Procédures modérées

1344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit jusqu'à six séries de distensions colorectales par ballonnet, des administrations de molécules et des lavages coliques, la distension pouvant provoquer une diarrhée et, comme effet indésirable, une perforation du côlon. Le porteur étudie les mécanismes de la douleur viscérale du syndrome de l'intestin irritable, en concluant que l'expérimentation animale est "incontournable" malgré des travaux préalables sur organoïdes. Le projet se déroule dans trois établissements.

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

900 souris d'une souche anxieuse vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à des tests comportementaux après administration de psilocybine, de psilocine ou de sérum salé, une autre à une chirurgie stéréotaxique d'implantation d'une sonde de microdialyse dans le cortex préfrontal. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure" au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres nociceptives, et étudie les mécanismes antidépresseurs de la psilocybine. Sur le remplacement, il affirme qu'on ne peut modéliser les troubles de l'humeur ni les effets des molécules in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs rapides de la psilocybine et de son métabolite la psilocine. Ces effets seront aussi étudiés d'un point de vue neurochimique dans le cortex médian préfrontal des souris, une région cérébrale impliquée dans l'effet antidépresseur des molécules déjà commercialisées. Il est donc important de comprendre comment la psilocybine affecte le fonctionnement des différents types de neurones du cortex. Ce travail vise donc à évaluer comment la psilocybine et la psilocine affectent les neurotransmetteurs et si cela participe à la réponse comportementale antidépressive.

Bénéfices attendus

La mise en évidence des mécanismes neurochimiques sous-jacents aux effets antidépresseurs de la psilocybine ou de son principal métabolite seront une avancée supplémentaire dans le développement d'une nouvelle classe d'antidépresseurs non monoaminergiques d'action rapide.

Procédures

En comportement: administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris. Chaque souris sera testée en comportement pour évaluer l'effet anxiolytique et antidépresseur de la psiloxybine/psilocine. En neurochimie: anesthésie de la souris, chirurgie stéréotaxique pour implanter la sonde de microdialyse, administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris: 24h après, collecte des dialysats du cortex toutes les 30 minutes pendant 4 heures, soit 9 dialysats/souris. Comportement : nombre n=750, durée 5 minutes/souris. Chirurgie : implantation stéréotaxique de sondes de microdialyse: nombre d'interventions: une par souris, durée 24h/souris.

Impact sur les animaux

Les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour l'implantation intracérébrale de canule qui inclue le positionnement sur le cadre stéréotaxique, la trépanation osseuse et l’incision du scalp, l'animal est sous anesthésie. Le cerveau étant dépourvu de fibres nociceptives, le niveau de douleur pour ces implantations intracérébrales est modéré.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour analyse post-mortem.

Remplacement

Les expériences in vitro et in vivo sont complémentaires et ne s’excluent pas l’une l‘autre. De plus, la psilocybine est une pro-drogue, la psilocine étant son métabolite actif, le métabolisme hépatique de la psilocybine est donc nécessaire à l’obtention des effets antidépresseurs. A ce jour, il n’est possible ni de modéliser les troubles de l’humeur, ni de modéliser les effets de molécules sur de tels troubles in vitro ou in silico. Les mécanismes sousjacents sont trop complexes pour cela. Il est donc nécessaire de recourir à l’expérimentation in vivo dans une telle situation.

Réduction

La technique de microdialyse utilise chaque animal comme son propre témoin, de plus plusieurs, dialysats et donc plusieurs données sont générées pour chaque animal. Pour le comportement le nombre d'animaux est minimisé grâce à l'expertise du laboratoire dans ce type d'observations.

Raffinement

Une anesthésie générale est mise en place pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse et bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Cependant pour prévenir des douleurs induites un traitement antalgique sera entrepris le jour de la chirurgie . Un suivi quotidien des animaux sera assuré et l’état général des animaux sera évalué. Une pesée hebdomadaire sera également effectuée. Les points limites définis dans les différentes procédures expérimentales seront strictement appliquées.

Choix des espèces

L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet, en particulier la souche Balb/C qui a un phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines, il s'agit d'un stade de développement couramment utilisé dans la littérature pour les tests comportementaux qui seront mis en oeuvre dans ce projet.

1800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à 72 administrations de composés, des applications de patch et des prélèvements de sang, le modèle induisant des douleurs inflammatoires des voies respiratoires et, en cas de traitements répétés, des hématomes. Le porteur met en place un modèle de rhinite allergique induite par l'ovalbumine pour tester de nouvelles molécules et voies d'administration. Sur le remplacement, il affirme que les études in vitro ne rendent pas compte des interactions systémiques et qu'il faut un "organisme complet".

Objectifs

La rhinite allergique est une maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires supérieures souvent associée à l'asthme et a un impact majeur sur la santé globale. C'est une réponse d'hypersensibilité résultant d'une inflammation médiée par l'immunoglobuline E (IgE) au contact d'allergènes spécifiques avec la muqueuse nasale, caractérisée par des symptômes tels que démangeaisons nasales, frottements, éternuements, larmoiement et rhinorrhée. Les déclencheurs courants de la rhinite allergique comprennent les allergènes environnementaux. La fréquence de la rhinite allergique a été multipliée par quatre au cours des trois dernières décennies, affectant à présent plus de 25% de la population générale en France. Bien que cette affection soit bénigne, elle pose un vrai problème de santé publique, du fait de sa fréquence et de son impact important sur la qualité de vie. Dans les formes sévères, elle conduit à un véritable handicap, cause de troubles du sommeil, d’irritabilité, d’absentéisme scolaire, d’arrêt de travail… Actuellement, le traitement de la rhinite allergique passe par trois voies : l’éviction allergénique (réduire au maximum la charge allergénique de l’environnement), le traitement médicamenteux (antihistaminiques H1 qui constituent le traitement de première ligne de la rhinite allergique et représentent plus de 90% des prescriptions), la désensibilisation (administration régulière d’extraits allergéniques par voie sublinguale ou sous-cutanée pendant une période prolongée, idéalement 3 à 5 ans). De nouvelles approches en immunothérapie allergénique sont à l’étude. Des peptides synthétiques correspondant à des fragments moléculaires d’allergènes sont en cours de développement. Couplés à des fragments de protéines virales ou à des molécules immuno-modulatrices, ils pourraient améliorer la tolérance et l’efficacité de la désensibilisation. Parallèlement, d’autres voies d’administration des traitements « désensibilisateurs » sont en cours d’évaluation, telles que la voie épicutanée (patch) et la voie intra-ganglionnaire. L'objectif de ce projet est de mettre en place le modèle de rhinite allergique induit par l'ovalbumine au sein du laboratoire afin d'étudier ces nouvelles molécules thérapeutiques inhibitrices visant à réduire l'inflammation au niveau nasal et pulmonaire mais aussi les symptômes comme les éternuements. De plus ce projet a pour but de tester de nouvelles voies d'administrations, notamment la voie épicutanée.

Bénéfices attendus

A ce jour, 25% des français souffrent de rhinite allergique et il y a peu de traitements, des recherches sont en cours notamment pour améliorer la désensibilisation. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur les symptômes de la rhinite allergique (éternuements, démangaisons/grattage) ainsi que sur l'inflammation des voies respiratoires chez la souris. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel effet dans ce modèle, des lavages pulmonaires et/ou nasaux ainsi que des prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages.

Procédures

Administrations de composé: maximum 72 administrations (30 secondes/souris); Applications de patch sur la peau: maximum 15 applications (2min/souris); Prélèvements de sang: maximum 4 prélèvements (30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires des voies respiratoires à l'animal. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. De plus dans le cas de traitements répétés, des hématomes peuvent se former et être douloureux et les injections peuvent entrainer une douleur légère (piqure).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.

Remplacement

Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la rhinite allergique demande l’étude d’un organisme complet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum (N=10) nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un antalgique sera administrée. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 à 16 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation pulmonaire et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Des souris de 8 à 16 semaines seront utilisées afin de pouvoir réaliser des études si besoin soit sur jeunes adultes ou sur des souris vieillissantes (sénescence par exemple).

672 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracardiaque de cellules de cancer du sein sous anesthésie, un suivi par bioluminescence, puis sont tuées par cohortes de un à trente jours après l'injection pour prélever cerveau, foie et poumons, le développement métastatique pouvant réduire la mobilité. Le porteur cherche à identifier des régulateurs des métastases cérébrales, les bénéfices pour les patientes étant situés "à moyen ou long terme". Il indique utiliser en amont un dispositif "métastase-sur-puce" pour présélectionner les cibles.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les régulateurs moléculaires majeurs (master regulators) impliqués dans les étapes précoces du développement métastatique cérébral des cellules cancéreuses de sein triple négatif.

Bénéfices attendus

Les métastases cérébrales représentent un enjeu majeur dans le cancer du sein du sous-type triple négatif. Environ 25% des patientes atteintes de ce type de cancer développeront une métastase cérébrale à la suite d’une tumeur primaire, leur conférant une survie médiane de 6 mois. Dans ce contexte, il est nécessaire d’identifier des acteurs impliqués dans le développement métastatique cérébral qui représenteront de potentielles cibles pour en limiter le développement. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires activés lors de la dissémination de cellules cancéreuses dans le parenchyme cérébral et ainsi découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles bloquant le développement de métastases cérébrales. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patientes atteintes de cancer du sein métastatique (santé humaine).

Procédures

Après l’arrivée et l’acclimatation pendant 7 jours des animaux en zone d’hébergement, l’ensemble des 336 animaux seront manipulés tous les 2 jours pendant 3 semaines par l’expérimentateur avant le début des procédures afin de réduire leur stress et de les habituer à la manipulation humaine. Le projet se déroulera ensuite en trois parties. Plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (336) sera soumis à une anesthésie gazeuse (durée 15min) afin, dans un premier temps de tondre une partie de leur pelage au niveau du torse. Ensuite, les animaux recevront une injection intracardiaque de cellules cancéreuses (cellules humaines de cancer du sein ; parties 1 et 2 : 240 animaux), de placebo (parties 1 et 2 : 24 animaux) ou de cellules cancéreuses dont on a retiré ou non une cible préalablement identifiée (partie 3 : 72 animaux). Tout au long de l’injection intracardiaque, les souris seront maintenues sous anesthésie à l’aide d’un masque et l’injection se fera sans chirurgie. Une fois les injections réalisées, l’état des souris sera contrôlé et les animaux seront pesés tous les 2 jours (2 min par animal). Une lecture de bioluminescence sera réalisée après injection intracardiaque puis une fois par semaine afin de suivre le développement des cellules tumorales. Pour cela les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse et recevront une injection de luciférine afin de permettre la lecture (durée totale de l’intervention : 10 min par animal). Pour les parties 1 et 2 : des cohortes de 44 animaux seront mises à mort à 1, 3, 5, 10, 15 et 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique par imagerie et par analyse des gènes. Pour la partie 3 : les 72 animaux seront mis à mort 30 jours après l’injection des cellules. Le foie, les poumons et le cerveau seront récupérés afin d’analyser le développement métastatique et d’évaluer le potentiel d’inhibition du développement métastatique de la cible choisie.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation, de plus, le développement métastatique cérébral pourrait être à l’origine d’une réduction de la mobilité ou encore une perte de poids. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier rapidement ces conséquences. L’étape initiale d’injection des cellules et les étapes ultérieures d’imagerie nécessitant l’injection d’une molécule pour visualiser la bioluminescence pourraient entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Par prévention, les souris subiront donc une anesthésie gazeuse pour ces différentes étapes. Les cellules injectées conduisant à la dissémination de métastases au niveau du parenchyme cérébral, un soin tout particulier sera apporté à la surveillance du comportement des animaux et à l’apparition d’un changement dans ce dernier ou d’éventuels signes de souffrance au moyen d’une grille de score.

Devenir

La récupération des différents organes pour analyse étant essentielle dans ce projet, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Nous avons réalisé une série d’expérience in vitro afin de définir au mieux les modèles à utiliser, ainsi que les conditions expérimentales à conduire in vivo. En parallèle, nous avons développé des dispositifs micro-fluidiques "métastase-sur-puce" pour réaliser une pré-validation des cibles identifiées. Le dispositif comprend une microvascularisation perfusée intégrée dans une matrice de collagène obtenue avec des canaux latéraux de collecte. Cette plateforme permet le suivi par imagerie confocale de cellules cancéreuses métastatiques traversant une structure de type endothélial vers un environnement modulable. Ce dispositif servira à sélectionner les cibles les plus pertinentes à valider in vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous focalisons notre recherche sur le développement métastatique au niveau du cerveau, mais nous allons également récupérer de manière complémentaire les poumons, le foie et la moelle osseuse afin d’éviter une répétition de l’approche expérimentale pour chaque lieu métastatique. La veille de la littérature scientifique ainsi que des analyses statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux strictement nécessaires pour l’obtention de résultats scientifiques valides.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement par l’expérimentateur tous les deux jours pendant 3 semaines avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant chaque geste pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal : tontes, injections intracardiaques et mise à mort. Une fois l’injection intracardiaque de cellules tumorales réalisée, les animaux seront suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids...) un traitement analgésique sera envisagé. Les points limites à ne pas dépasser ont été définis. Dans le cas où un seuil limite serait atteint et que le traitement mis en place n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix dans les modèles d’études en cancérologie de par, notamment, la disponibilité des outils moléculaires et sa proximité génétique avec l’homme. Dans le cadre de notre étude, nous devons injecter des cellules cancéreuses humaines à notre modèle pré-clinique qui de ce fait doit être immunodéficient. Les animaux utilisés seront des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines (ayant atteint la maturité sexuelle) afin de bénéficier d’un environnement propice au développement de métastases de cellules de cancer du sein.

3600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie stéréotaxique pouvant durer jusqu'à deux heures pour injecter un virus et implanter une lentille dans l'hypothalamus, puis des tests comportementaux de quatre à huit semaines, avec hébergement individuel et douleurs post-opératoires possibles. Le porteur étudie la réaction des réseaux neuronaux du comportement alimentaire face à une nourriture grasse, les retombées contre l'obésité étant annoncées "à plus long terme". Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut répondre à cette question.

Objectifs

Manger est un processus essentiel à la vie. Afin de de garantir la survie lorsque la présence d’aliment est incertaine, adapter l’apport d’énergie en fonction des besoins, et faciliter la reconnaissance des aliments riches en calories, des composantes plaisir et motivationnelle se sont mises en place pour faciliter la recherche des aliments. Ces deux composantes garantissent un apport en nutriments riches en calories au-delà des besoins immédiats. De nos jours, le déséquilibre qui existe entre cette pulsion naturelle à manger et la disponibilité des aliments 24 heures sur 24, contribue à augmenter le taux d'obésité et le diabète de type 2. Au niveau du cerveau, l'hypothalamus va interpréter les informations hormonales et neuronales, et va prévenir de la disponibilité des nutriments dans l'organisme. Cette structure est composée de plusieurs populations neuronales qui vont exercer des fonctions presque opposées dans la régulation du comportement alimentaire. Jusqu’à présent, nous n’avons que très peu d’informations sur la réaction de ces acteurs lors des premières présentations de nourritures riches en graisse, nous avons donc décidé de les étudier pour en apprendre plus.

Bénéfices attendus

Chez les personnes souffrant d'obésité la préférence pour les aliments riches en graisses et en sucres va prédire une prise de poids importante ou un risque accru d'obésité. Comprendre comment réagissent les neurones contrôlant la prise alimentaire lorsque la nourriture riche en graisse est proposée pour la première fois, lorsque l’animal a le choix entre une nourriture classique et une nourriture riche en graisse, lorsque l’animal aura la possibilité de prévoir la présence de nourriture riche en graisse à l’aide d’un indice extérieur, ou lorsque la nourriture sera à nouveau disponible après une période où elle aura été retirée, devrait nous aider à comprendre ce qu'il se passe lors de la consommation de tels aliments. A plus long terme, ces informations devraient profiter de manière significative à la société, en mettant en évidence de nouveaux mécanismes qui serviront de piste pour traiter l’obésité.

Procédures

Cette étude nécessite de recourir à une chirurgie d'une durée maximale de 120 minutes, qui permettra : 1/d’injecter un virus exprimant les outils génétiques nous permettant de visualiser l'activité neuronale 2/d’implanter une lentille nécessaire à la visualisation de cette activité dans des régions profondes comme l'hypothalamus 3/ d'utiliser des tests comportementaux permettant de relier l'activité des neurones à la présentation de nourriture riche en graisse. Une seule chirurgie sera pratiquée sur chaque souris. De même un seul test comportemental sera réalisé sur un même lot d’animal. Les tests comportementaux ont une durée de 4 à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Les éventuelles nuisances que nous avons identifiées sont au nombre de deux : 1/un stress social suite à un hébergement des animaux en cage individuelle. Pour remédier à ces nuisances nous utiliserons un enrichissement accru de l’environnement, nous utiliserons des cages transparentes et rapprocherons au maximum les cages pour que les animaux gardent un contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères. 2/de potentielles douleurs/perte de poids rencontrées suite à la chirurgie stéréotaxique. Pour éviter toute douleur, nous utiliserons une médication analgésique pré- et post-opératoire.

Devenir

Tous les animaux de cette études seront mis à mort, et les cerveaux seront récupérés pour des contrôles histologiques réalisés post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre comment les neurones contrôlant le comportement alimentaire vont réagir en présence d’aliments appétissants et hypercaloriques et comment cela peut engendrer une surconsommation d'aliments qui pourrait être à l’origine d'une prise de poids ultérieure. Dans ce contexte, Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux à son plus petit nombre, nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 5 semaines et seront manipulés deux fois par semaine au minimum une semaine avant le début des expériences (souris alors âgées d'au moins 8 semaines). Ce qui permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. 2) Enrichissement : carrés de cellulose/frises de kraft pour nidifier, bâtonnet en bois pour ronger et tunnel en carton pour se cacher. 3) Maintient des souris en cages collectives jusqu’à la réalisation des chirurgies stéréotaxiques 4) Utilisation d’anesthésiques et analgésiques pour les procédures douloureuses 5) Choix de points limites précoces et terminaux appropriés par évaluation de l’apparence, du poids, de l’attitude, des signes cliniques (température et respiration) et aspect de la plaie (le cas échant) 6) Pour la perfusion intracardiaque, utilisation d’un analgésique et de lidocaïne dans la solution barbiturique pour prévenir le risque de douleur abdominale.

Choix des espèces

Les caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) disponibilité de nombreuses souches 5) comportement alimentaire et la balance énergétique depuis longtemps étudié chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris, donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet pour les chirurgies, d’utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence.

62 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements hebdomadaires sous anesthésie répétée pendant six à douze semaines, avec douleurs post-opératoires et isolement possible. Le porteur teste des électrodes flexibles en soie censées réduire la réaction inflammatoire, un dispositif qu'il qualifie de "révolution conceptuelle". Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyen alternatif d'évaluer l'activité neuronale in vivo sur plusieurs semaines.

Objectifs

Malgré de nombreuses avancées technologiques dans le domaine des neurotechnologies, une problématique majeure réside dans la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques stables sur le long terme in vivo. L’insertion d'électrodes rigides dans le cerveau induit une forte réaction inflammatoire dans le système nerveux central comme le fait tout corps étranger implanté dans un organisme. Cette réaction vient altérer avec le temps la stabilité mécanique et électrique des électrodes implantées. L’objectif de l’étude est d'améliorer la stabilité des électrodes implantables et de diminuer les réponses inflammatoires associées grâce à un dispositif plus adapté aux mesures dans le cerveau. Dans cette étude, nous utiliserons des électrodes implantables flexibles et biocompatibles qui minimisent leurs empreintes dans le cerveau et en réponse seront capables de détecter l’activité électrophysiologique. Nous allons regarder l’effet de nos électrodes sur le long terme sur le cerveau et essayer de comparer la réponse gliale entre mâle et femelle. Un tel dispositif serait une révolution conceptuelle dans le domaine des neurosciences en fournissant pour la première fois la possibilité de développer des implants biocompatibles stables sur le long terme. Récemment nous avons développé un nouveau type d’électrodes en soie car ce matériau possède des propriétés intéressantes telles que sa résistance, sa flexibilité et sa biocompatibilité et font d’elle un des matériaux les plus remarquables de la nature.

Bénéfices attendus

Les électrodes biocompatibles sont des électrodes conçues pour être utilisées en toute sécurité et bien tolérées par les tissus vivants. Elles sont couramment utilisées dans les dispositifs médicaux, tels que les appareils EEG pour enregistrer les signaux électriques du cerveau. Ce projet a pour objectif d'analyser les électrodes récemment mises au point dans le cerveau, visant spécifiquement à réduire les incompatibilités mécaniques, le stress, et l'activation immunitaire, dans le but de minimiser les dommages cérébraux associés à l'utilisation de ces électrodes.

Procédures

Chaque souris sera soumise à une chirurgie d'implantation d'électrodes unique dans le cerveau de 30 min et des enregistrements électrophysiologiques seront effectués pendant 15 minutes par animal 1 fois par semaine jusqu'à maximum 12 semaines maximum suivant le groupe après l'implantation sur souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’implantation des électrodes en soie, les nuisances attendues sont des douleurs post-opératoires, dans les heures suivant la chirurgie. La présence de l’électrode dans le cerveau de la souris pourra conduire à son isolement. De plus la nécessité de faire des enregistrements toutes les semaines implique des anesthésies répétées.

Devenir

A l’issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau doit être prélevé pour analyse.

Remplacement

« Remplacer » les modèles animaux : il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs pour l'évaluation de l’activité neuronale in vivo. Des caractérisations in vitro ont été réalisées en amont au sein du laboratoire. Nous avons pu montrer que les cellules neuronales sont viables et fonctionnelles en présence des électrodes. Les cellules neuronales se différenciaient correctement sur les implants, validant ainsi la biocompatibilité des dispositifs avant les expériences in vivo. Ces études ne peuvent pas être effectuées in vitro car nous avons besoin de déterminer les conséquences directes dans le tissu cérébral pendant plusieurs semaines.

Réduction

L'expérience a été organisée afin de réduire au maximum le nombre d'animaux pour la totalité de l'expérimentation, à la fois pour une puissance statistique convenable et pour palier d'éventuelles pertes d’animaux au cours de l’expérimentation. Le nombre d'animaux a été calculé en fonction de la quantité de données que chaque animal fournira pour une analyse temporelle, pour la fonction de l'électrode et l'intégrité du tissu cérébral. La plupart des études dans la littérature de ce domaine utilisent le même nombre d’animaux pour les tests pilotes et les tests expérimentaux. Nous disposons d'une cohorte plus pertinente pour les études biologiques. Nous prévoyons d’utiliser 52 souris (+10 animaux en cas de problème d’ implantation, électrodes non fonctionnelles ou souffrance de l’animal) afin d’étudier l’effet sur le long terme et l’effet sur le genre (mâle, femelle). Dans un premier temps, nous effectuerons un premier test pendant 30 jours en utilisant au maximum 12 mâles C57bl/6. Nous prévoyons d’inclure un minimum n= 3 souris pour les études préliminaires. Pour les études nous prévoyons n= 4 pour les groupes contrôle et n= 6 pour les groupes implantés avec l’électrode en soie. Chaque souris sera suivie chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines ce qui permettra alors à l’animal d’être son propre contrôle. Ces chiffres nous permettront d’obtenir suffisamment de données neurophysiologiques par groupe pour une analyse statistique satisfaisante.

Raffinement

Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (agressivité / apathie), sa mobilité et son poids. Une fiche de suivi et les mesures conservatoires, jointes en annexe 2, détaillent les critères de points limites et les actions mises en place. Les mesures conservatoires graduées pour le site chirurgical (désinfection, crème cicatrisante, antibiotiques), la perte de poids (granulés de sucre, injection de glucose), l’hydratation (injection de solution saline) et la prise en charge de la douleur (injection d’analgésiques) sont détaillées en annexe 2. Dans le cas où un animal présenterait des signes manifestes de souffrance ou perte de poids excessive (≥20% du poids initial sur 3 jours), il sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié si les signes persistent dans les 24h. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi (bâtonnets à ronger, nids). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum".

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris qui est un modèle de choix qui permet de prendre en compte de manière intégrative l'impact de l’électrode dans le cerveau d’animal et dont notre équipe dispose de données antérieures concernant l’implantation d’électrodes. Nous allons utiliser des souris adultes âgées de 12 semaines car à cet âge le cerveau est considéré mature.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, des traitements quotidiens sur cinq jours et l'injection d'un radiotraceur pour imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant atteindre 2000 mm³ avant mise à mort. Le porteur évalue un radiotraceur pour détecter ces tumeurs et suivre l'effet de traitements, en présentant l'imagerie longitudinale comme un moyen de réduire le nombre d'animaux. Il retient la souris comme le modèle majoritaire de la communauté pour tester les molécules anticancéreuses.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

1584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections de traitement trois fois par semaine sur animal vigile, la tumeur étant laissée croître jusqu'à un volume défini, avec perte de poids, altérations cutanées et nécroses possibles. Le porteur cherche à re-sensibiliser des mélanomes résistants au moyen d'une molécule ciblant le cuivre, ces validations étant présentées comme "indispensables" à un développement clinique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des interactions aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome est un cancer très agressif qui risque fortement de développer des métastases, au niveau du foie ou des poumons par exemple. Si il est découvert assez tôt, le mélanome peut se soigner en retirant la partie cancéreuse par chirurgie. En revanche, si des métastases sont déjà présentes lors du diagnostic, le pronostic est souvent mauvais et il est alors nécessaire de traiter de manière systémique, c’est-à-dire sur tout le corps, afin de tuer les cellules de la tumeur d’origine ainsi que les métastases. En termes de traitements, il existe deux familles de médicaments qui sont utilisés aujourd’hui pour traiter le mélanome métastatique, les thérapies ciblées et les immunothérapies. Les thérapies ciblées, dont fait partie le PLX4032, (aussi appelé le Vemurafenib), sont utilisées en première intention et sont efficaces mais seulement chez les 50% de patients qui présentent une mutation spécifique (B-Raf). Cependant, après une période de traitement, le mélanome va se modifier pour devenir résistant au traitement, ce qui va entrainer une rechute. L'autre famille de traitements utilisés est l'immunothérapie, dont font partie les inhibiteurs de point de contrôle ou anti-PD1. Ils sont également utilisés pour traiter les patients atteints de mélanomes métastatiques et fonctionnent en interférant avec le système immunitaire pour induire la mort des cellules cancéreuses mais entrainent cependant une réponse positive dans seulement 10 à 30% des cas. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cellulaires qui entrainent l’apparition de résistance aux traitements actuellement sur le marché. Pour cela nous étudierons une nouvelle molécule qui interfère avec les changements cellulaires induits par la résistance aux traitements dans le but que le traitement redevienne efficace afin d’éviter les rechutes. L’idée de ces expériences est de traiter la combinaison de cette nouvelle molécule avec les traitements utilisés aujourd’hui afin d’observer une resensibilisation des cellules de mélanome envers ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris, des observations faites in vitro, sur la capacité d'une molécule ciblant le cuivre ainsi que d’autres inhibiteurs du métabolisme du cuivre, à re-sensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra également de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte du système immunitaire et d’évaluer leurs rôles dans la résistance aux immunothérapies. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteurs en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies) et permettre d’ajouter une nouvelle ligne de traitement aux patients atteints de mélanomes résistants aux traitements déjà existants.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome (humaines ou murines). Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini. Ces interventions ne nécessitent pas d’anesthésie et seront effectuées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Au niveau des expérimentations spécifiquement, les nuisances que subiront les animaux seront des contentions pour injecter les cellules tumorales ou les traitements, ainsi que des injections sous cutanées pour les cellules ou des injections intra-péritonéales (dans l'abdomen) pour les traitements. En ce qui concerne la croissance tumorale, la présence de la tumeur grossissante sur le flanc de la souris pourra être une nuisance. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de procéder à l’analyse des tissus et cellules récupérés de la tumeur formée ou des éventuelles métastases.

Remplacement

Pour ces expériences, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité de la molécule ciblant le cuivre dans la resensibilisation de cellules de mélanome résistantes aux traitements utilisés aujourd'hui chez des patients.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique indiquant la quantité minimale d’animaux qui permet d’observer une différence significative. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 1584 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs, les métastases et les organes (comme le foie, la rate ou les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) au sein de l’animalerie et surveillées quotidiennement. L'expérience ne commence qu'après une semaine d'acclimatation à l'animalerie et d'habituation aux expérimentateurs. Les souris seront observées trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est régulier et s'effectue par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure ainsi que la démarche à effectuer en fonction du point limite observé tels que la désinfection d'une plaie ou le changement des points d'injection en cas de gêne ou signes d'infections par exemple.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

48 truies gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour reprendre leur cycle de production dans l'élevage. Elles reçoivent une ou deux prises de sang et une injection de vaccin ou de placebo, avec des effets indésirables possibles au point d'injection et de la fièvre. Le porteur teste l'innocuité chez la truie gestante d'un vaccin déjà autorisé chez le porc en engraissement, en préalable à une étude d'efficacité. Il justifie le recours à l'espèce porcine par le fait que le vaccin lui est destiné.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester l’innocuité de l’administration d'un vaccin inactivé par voie intramusculaire contre Actinobacillus pleuropneumoniae, chez la truie gestante. C'est un vaccin à destination des porcins visant une immunisation active des porcs à partir de 6 semaines d'âge, afin de réduire les lésions pulmonaires et la colonisation des voies respiratoires par Actinobacillus pleuropneumoniae (App) exprimant des toxines. Ce vaccin est administré chez le porcelet en croissance pour protéger les animaux en engraissement contre la toux, la pleurésie et la mortalité liées à cette bactérie. L'innocuité a donc été évaluée pour ce stade physiologique. En effet, ce vaccin dispose d'une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour les porcins et est indiqué pour les porcs en engraissement. La truie infecte les porcelets à partir de l'âge de 2 semaines et ces porcelets infectés propagent l'infection dans le groupe lors de la disparition de l'immunité maternelle, après le sevrage. La transmission se fait par l'intermédiaire des gouttelettes de salive projetées par les animaux porteurs. La sensibilité immunitaire de l'élevage dépend du niveau d'anticorps d'origine maternelle (AOM) pouvant perdurer de 5 à 12 semaines, et de la présence de souches d'App non virulentes à l'origine d'une protection immunitaire croisée. La vaccination des truies, en réduisant la colonisation des voies respiratoires, permettrait de diminuer l'exposition et la contamination des porcelets sous la mère durant la phase d'allaitement. Elle permettrait également de fournir une immunité passive aux porcelets, via des anticorps dans le colostrum, afin de les protéger dans leurs premières semaines de vie, avant l'immunisation active par la vaccination. L'innocuité chez la truie en cas de gestation n'a pas été établie pour ce vaccin. Cette étude sur l'innocuité est préliminaire à une étude d'efficacité, et va permettre de réaliser des tests sérologiques : en effet il n'existe aucune donnée chez la truie concernant la réponse immunitaire en anticorps vis à vis de ce vaccin, et donc le possible transfert d'immunité aux porcelets, via le colostrum.

Bénéfices attendus

Dans le dossier d'AMM, l’innocuité du médicament vétérinaire n’a pas été établie en cas de gestation. En vue d'une utilisation du vaccin sur les truies en cours de gestation, il est nécessaire, avant d'en étudier l'efficacité, d'établir des connaissances sur l'innocuité. C'est l'objet de cette étude.

Procédures

Les prises de sang se feront sur animal vigile. Cette opération sera réalisée une fois, 6 semaines avant mise bas pour le groupe placébo, et deux fois, 6 et 1 semaines avant la mise bas pour le groupe vacciné. La durée maximale d'une prise de sang est d'une vingtaine de seconde. Les injections de vaccin ou de placébo seront faites selon les bonnes pratiques d'injection et durent en moyenne 3 secondes. 48 animaux seront concernés.

Impact sur les animaux

Les prises de sang et la contention sont une source de stress ponctuel pour la truie. Les cas de saignement par le point de ponction sont rares mais pas inexistants. La vaccination qui peut également avoir des effets indésirables sur les truies : rongeur et gonflement au point d'injection, élévation de la température corporelle. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux conformément à la réglementation en vigueur. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie en fin de procédure. Ils continueront leurs cycles de production classiques d'un élevage de porcs.

Remplacement

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine.

Réduction

L'unité épidémiologique est l'animal. Les écarts attendus entre le groupe témoin et le groupe vacciné nécessitent de mener l'étude sur 48 animaux, soient 24 truies par groupe. Des données qualitatives (état de santé des animaux, évaluation du site d'injection) et quantitatives (température rectale, taux d'anticorps) seront comparées entre groupes par des tests statistiques. Le nombre d'animaux pour lequel une prise de sang sera réalisée a été fixé pour représenter l'unité épidémiologique, soient 48 truies.

Raffinement

Les prises de sang seront réalisées par une personne aguerie à ce geste afin que les périodes de contention soient réduites autant que faire se peut. Pour les vaccinations, il est recommandé d'utiliser une contention afin que les injections soient réalisées correctement. Cette contention consistera loger les truies temporairement dans des stalles individuelles, les unes à côté des autres, pour la durée des injections. Les truies seront ensuite libérées. C'est une procédure réalisée classiquement à chaque séance de vaccination dans l'élevage expérimental de Romillé. Parmi les effets indésirables du vaccin chez le porc en croissance sont rapportés une induration, une rougeur ou un gonflement au site d'injection qui se résorbent spontanément, ainsi qu'une augmentation de la température pendant 1 à 2 jours après l'injection. Ce sont des effets indésirables qui arrivent fréquemment lors de la vaccination des animaux et qui feront l'objet d'investigations lors de cette étude. Tout autre symptôme sera également noté. Des soins seront apportés aux animaux dès que nécessaire (antipyrétiques, anti inflammatoires, isolement en infirmerie). En cas d'effets indésirables cumulés ou impactant l'état général de l'animal, la/les truie(s) concernée(s) sera/ont isolée(s) en infirmerie, soignée(s) et sortie(s) de l'étude. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux d'enrichissement, conformément à la réglementation. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Choix des espèces

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine. Les truies seront suivies de 6 semaines avant la mise bas jusqu'à la mise bas. Les vaccinations seront réalisées sur cette période (6 et 3 semaines avant mise bas). La comparaison des effets indésirables et de la réaction immunitaire liés à la vaccination se feront sur cette période. Leurs porcelets à la naissance seront également inclus dans l'étude.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de composés, un stress chronique de trois semaines par glucocorticoïdes dans l'eau de boisson, un gavage d'un marqueur fluorescent ou des jeûnes suivis de repas gras, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever l'intestin. Le porteur étudie la perméabilité intestinale et sa modulation par le stress ou les lipides, à l'aide d'une méthode d'imagerie qu'il présente comme sensible. Sur le remplacement, il affirme que seule une approche in vivo rend compte de la complexité physiologique de l'intestin.

Objectifs

Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans son rôle de barrière intestinale contrôlant l’entrée de nombreux nutriments ou xénobiotiques (adjuvants, médicaments, drogues), potentiellement toxiques ou de microbes, dans le tube digestif tout en permettant une digestion optimale des nutriments. De nombreux cas de stress psychologique ou de fragilités ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale. Elle peut être observée de façon transitoire ou permanente et consiste souvent en un passage paracellulaire, c'est à dire entre les cellules épithéliales, mais parfois aussi par passage par absorption à l’intérieur de ces cellules. Une très faible perméabilité est déjà existante à bas bruit dans le tissu sain, notamment au niveau des cellules caliciformes, productrices de mucus et des cellules M des ganglions lymphoïdes. Nous souhaitons identifier et caractériser la perméabilité paracellulaire sur tissu sain et mesurer l’impact d’un stress sur une potentielle augmentation ainsi que celle de la nutrition standard ou enrichie en graisse, en une prise unique. Cette étude sera menée en parallèle sur épithélium en culture cellulaire et sur l’intestin de souris et utilisant une nouvelle méthode d’étude de la perméabilité paracellulaire par imagerie que nous avons développée. Elle a le mérite d’être sensible et d’identifier quelles sont les cellules perméables dans l’épithélium, de permettre une analyse dans une partie ou dans l’ensemble de l’intestin grêle et colique. C’est une méthode ex vivo sur tissus prélevés après euthanasie ce qui est nécessaire pour une appréhension de la physiologie intestinale tout en limitant le stress et la souffrance des animaux.

Bénéfices attendus

La perméabilité intestinale est mesurée de longue date. Elle peut rester difficile à identifier et localiser précisément dans l’intestin, pour ensuite la relier à des pénétrations tissulaires de nutriments ou xénobiotiques et aux réponses physiopathologiques qui peuvent en découler. Nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie cellulaire qui permet de localiser précisément les régions intestinales perméables, les cellules impliquées, certaines molécules ou organismes pénétrant dans le tissu et leurs modes d’entrée. Ceci nous permet une analyse fine du processus en visualisant les évènements de perméabilité ou la pénétration de composés qui ont eu lieu ex vivo, à l’aide de marqueurs fluorescents visibles à postériori par imagerie des tissus fixés post mortem. Nous nous en servirons pour caractériser les perméabilités intestinales chez des souris en condition physiologique normale, lors d’un stress chronique ou pendant la digestion classique d’un aliment standard ou gras. Les bénéfices attendus sont des mesures précises et reproductibles des perméabilités intestinales paracellulaires ou transcellulaires dans une barrière intacte ou potentiellement fragilisée un stress ou par l’alimentation. Ces expériences permettront une meilleure connaissance et compréhension de ces processus de perméabilité intestinale et de leur analyse expérimentale.

Procédures

Dans une expérience, 36 animaux seront maintenus une fois en contention et recevront une injection en sous cutanée ou en intrapéritonéal de composés non toxiques, d’une durée totale de 30 secondesd'une durée totale de 30 secondes. Dans une autre expérience, une mesure de la perméabilité intestinale in vivo, 24 souris vigiles seront mises à jeun de nourriture mais pas de boisson, soumises à un gavage unique avec un marqueur fluorescent non toxique et enfin, un petit volume de sang sera prélevé dans une durée totale de 30 secondes, à l’aide d’une lancette dans la veine latérale de la queue préalablement anesthésiée. Dans une dernière expérience, 64 souris seront mises à jeun de nourriture mais pas d’eau, pendant 12 heures puis alimentées pendant 1 heure avec des croquettes pauvres ou enrichies en graisse. Elles seront ensuite maintenues sans nourriture pour 3 heures (pic de digestion lipidique par l’intestin, 32 animaux) ou 8 heures pour une fin complète de la digestion lipidique (8 animaux).

Impact sur les animaux

Certains animaux recevront une injection intrapéritonéale ou sous-cutanée unique de composés à des doses pharmacologiques non toxiques qui seront aussi peu stressantes et peu douloureuses. Un stress chronique de 3 semaines sera induit chez certaines souris par addition de faibles doses de glucocorticoïdes dans l’eau de boisson, donc sans contrainte ou intervention directe sur les animaux. Il s’agit d’un stress à bas bruit donc peu contraignant pour les animaux. Certains animaux recevront une administration unique orale par gavage d’une solution fluorescente aqueuse et non toxique, effectué par des expérimentateurs formés. Les animaux auront au préalable été habitués au gavage en vue de réduire le stress que cela pourrait engendrer chez eux. Des prises de sang à la queue seront aussi effectuées par ponction dans la veine latérale de la queue, sous analgésie locale après désinfection. La ponction n'entraine pas de saignement prolongé de l’animal. Ceci permettra de mesurer le passage du marqueur fluorescent depuis l'intestin vers le sang. Ces prises de sang seront effectuées par des personnes expérimentées. A la fin de chaque expérimentation, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour une analyse post mortem de leur intestin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, l’arrêt total du cœur et de la circulation sanguine seront vérifiés et leur intestin sera prélevé.

Remplacement

Seule une approche in vivo d’activation des récepteurs cholinergiques, du stress chronique ou de l’effet d’une digestion physiologique nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique de l’intestin des souris étudiées et de ces régulations nutritionnelles immunitaires, nerveuses et sanguines dans la mesure de la perméabilité intestinale.

Réduction

Pour les expériences 1 (traitement cholinergique) et 3 (digestion lipidique) le nombre d’animaux sera réduit à 8 par condition, pour permettre de s’assurer de la reproductibilité et de la validité scientifique du travail. Pour l’expérience 2 de stress aux glucocorticoïdes, sera effectuée qui nécessitera 12 souris témoins et 12 traitées aux glucocorticoïdes. En effets, des expériences antérieures effectuées dans le laboratoire ont montré que ces nombres de 8 ou 12 animaux sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement solides et fiables dans l’analyse de la perméabilité intestinale in vivo, mais aussi une validation par les expériences d’imagerie ex vivo sur les intestins prélevés.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages transparentes pour ne pas souffrir d’isolement et leur bon état de santé sera suivi journellement par le personnel de l’animalerie. Chaque cage sera agrémentée d’un tunnel en inox pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes. Pour leur confort, un change de litière hebdomadaire sera effectué et l'accès à l'eau sera illimité. L'accès à la nourriture sera aussi illimité, à part certains animaux qui seront ponctuellement mis à jeun de nourriture avant gavage avec un marqueur fluorescent ou avant alimentation par des croquettes témoins ou enrichies en huile. Lors de l’étude de la prise alimentaire de croquettes pendant une heure, les souris seront isolées pour pouvoir quantifier leur prise alimentaire. Elles seront ensuite replacées dans leur cage d’origine. Les interventions sur les animaux (contention, injections intrapéritonéales ou sous-cutanée, gavages et prises de sang à la queue) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des souris, afin de limiter leur stress. Les prises de sang seront effectuées à l’aide d’une lancette sur la veine latérale des queues préalablement anesthésiées et désinfectées. Tout signe de modification du comportement des animaux indiquant un point limite en terme de souffrance physique ou psychique et de perte de poids entrainera l’exclusion des animaux concernés qui seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les expériences seront effectuées sur des souris jeunes adultes de 8 à 12 semaines dont la croissance est terminée et dont le développement physiologique de l’intestin est achevé en utilisant une lignée couramment utilisée pour l’étude de la physiologie intestinale, du stress psychologique et de l’absorption et du métabolisme des lipides et qui montre une barrière intestinale intacte sous régime standard.