la réduction dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d’animaux grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant d’optimiser la taille des effectifs. Nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de t de Student. En conséquence, des effectifs de 8 individus par groupe devraient permettre d’obtenir des résultats statistiques fiables pour l’évaluer l’efficacité, et des effectifs de 5 individus par groupe pour étudier la bio-distribution de chaque, soit sur chaque modèle de tumeur, il faut 12 groupes de 8 souris (en total 96 souris) pour l’évaluer l’efficacité de chaque nano-médicine, et 6 groupes de 5 souris (en total 30 souris) pour étudier la bio-distribution de chaque combination. Le nombre total d’animaux pour ce projet est estimé à 756 souris : 576 souris pour évaluer l’efficacité (procédure 1) et 180 souris pour la bio-distribution (procédure 2) sur les ensembles de 6 modèles de cancer pancréas primaire.
Raffinement
Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement (rouleaux de papier, dôme de cellulose, carrés de coton, etc.) ; les litières sont changés toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement (groupe de 5 souris pour une cage de 530cm²) ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum Les souris sont endormies sous anesthésie gazeuse Vetflurane pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs états le nécessitent, Une grille de score a été mise en place pour évaluer les signes de souffrance, identifier les points limites et indiquer la conduite à tenir en fonction de l’état de santé de l’animal.
Choix des espèces
Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d’une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des greffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien étbalies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et, d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité des agents thérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu couteuse, ce qui fait un modèle expérimental de choix pour notre projet.
Impact des particules fines polluantes dans le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur vingt semaines, chaque animal reçoit des injections, six prélèvements sanguins et vingt prélèvements d'urine sous contention, les trois quarts subissant en plus vingt-quatre instillations nasales et une chirurgie terminale, pour reproduire une maladie rénale auto-immune liée aux particules fines. Le porteur indique que les contentions répétées provoquent stress et douleurs, avec des risques de saignement, d'infection et de chute de tension. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne confirme in vivo l'effet de la pollution, les retombées de santé publique restant à envisager.
Objectifs
Notre projet vise à étudier l’impact des particules fines contenues dans la pollution atmosphérique dans la physiopathologie de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait une meilleure compréhension de l’impact de la pollution sur le système immunitaire et le développement des maladies auto-immunes, notamment de la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Cela pourrait déboucher sur la mise en place de politiques de santé publique et d’une prise en charge spécifique visant à bloquer la suractivation des voies de signalisation inflammatoires.
Procédures
Par animal sur tous les animaux du projet (20 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 20 Prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 procédure chirurgicale terminale sous anesthésie/analgésie Par animal, sur 75% des animaux du projet : - 24 instillations intranasales (8 semaines de traitement X 3 instillations par semaine). 15 secondes par instillations.
Impact sur les animaux
Les nuisances et complications eventuelles de la procdure incluents : - Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, de prélèvements d’urine et de sang et les instillations nasales. - Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou une chute de la tension artérielle voire une hypovolémie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique des organes d’intérêts (reins).
Remplacement
Nos résultats préliminaires in vitro sur cellules immunitaires périphériques et ex vivo suggèrent que la pollution atmosphérique induit une réponse immunitaire pro-inflammatoire favorisant le développement de maladies auto-immunes comme la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour confirmer l’impact des particules fines dans le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les groupes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limite précoces et adaptés appuyés sur des fiches de suivi individuels des animaux tout au long du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, il existe des études publiées montrant l'efficacité du modèle d’immunisation active de souris avec la protéine d'intérêt pour reproduire exactement la pathologie etudiée, la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
2. Etude des conséquences de la modulation du métabolisme dans la voie nigro-striée chez le rat sain et dans des modèles rat de la maladie de parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux chirurgies du cerveau reproduisant la maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins, des tests moteurs, un test d'anxiété et un test de motivation répété chaque jour pendant dix-sept semaines, avant d'être mis à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs postopératoires et, aux stades avancés du modèle, des déficits moteurs entraînant des difficultés à se déplacer, à se nourrir et une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer à la fois le comportement, la mort des neurones et les marqueurs sanguins, et qu'une étude des stades précoces est impossible chez l'humain.
Objectifs
Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.
Procédures
Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.
Rôle du GLP-1 dans la fonction barrière de l’intestin.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 96 opérées sous anesthésie sans réveil et 496 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une ischémie de l'intestin par chirurgie, avec ou sans reperfusion, et des injections répétées, pour étudier le rôle du GLP-1 dans la barrière intestinale et l'infarctus de l'intestin. Le porteur indique que les molécules testées réduisent la prise alimentaire et prévoit une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids, une partie des animaux étant tués par décapitation. Il affirme que le remplacement est "impossible" et le recours au modèle animal "indispensable" pour une approche intégrée, un biomarqueur diagnostique restant à valider.
Objectifs
L'intestin, au-delà de sa fonction d'absorption des nutriments, constitue une formidable barrière entre le milieu externe et le milieu interne. Une perturbation de cette fonction barrière entraîne une altération de la perméabilité intestinale qui a été associée à des pathologies inflammatoires chroniques et aiguës telles que l'ischémie mésentérique aiguë (IMA). L'infarctus de l'intestin est une urgence médicale qui ne peut être diagnostiquée précocement. Il s'agit de l'évolution de l'IMA, provoquée par un apport sanguin insuffisant à l'intestin, entraînant la mort intestinale. Son taux de mortalité est de 60 à 90 % en raison de la gravité de la maladie et de l'échec d'un diagnostic rapide. Au cours des dernières années, d’importants efforts cliniques et précliniques ont été déployés pour trouver des biomarqueurs capables de prédire les dommages gastro-intestinaux avant qu’ils ne deviennent irréversibles et ne se propagent au reste du corps. A ce jour il n’existe pas de biomarqueur permettant un diagnostic précoce de l’IMA. Or un diagnostic précoce permettrait des interventions plus rapides, pouvant aboutir à : 1) éviter une intervention chirurgicale ; 2) moins de morbidité postopératoire et une survie améliorée si la chirurgie était indiquée. Cela aurait également un impact direct sur l'utilisation des ressources de santé postopératoires, tant au niveau des soins aux patients que de la prestation des services de santé. Identifier un biomarqueur spécifique de l’IMA utilisable en cas d'urgence clinique, constituerait une avancée majeure. Dans notre équipe nous avons identifié un nouveau biomarqueur sérique putatif pour l'AMI.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le biomarqueur sécrété lors d’une perturbation de la fonction barrière intestinale a-t-il un rôle dans cette fonction barrière. ? Si oui est-il bénéfique ou non ? 2. La sécrétion de ce biomarqueur vient il protéger les organes à distance de par ses propriétés anti-inflammatoires ? 3. Des médicaments, actuellement utilisés en clinique humaine, pourraient-ils être utilisés ou non lors de perturbation de la fonction barrière ?
Procédures
L’ensemble des procédures décrites dans ce projet repose principalement sur des procédures chirurgicales dont l’objectif est d’induire une perturbation de la fonction barrière en réalisant des ischémies mésentériques suivies ou non d’une reperfusion. La durée minimale de la chirurgie est de 30 minutes lors d’une ischémie et 50 minutes si elle est suivie d’une reperfusion. Certaines procédures vont nécessités des injections intra-péritonéales (IP), ou des prélèvements de microgoutte de sang pour mesurer la glycémie. Ces manipulations se font soit sous anesthésie locale (prélèvement sanguin) soit sur animaux vigiles (injections IP) et ne prennent que quelques secondes quand réalisées par un opérateur maitrisant les gestes techniques ce qui sera le cas.
Impact sur les animaux
Les expérimentations d’ischémie et ou ischémie/reperfusion de ce projet se feront sur des animaux anesthésiés et il n’y aura aucun réveil de l’animal. Les seules manipulations sur animaux non anesthésiés seront les injections intrapéritonéales des molécules pharmacologiques ou les prélèvements de micro gouttes de sang par la queue. Nous serons plus particulièrement attentifs lors des traitements chroniques de 2 semaines car il est parfaitement décrit dans la littérature que les molécules pharmacologiques utilisées réduisent la prise alimentaire. Ainsi un suivi de la masse corporelle toutes les 48h sera réalisé. Si aucun effet négatif ne sont décrits dans la littérature concernant les effets de ces molécules pharmacologiques nous seront également vigilant à tous signes susceptibles de traduire un inconfort voir une souffrance des animaux
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu une sécrétion hormonale (GLP-1) dont les effets peuvent avoir lieu localement au niveau de l’intestin lui-même mais également au niveau d’autres organes distants. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de ces expériences à l’aide de tests statistiques adéquats. En fonction de la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques sachant qu’il y a des variations individuelles des animaux, que ce soit dans les phases d’ischémie, de reperfusion ou bien lors de l’utilisation des chambres de Ussing. . Ne sachant pas dans quel sens iront nos résultats (exemple augmentation ou diminution des paramètres étudiés) nous seront dans l’obligation de réaliser des tests bilatéraux. - L’utilisation de la décapitation par guillotine, qui nous réduit considérablement la variabilité individuelle de tous les paramètres mesurés (Sanguins : cytokines ; Perméabilité etc) et nous permet ainsi de réduire le nombre d’animaux
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement de leur milieu adapté (exemple : petit abris style tunnel, matériaux de type « Sizzle dri, pour s’isoler se cacher etc). Lors des traitements chroniques (2 semaines), ils bénéficieront d’un suivi de leur état général avec mesure de la masse corporelle toutes les 48h. Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur (exemple : injections IP) seront réalisés soit sous anesthésie générale. En cas de perte de poids des animaux supérieure à 20% en 7 jours, ou tout autre signe suggérant une souffrance de l’animal (posture, absence de toilettage, craintif, etc) l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane). Aucun animal ayant subi une ischémie avec ou sans reperfusion ne sera réveillé et seront tous euthanasiés encore endormis. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Elle exprime les mêmes protéines. En particulier le GLP-1 suit le même comportement chez l’Homme et la Souris. De plus nous avons vérifié que ce GLP-1 était également sécrété lors des ischémies expérimentales réalisées chez l’Homme (ref). Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifique du gène codant pour le glucagon, Elles sont issues du fond génétique C57BL6/J. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent et se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris C57BL6/J non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus. De plus il est documenté que la fonction barrière de l’intestin évolue défavorablement avec l’âge il est donc parfaitement obligatoire de maintenir une homogénéité stricte sur ce paramètre.
Amélioration de la greffe d’ilots par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.
Objectifs
L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.
Bénéfices attendus
Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (
Impact sur les animaux
La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.
Réduction
en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté
Coopération fonctionnelle du facteur de transcription Ikaros avec les protéines Aiolos ou Foxo1 dans la biologie des lymphocytes T.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2280 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur supprime une ou plusieurs protéines des lymphocytes T, par manipulation génétique ou par injection sur trois jours, avant de les mettre à mort pour prélever thymus, rate et ganglions, afin d'étudier la régulation des cellules T impliquées dans les maladies auto-immunes. Le porteur indique que l'absence de ces protéines peut provoquer un lymphome T et prévoit une mise à mort si le poids chute de 5 %. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer l'animal car les cellules T naïves doivent rester dans un environnement in vivo, les retombées thérapeutiques restant au stade des bases moléculaires.
Objectifs
Notre équipe travaille sur des protéines jouant un rôle crucial dans le développement et la fonction des cellules du système immunitaire. Ces protéines intéragissent avec d'autres protéines pour moduler la fonction des cellules T. Cependant, jusqu’ici, aucune étude n’a déterminé l’impact de l’absence cumulée de ces différentes protéines dans le devenir des cellules T. L’objectif de ce projet est de déterminer la coopération fonctionnelle entre différentes protéines dans les mécanismes qui contrôlent la génération et la maintenance des cellules T inflammatoires. Nous génèrerons différentes combinaisons de souris ne possédant plus ou partiellement ces protéines, soit de manière chronique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Après mise à mort, les organes lymphoïdes (thymus, rate, ganglions lymphatiques) seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ces modèles murins nous permettra de comprendre comment un réseau de protéines peut contrôler la génération, la maintenance, l’activation des cellules T, qui sont des acteurs principaux dans différentes pathologies autoimmunes telles que la sclérose en plaque ou l’arthrite rhumatoïde. Comprendre les mécanismes sous-jacents permettra de poser les bases moléculaires pour le développement de nouveaux traitements pour ces pathologies.
Procédures
Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours consécutifs. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.
Impact sur les animaux
L'absence des protéines que nous étudions peut conduire à un développement d'un lymphome T. Nous effectuerons une étude pilote pour déterminer si ces souris sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Nous surveillerons les souris étroitement afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. L'injection du produit permettant l'élimination de nos protéines ne prendra que quelques secondes et le site d’injection sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des différentes populations des cellules T ex vivo et d’étudier la biologie des cellules T naïves in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (ganglion, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Un test statistique sera effectué pour comparer les groupes.
Raffinement
Une étude pilote permettra de déterminer si les souris ne possédant plus ou partiellement les deux protéines étudiées sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Pour la suite de l'étude, les animaux seront utilsés avant apparition d’un phénotype dommageable. Les souris seront élevées dans une zone d'élevage spécifique, protégeant les souris de pathogènes spécifiques et établissant un statut sanitaire de souris en bonne santé. Les souris seront étroitement surveillées afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Si une diminution du poids corporel de 5% sur une semaine est observée, l’animal sera sorti du lot et mis à mort. Lors de l’injection du produit permettant la suppression des protéines d'intérêt, le risque d’infection dans la zone d’injection sera pris en considération.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement, ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme et représente un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous étudions le devenir d'une population de cellules T très spécifiques qui a la particularité de ne pas avoir rencontré de pathogène. Cette population est plus abondante chez les souris jeunes. De ce fait, nous utiliserons les souris qui auront une suppression des protéines spécifiquement dans les lymphocytes T entre 4 et 8 semaines et celles qui auront une suppression des protéines aigüe entre 4 et 15 semaines.
Inhibition de la cathepsine C dans un modèle murin de la Dysplasie Bronchopulmonaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris, mères et souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont exposés dès la naissance à 75 % d'oxygène pendant quatorze jours pour reproduire une dysplasie bronchopulmonaire, puis reçoivent deux injections intrapéritonéales par jour, avant d'être mis à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'hyperoxygénation provoque une insuffisance respiratoire et peut léser les intestins, les yeux et le cerveau, et vise à tester l'inhibition d'une enzyme, la cathepsine C. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit une réponse immunitaire complète, les retombées pour les enfants prématurés restant formulées au conditionnel.
Objectifs
Les nouveaux nés atteints de la dysplasie bronchopulmonaire ont une inflammation chronique dans les poumons, liée à la présence d’enzymes qui sont délétères. Leur inhibition pourrait donc être bénéfique d’un point vue thérapeutique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’inhibition indirect de toutes ces enzymes, via l’inhibition de la cathepsine C, dans un modèle murin de la dysplasie bronchopulmonaire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre l'identification d’un nouveau traitement préventif et/ou curatif pour les enfants prématurés sous ventilation mécanique. Un traitement préventif ou qui diminue les conséquences de la pathologie pourrait améliorer l’espérance et la qualité de vie à l’âge adulte de ces patients.
Procédures
Hyperoxygénation pour les mères et leurs souriceaux : 75% d'oxygène pendant 14 jours, ou 75% d'oxygène 1 heure par jour pendant 14 jours. Injection intrapéritonéale 2 fois par jours pendant 14 jours pour les souriceaux.
Impact sur les animaux
La première nuisance est l’exposition à l’oxygène qui entrainera la pathologie pulmonaire, qui chez les humains se traduit par une insuffisance respiratoire. L’exposition à l’O2 peut également entrainer des dommages au niveau des intestins, des yeux et du cerveau. Les autres nuisances seront les douleurs liées aux injections et le stress lié aux manipulations.
Devenir
Les mères et les souriceaux soumis à l'hyper-oxygénation seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses.
Remplacement
La dysplasie bronchopulmonaire est une pathologie inflammatoire qui fait intervenir le système immunitaire et notamment les neutrophiles. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de mettre en place une réponse immunitaire complète et l’effet qu’un traitement pourrait avoir dessus. Cette pathologie atteint la morphologie pulmonaire au niveau des alvéoles, et du système vasculaire notamment ; il n’existe pas de modèle pulmonaire in vitro permettant d’avoir une bonne représentation de la maladie. Ainsi l’efficacité du traitement ne pourra être réalisée que sur un modèle in vivo.
Réduction
D'après des expériences réalisées par d'autres laboratoires avec de la fumée de cigarette ou de l'ozone, les lots devront être constitués d'au moins 8 animaux pour atteindre des différences statistiques.
Raffinement
Pour le confort des souris les dispositions suivantes sont prévues : manipulation des animaux à l'aide d'un tube, présence de dôme, de papier pour nidation, de nourriture et eau ad libitum, de jeux type rouleaux en de carton et de récompense comme des fruits secs ou des graines après chaque manipulation. Les animaux seront observés quotidiennement. Leur poids sera contrôlé. Le comportement de la mère et des souriceaux sera observé, ainsi que leur aspect physique : poil, oreille. En ce qui concerne le raffinement pour les femelles gestantes : massage abdominal, réchauffement de la femelle sur couverture chauffante, tentative de sortie manuelle de l’embryon coincé.
Choix des espèces
Il y a deux raisons à l’utilisation du modèle murin pour ce projet. La première concerne la mise en place du modèle de dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. Cela permet d’utiliser les souriceaux à leur naissance, alors que l’on devrait pratiquer une césarienne sur d’autre modèle. La seconde raison est la disponibilité de souris déficiente en cathepsine C, qui nous permet de faire notre preuve de concept. Les souris adultes (8 semaines) seront utilisées pour la reproduction et pour le sevrage des souriceaux dans le cas de la mère. Les souriceaux seront utilisés dès leur naissance pour la mise en place du modèle de la dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. La mise en place du modèle dure 14 jours, les jeunes souris seront euthanasiées à ce moment-là pour la récupération des échantillons.
Approche CRISPR/Cas9 pour l’étude de l’expression des protéines astrocytaires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau sous anesthésie, puis est mis à mort deux semaines plus tard pour analyse histologique, afin de suivre par CRISPR/Cas9 l'expression de marqueurs fluorescents dans les astrocytes. Le porteur indique des douleurs postopératoires modérées, atténuées par des antalgiques, et une douleur légère liée à la biopsie d'oreille. Il affirme qu'un système in vitro ne peut pas reproduire les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux, et qualifie ce travail d'"indispensable" pour de futures cibles thérapeutiques.
Objectifs
Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. Dans une étude récente, nous avons identifié de nouveaux répertoires moléculaires des interfaces astrocytaires. Le but de notre projet est de caractériser l’expression de ces nouveaux marqueurs au cours du développement des astrocytes par la technique CRISPR Cas9 permettant d’intégrer un marqueur fluorescent dans les gènes candidats pour suivre leur expression dans les astrocytes du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau le répertoire moléculaire des astrocytes du cerveau qui est encore mal connu. Il est indispensable de faire progresser ce domaine de recherche car les astrocytes sont de plus en plus considérées comme des cibles thérapeutiques pour les pathologies neurologiques. Cependant sans une connaissance accrue de leur fonctionnement moléculaire ces pistes ne pourront pas être développer.
Procédures
Concernant le génotypage sur biopsie, cette procédure est validée dans une autre DAP. Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale qui durent 30 minutes. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Ils seront mis à mort 2 semaines après la première intervention.
Impact sur les animaux
Douleurs post opératoire de gravité modérée minorées par des antalgiques et douleur légère de courte durée liée à la biopsie d’oreille.
Devenir
L euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour le prélèvement et l'analyse histologique des tissus.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Cependant, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 4 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les opérations seront faites sous anesthésie générale. Les souris subissant une opération feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. L'intervention pouvant générer de l'inconfort et de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, les points limites intermédiaires permettant la mise en place de soins des animaux sera mise en place évitant l'euthanasie des animaux. Des analgésiques sont prévus et co-administrés pour limiter la souffrance pendant et après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 60 marqueurs à étudier lors d'une étude transcriptomique menée au laboratoire, à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces différents stades permettre de suivre l’évolution de l’expression des marqueurs au cours de la maturation des astrocytes ce qui est essentiel pour comprendre leur fonction.