Procédures modérées
Régulation par les endocannabinoïdes et la corticostérone des processus de mémoire et de la dynamique du calcium dans les cellules hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
2 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génotypées entre 5 et 12 jours de vie par la coupe de 2 mm de queue et marquées par micro-tatouage des orteils, des gestes qui provoquent selon le porteur un "état de stress et de douleur", elles passent des tests de reconnaissance d'objets nouveaux ou de localisation d'objets, et reçoivent jusqu'à deux injections de corticostérone ou d'autres molécules. Elles peuvent aussi subir une chirurgie d'une heure et demie, scalp ouvert, pour l'implantation d'une canule, d'une fibre optique ou d'un dispositif d'enregistrement. Les traitements des troubles de la mémoire liés au stress viennent plus tard : le projet en "ouvrira ensuite la voie", écrit le porteur. Il juge les cultures cellulaires et les simulations informatiques trop limitées, et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale".
Objectifs
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.
Bénéfices attendus
Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.
Impact sur les animaux
Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.
Remplacement
Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.
Réduction
Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.
Raffinement
Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).
Choix des espèces
Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.
Investigation sur les bienfaits de la phéromone apaisante du lapin (RAP) sur un group de lapins New Zealand (modele experimentale du lapin de compagnie) lors d’evenements stressants
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
40 lapins vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang répétés sur animal vigile, une anesthésie suivie d'une chirurgie, une vaccination, un transport et des tests comportementaux en enclos face à un objet et une personne inconnus. Le porteur teste une phéromone de synthèse censée apaiser le lapin dans des situations stressantes, un produit déjà commercialisé. Il indique que l'étude, portant sur le comportement et la physiologie, doit porter sur des animaux vivants.
Objectifs
Les lapins sont souvent confrontés à des situations stressantes. Le stress exerce des effets qui réduisent la qualité de vie des lapins, pouvant sur le long terme entrainer des problèmes de santé ou des troubles du comportement. Les facteurs de stress potentiels comprennent la manipulation et les stimuli courants qui provoquent la peur. Peu de remèdes sont aujourd’hui disponibles pour aider les lapins à faire face aux différents défis qui pourraient perturber leur bien-être. La copie synthétique de la phéromone maternelle apaisante du lapin (RAP = Rabbit Appeasing Pheromone) reproduit la composition de la substance originale produite par la lapine lors de la mise bas. En condition naturelle, cette substance assure l'attraction des lapereaux au nid tout en étant pour eux un message rassurant et apaisant. Une étude préliminaire menée sur des lapins de production a montré que les animaux traités avec RAP semblaient plus calmes, et une amélioration était observée pour la fertilité, la taille des portées et la viabilité des lapereaux à la naissance. Le produit est actuellement commercialisé sous forme de bloc diffuseur. D’autres formulations (émulsion cutanée ; diffèrent dispositifs de diffusion) sont en cours d’étude pour optimiser la captation des phéromones (molécules volatiles) de la part des lapins. Une application sur la peau permet au lapin d'être diffuseur pour lui-même et pour d'autres lapins voisins ; cette formulation aussi serait à préférer pour la gestion d’un évènement ponctuel. Une application au travers un diffuseur serait plus indiqué pour un traitement à long terme. Le but du projet est d’étudier les effets de la RAP (contre un placebo) dans des conditions de laboratoire contrôlées sur un groupe de lapin représentant un modèle du lapin de compagnie. Nous proposons une étude composée de deux procédures incluant chacune deux situations potentiellement stressantes pour le lapin : 1) l’arrivée dans un nouvel environnement et l’anesthésie pour la réalisation d’une chirurgie ; 2) La vaccination et le transport. Les hypothèses pour chaque situation sont que les lapins traités avec la RAP aient : une meilleure adaptation au nouvel environnement ; une réaction plus calme aux manipulations vétérinaire et une anesthésie et récupération post chirurgie de meilleure qualité ; une meilleure réponse immunitaire après la vaccination ainsi que des manifestations mineures de stress lors du transport.
Bénéfices attendus
En étant une proie, le lapin tende à stresser et paniquer en toute situation qui pourrait représenter un danger pour lui. Qu'ils soient de compagnie, de ferme ou de laboratoire, les lapins domestiques sont généralement exposés à plusieurs sources de stress qui peuvent inclure un changement d’environnement, les manipulations, un transport. Étant donné que les lapins sont très sensibles aux systèmes d’élevage et de gestion, les événements suscitant la peur sont également des facteurs importants à traiter. Le stress et la peur peuvent nuire au bien-être du lapin et provoquer des problèmes de santé et/ou un stress chronique et des réactions agressives envers le propriétaire qui voit sa relation avec son animal se dégrader. Dans un contexte vétérinaire, la peur et le stress prouvé par le lapin sont des facteurs pouvant avoir un impact négatif sur la qualité des soins, de l’anesthésie, la réponse aux thérapies ou la récupération d’une chirurgie. L’utilisation d’un produit capable de réduire les effets négatifs du stress chez le lapin est donc de grand intérêt. Pour ses propriétés, la copie synthétique de la phéromone maternelle du lapin est un outil visant à réduire le stress, aider les animaux à mieux s’adapter aux défis et améliorer le bien-être animal. Les expériences ici décrites ont comme objectif d’étudier les effets de la RAP dans des situations connues pour être stressantes et qui sont souvent vécues par le lapin domestique. Nous nous attendons que les lapins traités avec la RAP aient, selon la situation testée : une meilleure adaptation à un nouvel environnement ; une réaction plus calme aux manipulations vétérinaire et une anesthésie et récupération post chirurgie de meilleure qualité ; une meilleure réponse immunitaire après la vaccination ainsi que des manifestations mineures de stress lors du transport. Le produit sera appliqué sous des formes différentes (en émulsion cutanée ; diffusé dans l’air) selon l’expérience, afin de tester aussi les formulations disponibles et pouvoir conseiller le meilleur produit pour chaque situation.
Procédures
Le projet prévoit la réalisation de prises de sang. Dans la première procédure, 4 prises de sang/lapin (en raison d’un prélèvement tous les 5 jours) sont prévues pour le premier test tandis que 3 prises de sang/lapin (en raison d’un prélèvement tous les 2 ou 10 jours) sont prévues pour le deuxième test. Dans la deuxième procédure, un total de 6 prises de sang/lapin (espacées d’’une semaine) sont prévues pour le premier test ; 3 prises de sang/lapin (en raison d’un prélèvement tous les 4 ou 6 jours) sont prévues pour le deuxième test. Chaque prélèvement dure environ 10 minutes. Dans la première procédure, chaque lapin reçoit une anesthésie suivie d’une chirurgie ; l’ensemble des ces actes dure 30 minutes. Le projet inclus aussi des tests comportementaux effectué dans un enclos neutre (aréna) pour évaluer la réaction du lapin confrontés à des situations potentiellement stressantes. Dans la première procédure, chaque lapin effectue le test 3 fois (en raison d’un test tous les 6 jours). Le test dure 10 minutes : le lapin est seul dans l’aréna (4’) ; le lapin est exposé à un objet inconnu (3’) ; le lapin est exposé à une personne inconnue (3’). Dans la deuxième procédure, chaque lapin effectue le test 1 fois durant lequel il sera seul dans l’aréna pendant 10 minutes. Ces mêmes lapins subiront un transport en voiture d’une durée de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors de la procédure 1 sont :l’hébergement individuelle; la contention pour la réalisation des prises de sang ; les prises de sang sur animal vigile à la veine saphène ; la possible création d’un hématome sur le site du prélèvement ; la réalisation répétée 3 fois d’un test comportementale incluant des tests de nouveauté (lapin seul dans l’aréna ; lapin exposé à un objet inconnu et à un intrus) ; la pesée ; une anesthésie suivie par une chirurgie ; possible douleur due à la chirurgie; injection de produits pour soulager la douleur. Les nuisances attendues sur les animaux lors de la procédure 2 sont : la contention pour la réalisation des prises de sang ; les prises de sang sur animal vigile à la veine saphène ; la possible création d’un hématome sur le site du prélèvement ; la vaccination ; la pesée ; le transport ; la réalisation d’un test comportementale (lapin seul dans l’aréna).
Devenir
A la fin de ce projet, tous les animaux seront réutilisés dans d’autres projets de recherche.
Remplacement
Il s'agit d'une étude de recherche investiguant les effets de la phéromone apaisante de lapin (RAP) sur le comportement, la physiologie et la zootechnie du lapin. En tant qu'étude sur ces trois indicateurs, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants.
Réduction
Il s’agit de procédures expérimentales exploratoires. Pour les premières deux test sur les réactions des lapins à un nouvel environnement et à l’anesthésie les 16 lapins sont achetés pour d’autres finalités scientifiques. Cela évite l’achat d’autres animaux (réduction). La taille de l’échantillon est acceptable pour des résultats statistiques exploitables car les mesures sont répétées. L'etude prevoit 3 types d’observations : comportementales, zootechniques et physiologiques. Pour chacun, les effets « traitement » et/ou « temps » seront évalués à l’aide de méthodes statistiques qui varient selon le plan d’expérience et la nature de chaque variable, quantitative ou qualitative. Pour les tests autour de la vaccination et le transport, 24 lapins seront répartis en 2 groupes de 12 animaux. Ces études sur les effets de la RAP étant exploratoires, nous n’avons pas de données préliminaires permettant un calcul de puissance, néanmoins cet effectif est cohérent avec des données bibliographiques sur des études similaires. Les données seront analysées statistiquement à l’aide de modèles mixtes pour mesures répétées, afin d’évaluer l’effet du traitement, du temps et de leur interaction.
Raffinement
L’hébergement des lapins est conforme aux guidelines pour taille des cages et enrichissement. Les cages seront fournies d’une litière absorbante pour assurer le confort des animaux ; une plateforme/abris (pour se cacher dessous et s’allonger dessus ; du matériel à ronger (exemple : buchettes en bois, boules en osiers). Pour les deux tests où le logement est individuel, les cages seront grillagées et entreposées les unes à côté des autres pour permettre le contact visuel, olfactif et auditif entre les lapins. Pour les autres deux tests, l’hébergement est prévu par couple de lapins socialement compatibles. Les paramètres environnementaux seront adaptés aux besoins des lapins et surveillés (une température ambiante moyenne de 21°C et une photopériode de 12h-12h). Chaque matin et soir les lapins sont contrôlés par le vétérinaire ou le personnel en charge du projet afin de suivre leur santé et bien-être même en week-end. Afin de limiter la réaction de peur des lapins, l’opérateur frappe 3 fois à la porte pour avertir de son entrée dans la salle. Aussi, des séances de socialisation (caresser les lapins dans leur cage en leur offrant des friandises) seront prévues pour limiter la peur des lapins durant la sortie de la cage et des manipulations. Les prélèvements sanguins respectent les guidelines pour volume et fréquence, elles sont effectuées par un vétérinaire et/ou un opérateur expérimenté, toujours en binôme avec un autre operateur formé à la contention. Les prises de sang se feront dans une salle différente à l’élevage, et loin des congénères ; une attention particulière sera portée aux gestes et au ton de la voix qui seront doux et calmes. Une serviette pourra être utilisée pour mieux contenir le lapin, contenir les mouvements brusques et cacher ses yeux pour diminuer ainsi sa peur. Pour peser les lapins, ils seront introduits dans une boite qui est posée sur la balance, donc les animaux ne sont pas du tout contenus. La pesée servira aussi à monitorer la croissance des animaux et détecter d’éventuels problèmes de santé. Le transport sera réalisé dans le calme ; le trajet sectionné ne sera pas très long (environ 30’), inclura des routes peu empruntées et la conduite sera douce. La caisse contiendra une serviette ainsi que du foin. Durant les test comportementaux, l’opérateur est proche et prêt à intervenir à tout moment pour arrêter le test et reconduire l’animal dans sa cage en cas de stress important.
Choix des espèces
La phéromone apaisante testée est la copie synthétique de la phéromone maternelle du lapin. Plus précisément, il s'agit d'une substance apaisante émise par la mère au moment et dans les jours qui suivent la mise bas et qui a pour effet d'apaiser le nouveau-né, de façon espèce spécifique. Pour cette raison nous allons impliquer l'espèce lapin de notre projet. Pour les deux premiers tests (réactions des lapins à un nouvel environnement et à l’anesthésie) les lapins auront 9 semaines (63 à 69 jours). L’âge n'a pas été choisie, on s'est adapté au stade choisi pour d'autres finalités de recherche. Néanmoins ce stade convient aux types d'expériences menées car les lapins représentent un modèle du lapin de compagnie qui arrive dans le nouveau foyer normalement à l’âge de 2 mois. Pour les deux autres tests (réactions des lapins à la vaccination et au transport) les lapins auront entre 5 et 7 semaines ; cela représente un modèle adapté du lapin de compagnie qui normalement est adopté à cette âge et qui est peu après amené chez le vétérinaire pour une consultation ainsi que pour sa première vaccination. Le lapin jeune est préféré aussi pour faciliter son habituation à l’Homme et aux manipulations.
Etudes des propriétés intrinseques des neurones néocorticaux chez trois modèles transgéniques (souris) de maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil au modéré. Des modèles transgéniques de troubles neurodéveloppementaux subissent des enregistrements cérébraux de quatre heures sous anesthésie, des tests de réaction aux sons et au toucher et des administrations par gavage ou injection. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique en garder 540 vivantes pour des expériences ultérieures. Il affirme que le modèle animal est "absolument nécessaire" et qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TN) touchent environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans l'étiologie de ce trouble complexe. Certains TN se caractérisent par des déficiences en matière de communication et d'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes atteintes de ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimuli sensoriels. Cette sensibilité anormale peut avoir un impact dévastateur sur leur vie quotidienne (par exemple, incapacité à porter certains vêtements, à tolérer le bruit ou la lumière dans un centre commercial ou une école) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe aucun traitement permettant d'améliorer la vie de ces personnes. L'objectif de notre projet actuel est de mieux comprendre les processus neurobiologiques qui sous-tendent les défauts de traitement de l'information sensorielle dans les modèles murins de la TN. Nous effectuerons des enregistrements cérébraux et des tests comportementaux afin de tester la capacité de molécules potentiellement thérapeutiques à corriger les défauts de traitement sensoriel dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre la base neurobiologique de l'expérience sensorielle atypique dans les TN (et sa remédiation). Les innovations particulières de notre approche sont (1) l'utilisation d'un système cérébral qui est hautement conservé entre les souris et les humains, fournissant ainsi un système modèle idéal pour les études translationnelles. (2) Nous utilisons une approche thérapeutique basée sur un mécanisme, soutenue par de solides données préliminaires et publiées et par la génétique humaine. Notre proposition aborde un certain nombre de défis importants en suspens dans la recherche sur les TN, y compris la pertinence de développer des approches expérimentales comparables dans les modèles de recherche humains et rongeurs, et le rôle critique des caractéristiques sensorielles altérées dans les TN. De plus, comme les caractéristiques sensorielles sont fortement déterminantes pour d'autres symptômes des TN, toute approche thérapeutique ciblant le traitement atypique de l'information sensorielle a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes de ce trouble.
Procédures
Nous effectuerons des enregistrements cérébraux sur des souris anesthésiées qui recevront une analgésie tout au long de l'expérience pour gérer toute douleur. La durée de cette expérience sera de 4 heures. Nous effectuerons des tests comportementaux pour observer la capacité exploratoire des souris et leur réaction aux sons et au toucher. Les souris seront manipulées et habituées avant ces tests comportementaux. Les tâches comportementales seront effectuées pendant 10 jours, à raison de 20 minutes maximum par jour. Pour certains tests, les souris reçoivent un produit médicamenteux par injection intrapéritonéale ou par gavage. Chaque prise de médicament durera environ 5 seconds.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront à des test de comportement. Certains de ces tests sont légèrement anxiogènes, ou implique une contention de l'animal. Certains animaux reçoivent une drogue expérimentale. Cela implique une injection intraperitonéale ou l'adminsitration par gavage. L'administration par voie i.p. peut provoquer une légère douleur au site d'injection. Le gavage peut conduire à une irritation au niveau de l'oesophage. L'administration d'anesthésique implique également une injection qui est légèrement douloureuse.
Devenir
Pour certaines procédures, les souris seront gardées en vie pour des expériences ultérieures afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans les études futures. Pour les expériences impliquant les enregistrements cérébraux, les souris seront euthanasiées humainement alors qu'elles sont encore sous anesthésie et leur cerveau sera collecté pour un examen morphologique des neurones. Pour les expériences comportementales, les souris seront euthanasiées humainement par une personne formée et selon les méthodes réglementaires approuvées.
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire pour le traitement de l’information sensorielle qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico n’est pas possible à ce jour. Cependant, certaines expériences préliminaires visant à tester le potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées in vitro avant l'application de ces molécules chez l’animal.
Réduction
Pour les enregistrements cérébraux, notre stratégie d’expérimentation nous permet d’effectuer une analyse précoce de nos données au fur et a mesure et de modifier la taille d’echantillon si besoin. Pour les tests comportementaux, la taille de nos échantillons est similaire à celle suggérée par d'autres études similaires. Nous ne pouvons pas utiliser les mêmes souris dans les groupes non traités, administrés avec le véhicule et administrés avec le traitement, car cela aurait pour conséquence que les mêmes souris subissent chaque test comportemental plusieurs fois, ce qui pourrait confondre nos résultats comportementaux, comme cela a été rapporté dans plusieurs études précédentes. Il s'agit d'une considération particulièrement importante dans nos tests, car nous examinerons l'accoutumance sensorielle, qui pourrait être affectée par la répétition des mêmes tests sur les souris plusieurs fois. En outre, nous effectuerons certaines études pilotes pour tester, a priori, la faisabilité technique de certaines manipulations. Cela nous permettra de poursuivre nos études dans les meilleures conditions expérimentales, afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans l'ensemble de notre étude.
Raffinement
Avant expérimentation: Surveillance quotidienne et vérification de l’état de l’animal (posture, comportement, vivacité, état de pelage). Pendant les enregistrements cérébraux: Le séance d'enregistrement se fait sous anesthésie générale. Le mélange anesthésique utilisé a une action analgésique. Un crème ophtalmique est appliqué aux yeux. L'animal est maintenu sur tapis chauffant. Durant la séance d’enregistrement la température de l’animal est contrôlée grâce à une sonde rectale. Pour les enregistrements longs: injection s.c. d'une solution physiologique. Réduire au maximum l’angoisse : Hébergement de manière à correspondre aux besoins de l’animal – mise à disposition du matériel pour la construction d’un nid. Utilisation d'un tube de transfert afin de limiter le stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur.
Choix des espèces
Ce modèle (la souris) a été choisi car les rongeurs ont un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, la souris est actuellement la seule espèce de mammifère dont il est possible de modifier le génome en routine pour créer des modèles de maladies humaines. 4 à 16 semaines, selon le type de manipulation prévu. Justification : Nous nous appuyons sur des études antérieures réalisées au sein de notre laboratoire ou de celui de nos collaborateurs pour définir les meilleures conditions expérimentales afin d'assurer le bon déroulement de nos expériences.
Evaluation de l’efficacité d’un composé dans un modèle de migraine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de peptides déclenchant des symptômes migraineux et une hypersensibilité à la lumière, mesurée par un test de boîte claire et obscure, et peuvent subir jusqu'à 34 prélèvements sanguins en 28 jours. Le porteur veut cribler des molécules contre la photophobie migraineuse pour développer des traitements chez l'homme. Il affirme que la migraine reste difficile à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est une maladie neurovasculaire qui affecte plus de 12% des adultes. Elle se caractérise par d’intenses céphalées, résultantes d’une hyperexcitabilité neuronale. Ce phénomène de suractivation neuronale est lié à des facteurs génétiques complexes associés à des facteurs environnementaux, et s’accompagne fréquemment d’une hypersensibilité au bruit et à la lumière (photophobie). Plusieurs neuropeptides ont été mis en évidence comme ayant un rôle crucial dans le déclenchement des migraines. Les taux dans le sang de certains peptides se voient nettement augmentés lors de migraines. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces peptides pour modéliser la migraine chez la souris et l’évaluation de l’état migraineux est suivi par la mesure de l’hypersensibilité à la lumière dans un dispositif de boite claire et obscure. Le test est basé sur la possibilité laissée à l’animal de choisir de rester dans un compartiment peu éclairé par rapport au second compartiment fortement éclairé. Ainsi un traitement induisant une hypersensibilité à la lumière ou photophobie, ici l’utilisation des peptides CGRP, PACAP38 ou VIP chez la souris, causera une diminution de l’exploration du compartiment lumineux. Ainsi dans ce projet, nous allons utiliser ce modèle comme un outil d’évaluation des nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la migraine.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui seraient capables d’agir sur la photophobie induite chez des souris et ainsi de développer des traitements contre les céphalées migraineuses chez l’Homme.
Procédures
Dans ce projet, un animal subira au maximum 3 tests comportementaux (d’une durée de 20 à 30 min chacun). De plus les animaux subiront un maximum de 6 injections de peptides et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). En cas une injection intraveineuse, elle dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations (Per-Os, IP, SC, IN et IM), la durée est de moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 34 prélèvements sanguins sur la période de 28 jours en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, une baisse de l’activité locomotrice peut être attendue à la suite du traitement avec le peptide inducteur des symptômes migraineux. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. De plus les administrations peuvent induire une douleur localisée et passagère.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
La migraine est un trouble neurovasculaire complexe, dont l’origine et les mécanismes ne sont que partiellement appréhendés. Il implique diverses structures cérébrales, nombreux vaisseaux sanguins intracrâniens et nerfs sensoriels. Cette synergie reste difficile à modéliser in vitro. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet font l’objet, autant que possible, d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 animaux. Toutefois l’effectif pourra être amené à n = 20 par groupe. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi, plusieurs mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion d’une phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) à l’arrivée des animaux, avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement comporte un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. L’éclairage de la salle de comportement est atténué. Les animaux sont anesthésiés pour les traitements par voie intraveineuse et pour les prélèvements sanguins. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à un mal-être ou une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).
Nitrites et cancer colorectal : effets de la diminution ou du retrait des nitrites dans les charcuteries sur les paramètres fécaux et urinaires associés au cancer colorectal dans un modèle rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime contenant de la charcuterie pendant dix-huit jours puis passent jusqu'à 48 heures seuls en cage à métabolisme, source de stress, pour recueillir urines et fèces. À l'issue, le porteur indique que 150 rats seront adoptés, environ 250 réutilisés en formation et le reste tué. Il affirme qu'aucune étude in vitro ne permet d'évaluer l'effet des nitrites sur l'"organisme entier".
Objectifs
Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les additifs nitrés (nitrites et nitrates) sont utilisés dans les charcuteries pour limiter le développement de bactéries pathogènes mais aussi pour retarder la date limite de consommation. Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viandes. Les études épidémiologiques et celles réalisées chez le rat montrent que ces additifs nitrés et le fer héminique pourraient être responsables de cet effet néfaste, car pendant la digestion, ils favorisent la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de la diminution ou du retrait des additifs nitrés dans les charcuteries sur la formation des composés toxiques. Les doses de nitrites et nitrates seront choisies pour évaluer l’effet d’une diminution importante de l’utilisation de ces additifs dans les charcuteries les plus consommées en France. Les charcuteries représentatives des 20 charcuteries les plus consommées seront produites avec quatre doses d’additifs nitrés : la dose actuellement utilisée dans la production des charcuteries, deux doses plus faibles et une charcuterie sans additif. En plus d’un groupe sans charcuterie, l’effet du retrait ou de la diminution des additifs nitrés sera testé en ajoutant ces différentes charcuteries à la ration des rats. Dans ce projet, 800 rats seront nourris avec un régime contenant ou non de la charcuterie pendant 18 jours. Leurs urines et leurs fèces seront récupérées. Ces échantillons permettront des mesures des produits toxiques formés pendant la digestion de ces charcuteries contenant un gradient d’additifs nitrés.
Bénéfices attendus
L’objectif est d’identifier une dose d’additifs nitré la plus basse possible afin de préconiser des doses faibles voire nulle d’additifs dans les charcuteries. Ainsi cela aurait comme bénéfice de proposer un levier de prévention du risque du cancer colorectal associé à la consommation de charcuterie.
Procédures
Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h, tous les rats seront hébergés en cage individuelle spécifique pendant maximum 48h en continu. Les rats seront en habituation pendant 3h dans ces mêmes cages la veille. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toute la production de 24h en fèces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h à J17 et J18. Les rats ne sont pas manipulés.
Impact sur les animaux
Le projet comporte un passage en cage spécifique pendant 48h (après 3h d’habituation) ce qui peut générer du stress chez le rat (rat isolé). Nous sommes très attentifs au suivi des animaux pendant cette période (ouverture d’une fiche de suivi sanitaire scoré avec 9 points de contrôle en 2.5 jours). Pour compléter, nous réaliserons une mesure de la consommation alimentaire et d’eau de boisson le deuxième jour et une mesure de poids corporel.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux rentreront dans un processus de don après une période de 7 jours d'adaptation à une alimentation conventionnel, afin que - 150 rats maximum soient adoptés via une association d'adoption d'animaux. - qu’environ 250 rats soient réutilisés lors de formation. - Le reste des animaux sera euthanasié.
Remplacement
Aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions des doses de nitrites dans les charcuteries d'un organisme entier, sur la physiologie, sur le métabolisme et sur les formations des composés toxiques au niveau de la lumière colique. Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l’écosystème colique.
Réduction
Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, pour ces études nutritionnelles, sur la base un test statistique, le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=8 animaux/lot) et la durée de l’étude au maximum (18 jours). Notre expérience, nos publications et une analyse statistique montrent que ce nombre de 8 animaux par lot est nécessaire pour observer un effet sur les indicateurs précoces du cancer colorectal.
Raffinement
L’environnement des rats sera enrichi avec une niche. Les cages utilisées seront transparentes pour maintenir un contact visuel et le suivi sanitaire sera plus fréquent. Pour les interventions potentiellement stressantes (hébergement individuelle pendant 48h), les rats seront habitués au préalable. Les interventions des opérateurs seront minimales hors observation sanitaire, de manière à les maintenir dans un lieu d’hébergement le plus calme possible.
Choix des espèces
Le rat Fisher est un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en charcuteries et pour étudier le rôle des nitrites et du fer héminique. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particulier ceux de l'appareil digestif et l’écosystème colique L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces études précédentes, il est important de rester au même stade de développement.
Étude anatomo-fonctionnelle du noyau arqué et de ses connexions dans la perturbation des rythmes circadiens liée à un régime alimentaire hypercalorique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques et des injections dans le foie, un régime hypercalorique et un isolement social de deux semaines décrit comme un stress important, ainsi que des prélèvements sanguins répétés. Le porteur veut cartographier les connexions cérébrales impliquées dans les troubles du rythme alimentaire liés à l'obésité. Il affirme que ces interactions ne peuvent pas être étudiées sur organes isolés ou cultures cellulaires.
Objectifs
Des perturbateurs extérieurs comme une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez l’homme tout comme chez les souris, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi une altération des rythmes circadiens dont le rythme de prise alimentaire, perturbation qui à son tour favorise la prise de poids. Ce projet propose d’étudier le réseau de connexions cérébrales de certaines structures impliquées dans ces altérations ainsi que de leurs connexions avec des organes périphériques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, comme le foie. Grâce à ses connexions privilégiées avec les noyaux suprachiasmatiques (NSC), siège de l’horloge circadienne principale, et les afférences viscéro-sensorielles en provenance des organes en lien avec la prise alimentaire comme le foie, le noyau arqué (ARC) de l’hypothalamus est un candidat de premier ordre dans la recherche d’un centre intégrateur des informations circadiennes dont l’activité serait perturbée par une alimentation hypercalorique. Ce projet aura donc pour objectifs 1) de mettre en évidence les connexions cérébrales de ARC ainsi que ses connexions avec le foie, organe majeur dans la prise alimentaire et 2) étudier les différences d’activité de ces réseaux lorsque l’animal suit un régime hypercalorique.
Bénéfices attendus
L’étude de l’implication de ARC dans la perturbation des rythmes de prise alimentaire liée à une alimentation hypercalorique apportera des connaissances essentielles pour mieux comprendre les désordres alimentaires pouvant être à l’origine de maladie métaboliques telles que le diabète et l’obésité, et potentiellement permettre d’améliorer la prévention et le traitement de ces physiopathologies.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des procédures chirurgicales (chirurgie stéréotaxique et injections dans le foie et la ganglion jugulaire noueux). Une partie des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 semaines. Cette même procédure nécessitera un isolement des animaux pendant 2 semaines. Enfin, les prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire auront lieu deux fois par semaine pendant deux semaines.
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l’objet même du modèle expérimental. Les différentes chirurgies peuvent induire de la douleur postopératoire modérée, un inconfort et/ou une inflammation locale transitoire au niveau des sutures. L’isolement social de deux semaines peut créer un stress important aux animaux. Les prélèvements sanguins peuvent induire une hémorragie, une douleur transitoire aiguë et/ou une inflammation locale.
Devenir
La mise en évidence des connexions cérébrales de ARC et de ses connexions avec le foie, ainsi que l’étude de l’effet d’un régime HFD sur la rythmicité de la prise alimentaire et sur le recrutement de ces réseaux de connexions impliquent la mise à mort des animaux pour prélever les différents tissus.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant un grand nombre d’organes différents (cerveau, foie mais aussi pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite donc l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 25 et 30 souris pour les investigations neuroanatomiques et de 40 souris par sexe pour le comportement. Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en obtenant le maximum d’informations scientifiques pour chaque animal. Pour les procédures d’investigation anatomique des réseaux neuronaux, la difficulté est d’avoir une efficacité d’infection virale suffisante et des injections très précises tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Pour ce faire, ces procédures ne seront réalisées que chez les mâles, aucune différence anatomique et neuroanatomique n’ayant été mise en évidence par la littérature dans les différentes régions ciblées par ce projet. Les animaux utilisés pour pratiquer les injections dans le ganglion noueux jugulaire seront également utilisés pour pratiquer les injections dans le foie. Enfin, la combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvements sanguins, de suivi de consommation alimentaire et d’évolution du poids des animaux permettra de ne générer qu’une cohorte de souris par sexe pour répondre à plusieurs questions scientifiques.
Raffinement
Tout au long des expériences, les animaux isolés ou non sont hébergés dans un milieu enrichi (matériel de nidification, bâton de bois et tunnel) et observés quotidiennement par l’expérimentateur ou une personne compétente de façon à optimiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors de l’isolement, de même qu’à la suite des prélèvements sanguins, des grilles de score, évaluant essentiellement l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, seront utilisées. Elles permettront d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. La vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pendant et après la chirurgie. De plus, en complément de la grille de score du suivi de l’isolement social, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale, ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elles pourraient être intégrées dans nos procédures.
Choix des espèces
La souris est devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable dans l’utilisation des nouveaux outils technologiques permettant entre autres l’enregistrement en temps réel et la manipulation des réseaux neuronaux, qui sont des techniques envisagées pour la suite de ce projet. L’étude de la neuroanatomie et des comportements nécessitant des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Conséquence d’un traitement aux glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections, des gavages pouvant causer des fausses routes et, pour une partie, une castration chirurgicale, les traitements aux glucocorticoïdes pouvant entraîner une fonte musculaire et une perte de poids de 20 %. Le porteur étudie le rôle controversé des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate résistant à la castration. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre cellules tumorales et cellules voisines.
Objectifs
Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par des anti-androgènes aussi appelée castration chimique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. Les glucocorticoïdes, une autre hormone qui se lient aux récepteurs des glucocorticoïdes, sont utilisés avec succès en combinaison avec les anti-androgènes depuis de nombreuses années, car ceux-ci atténuent les effets secondaires et potentialisent les traitements anti-androgène. Toutefois, l’utilisation des glucocorticoïdes dans le traitement du cancer de la prostate, est devenu un sujet controversé car le récepteur aux glucocorticoïdes pourrait également jouer un rôle dans la progression de la tumeur. Nos données préliminaires obtenues à l’aide des modèles murins de cancer de la prostate vont dans ce sens et montrent que : - Le récepteur des glucocorticoïdes est présent dans les cellules cancéreuses et les cellules avoisinantes - Le récepteur des glucocorticoïdes est important dans l’initiation du cancer de la prostate. Il devient donc urgent de mieux caractériser le rôle des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration.
Bénéfices attendus
Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate localement avancé et métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes par déprivation androgénique. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires lors de la déprivation androgénique). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre l’impact des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la déprivation androgénique. Cette étude est importante afin de définir le rôle favorable ou défavorable d’un traitement aux glucocorticoïdes sur le développement du cancer de la prostate.
Procédures
•Dans un premier temps, 1760 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris) afin d’inactiver le gène d’intérêt. 1, 3, 6, 9, et 12 mois après l’inactivation du gène, les souris seront traitées avec des glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements. •Dans un second temps, 1280 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris). 640 souris seront castrées chirurgicalement et 640 seront uniquement ouvertes sans castration (groupe contrôle (Sham)) (3 mois ou 9 mois après inactivation du gène d’intérêt). Cette intervention dure environ 10 minutes pour chaque souris.7 jours après opération : les souris castrées ou non seront traitées avec glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements.
Impact sur les animaux
Les souris de cette étude sont exposées à des nuisances : lors de leurs gavages, des différentes injections ainsi que lors de la chirurgie et le développement d’une tumeur. En effet, les souris sont sujettes à un stress physique lors de la contention, et des lésions et/ou douleurs lors des différentes procédures. Le grossissement de la tumeur peut également générer un inconfort qui sera contrôler par palpation de la prostate et observation de l’apparence générale de la souris. Des effets indésirables peuvent également être observés lors de ces différentes manipulations : - Le gavage peut conduire à des fausses routes. - La chirurgie peut induire une hémorragie en cas de mauvaise ligature des artères et une infection post opératoire. - Les injections peuvent entrainer une infection. - Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de poids de 20%, qui par conséquent pourrait altérer le bien-être des animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure expérimentale définie dans ce projet, l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie que nous utilisons habituellement au laboratoire. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle des glucocorticoïdes le développement du cancer de la prostate et la résistance aux traitements utilisés actuellement. Les communications entre les cellules avoisinant la tumeur comme par exemple les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A noter que le récepteur aux glucocorticoïdes est exprimé dans les cellules cancéreuses prostatiques mais également dans les cellules avoisinant la tumeur. Ceci implique donc qu’un traitement aux glucocorticoïdes agit sur les deux compartiments cellulaires. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. En effet, il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. Par ailleurs une étude pilote sera réalisée afin d’éviter d’utiliser un protocole d’injection de glucocorticoïdes non adapté, et ne nous permettant pas d’apporter de conclusion. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).
Raffinement
Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler l’apparence générale de la souris, sa posture et son comportement tout au long de leur vie. Concernant la partie chirurgicale, les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Afin d’analyser le bien-être animal, les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité et palpation abdominales. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’histologie de la prostate murine et humaine est similaire. -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses dont certaines seulement évoluent en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme, ce qui est crucial pour la mise en oeuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Les traitements pour induire la mutation se feront à 8 – 10 semaines d'âge et les animaux seront mis à mort comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle des glucocorticoïdes à tous les stades de la maladie. Concernant la partie castration, uniquement deux temps de cinétique ont été choisis, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (un temps précoce et un temps plus tardif).
Evaluation de thérapeutiques innovantes dans des modèles de leucémie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques, des traitements et une radiothérapie qui peut provoquer diarrhées et saignements digestifs, avant d'être tuées pour des prélèvements d'organes. Le porteur décrit une évaluation de médicaments avant passage chez l'homme, bénéfices situés au long terme. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que l'animal constitue un passage "indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de leucémie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testés sont actifs dans un modèle de cancers du sang et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouvelles thérapeutiques pour traiter ce type de cancers.
Procédures
Greffe de cellules tumorales (durée de l'injection inférieur à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur ces cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage indispensable pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 3 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Étude de l’importance du GM-CSF sécrété par les NK dans un contexte de réponse anti-tumorale induite chez la souris, par une double thérapie comprenant un inhibiteur de point de contrôle immunitaire et anti-angiogénique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale en sous-cutané, qui peut réduire leur mobilité et provoquer des nécroses cutanées, puis huit injections de traitement, avant d'être tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions. Le porteur cherche à valider le rôle antitumoral d'une molécule produite par les cellules NK, en s'appuyant sur un modèle transgénique. Il affirme que la complexité du cancer ne peut s'appréhender que dans un organisme vivant.
Objectifs
Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et permet la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients. Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie, de nombreux essais cliniques visent à l’utiliser en combinaison thérapeutique avec d’autres traitements tel que les anti-angiogéniques. L’angiogenèse permet la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et permet d’apporter de l’oxygène et des nutriments aux tumeurs en expansion. Cibler l’angiogenèse permet d’une part de normaliser les vaisseaux sanguins et d’améliorer l’infiltration en cellules immunitaires des tumeurs, puis également de limiter la croissance tumorale en privant les cellules tumorales de nutriments et d’oxygène. Dans une étude précédente, nous avons montré que cette combinaison thérapeutique ralentit la croissance tumorale dans des modèles de cancer colorectaux chez la souris. Les mécanismes mis en place nous suggèrent que les cellules tueuses naturelles (NK) jouent un rôle anti-tumorale clé en produisant du GM-CSF. Le GM-CSF est une molécule qui a un rôle anti-tumoral et qui stimule le système immunitaire. Afin de valider nos hypothèses, nous souhaitons utiliser un modèle de souris transgénique dans lequel les NK des souris ne produisent pas de GM-CSF. Le but de ce travail est donc de valider nos observations qui sont les suivantes : les NK produisent du GM-CSF qui a un effet anti-tumoral en induisant la maturation et le recrutement d’autres cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur le cancer colorectal où les solutions thérapeutiques sont malheureusement insuffisantes. Nous espérons apporter des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du GM-CSF produit par les NK dans une réponse anti-tumorale induite par un traitement anti-cancéreux. A l’heure actuelle, aucune étude n’a montré ce rôle dans le cancer.
Procédures
Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 7 jours plus tard, 8 injection Intrapéritonéale (IP) de 10 secondes, réparties sur une semaine et espacées de deux jours.
Impact sur les animaux
L’injection des tumeurs en sous-cutanée pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Une perte de poids pourrait être observé. En réalisant des injections sous-cutanées, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Aucun effet indésirable n’est attendu pour les traitements.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Nous utiliserons toutes les souris disponibles issue des croissements : mâles et femelles. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Les souris seront élevées dans un milieu enrichi. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections de traitements seront réalisées sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Si nous constatons un problème tel que la perte de poids excessive, une nécrose tumorale, une déshydratation, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Disponibilité de modèle génétiquement modifié pertinent dans le projet scientifique : aucune autre espèce animale présente la même modification génétique. Les modèles tumoraux syngéniques existant sont utilisables chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.
Rôle de la signalisation d’une protéine dans les propriétés de migration, invasion et métastase tumorale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéprimées reçoivent une greffe de mélanome humain, une résection de la tumeur et des traitements, avec un suivi par imagerie, avant le prélèvement des organes. Le porteur indique vouloir caractériser une protéine limitant l'invasion métastatique, retombée pour les patients formulée au conditionnel. Il affirme que seul le modèle animal reproduit la complexité de la métastase du mélanome.
Objectifs
Le laboratoire a identifié une protéine comme régulateur des métastases de mélanome, cause principale des décès liés à cette maladie. Plus précisément, cette protéine diminue les capacités invasive et migratoire des cellules, diminuant le potentiel métastatique de la tumeur. Ce projet cherche donc à caractériser les effets de notre protéine sur la migration, l’invasion et les métastases de mélanomes, permettant à terme d’améliorer la prise en charge thérapeutique de cette maladie.
Bénéfices attendus
Le mélanome métastatique est particulièrement létal : à ce jour, le taux de survie à 5 ans de cette maladie est de 22,5%. L’objectif est de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans les mécanismes de migration et d’invasion métastatique du mélanome. Des résultats préliminaires montrent que notre protéine inhibe les capacités migratoires et invasives du mélanome métastatique. Ainsi, promouvoir l’expression et/ou l’activité de cette protéine dans la tumeur pourrait être bénéfique pour améliorer la survie des patients.
Procédures
Lors de l’implantation tumorale nous réalisons une anesthésie en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée (20 secondes). Lors de la résection tumorale nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes), puis nous réalisons la résection tumorale (3 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Les traitements sont réalisés par voie intrapéritonéales (2 secondes). . Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères.
Devenir
En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques
Remplacement
La migration et l’invasion peuvent être étudiées via des modèles in vitro, mais celles-ci ne peuvent récapituler aussi fidèlement les métastases du mélanome observées in vivo. L’environnement tumorale, notamment vasculaire et immunitaire étant absent, aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité de la métastase du mélanome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. La souris est un animal très adapté à ce travail avec une littérature validant ce choix.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 520 souris maximum seront nécessaires pour cette étude.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficieront d’un enrichissement adapté. Des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle immunodéprimé (NSG) permettant le développement de mélanomes humains. L’utilisation de ce modèle va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animal très proche de ceux rencontrés chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par bioluminescence et de mieux visualiser les métastases. Nous utiliserons des souris de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Contrôle d’inactivation des vaccins antirabiques
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
10 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de l'anesthésie sans réveil au niveau sévère. Sevrées, elles reçoivent une injection intracérébrale du vaccin antirabique à contrôler et, en cas d'inactivation incomplète du virus, peuvent développer des signes de rage comme la prostration et la paralysie. Le porteur décrit un test libératoire réglementaire de contrôle qualité et indique que le nombre de souris par groupe est fixé par la pharmacopée. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible aujourd'hui, tout en signalant que des tests in vitro sont en développement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de s’assurer de l’inactivation des vaccins antirabiques destinés à l’Homme au travers d’un test de contrôle qualité assurant ainsi la mise sur le marché de lots de vaccins conformes aux normes de sécurité et d’activité. Ce test de contrôle qualité est un test libératoire réglementaire qui est réalisé pour vérifier que le vaccin est sans risque pour le patient avant leur commercialisation"
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mettre à disposition des lots commerciaux de vaccins antirabiques sûrs et efficaces pour protéger les populations contre le virus de la rage.
Procédures
Toutes les souris utilisées dans le projet subissent une injection intracérébrale sous anesthésie gazeuse, suivie d’une euthanasie à la fin de la période de test (21 jours). L’anesthésie dure environ 1 minute, l’injection intracérébrale dure environ 3 secondes et l’euthanasie est instantanée. L’observation clinique quotidienne réalisée ensuite dure environ 30 secondes par cage (qui contient 5 à 6 souris) mais ce temps peut être raccourci en fonction du nombre de souris contenues dans la cage. Dans le cadre d’investigations (cas clinique suspectant la présence de virus rabique), des ré injections de broyats sont réalisés (1 minute 30 par souris). Le vétérinaire sanitaire ainsi que le responsable de l’activité sont informés dès que l’état de santé d’une souris se dégrade.
Impact sur les animaux
- Injection intracérébrale sous anesthésie gazeuse, - Dans le cas rare d’inactivation incomplète du virus, des signes typiques de la rage (tels que la prostration, l'hypoactivité et paralysie) peuvent apparaître au cours du tests. Il sera alors réalisé des investigations comme décrit dans la procédure N°4 soit la ré inoculation d’un broyat de cerveau en voie intracérébrale.
Devenir
Euthanasie de toutes les souris, car la réutilisation des animaux est impossible suite à l’injection d’échantillon à contrôler.
Remplacement
Pas de remplacement possible actuellement :il est nécessaire d’utiliser des souris pour détecter une éventuelle présence de particules rabiques actives dans les échantillons testés. Cependant, des tests in vitro sont en cours de développement pour la fabrication de vaccins antirabiques de nouvelle génération et devraient se substituer aux tests in vivo actuels dans les années futures
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour la qualification des techniciens est le même que pour un test en situation réelle. Par soucis de réduction d’animaux, pour la requalification le nombre de souris est à minima divisé par quatre par rapport à un test en situation réelle. Le nombre de souris par groupe engagées dans les tests est défini par la réglementation et ne permet pas de réduire au-delà
Raffinement
Pour les procédures où des effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures Les souris sont hébergées en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement varié, tels que des Dome-Home (petits abris cartonnés, matériels de nidification, roue, morceaux de bois à ronger) dans des locaux appropriés à leur espèce et conformes à la réglementation
Choix des espèces
L’espèce « souris » est une espèce sensible au virus rabique. Elle est décrite comme modèle de prédilection dans la pharmacopée européenne et dans les rapports techniques de l’OMS (organisation mondiale de la santé) pour la fabrication des vaccins rabiques. Les souris sont toutes utilisées juste après le sevrage (12-15g), stade de développement où les souris sevrées sont les plus sensibles au virus rabique et où l’inoculation en intracrânien peut se faire aisément, sans dommage pour l’animal. C’est le stade d’utilisation recommandé dans les rapports techniques de l’OMS pour les vaccins.
Implication des cellules lymphoïdes innées dans l’hépatocarcinome.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique, des injections répétées et un suivi de la tumeur du foie par imagerie, jusqu'à un point limite au-delà duquel elles peuvent maigrir, s'isoler ou devenir agressives. Le porteur situe les retombées cliniques à long terme et au conditionnel. Il affirme que l'utilisation des souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement tumoral.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier des cellules du système immunitaire, les populations lymphoïdes, afin d’identifier celles qui sont impliquées dans le contrôle du développement des cancers du foie. Nous souhaitons également dans ce projet étudier le rôle de deux voies de signalisation cellulaire dans la fonction de ces populations cellulaires. Nous espérons ainsi définir clairement les différentes populations lymphoïdes impliquées dans le développement du cancer du foie et mettre en évidence un rôle déterminant des voies de signalisations dans leurs fonctions au sein de la tumeur. Nous espérons à l’aide de ces premiers résultats, qui seront complétés par des expérimentations in vitro, pouvoir améliorer l’efficacité des cellules lymphoïdes à l’encontre des cellules cancéreuses du foie afin de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.
Bénéfices attendus
Premièrement, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du développement du carcinome hépatocellulaire et du rôle joué par les populations lymphoïdes. Ensuite, ce projet nous permettra également de connaître le rôle de deux voies de signalisation cellulaire majeures dans la fonction des cellules lymphoïdes innées à l’encontre des cellules cancéreuses. Enfin, nous espérons démontrer qu’il est possible d’améliorer la fonctionnalité de ces cellules lymphoïdes innées grâce à la modulation de ces voies de signalisation et ainsi proposer une ou des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie. Les résultats obtenus grâce à ce projet, pourront permettre d’explorer par la suite cette ou ces approches pour une application en clinique en vue d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Ainsi à long terme, ces expérimentations s’inscrivent dans une recherche visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.
Procédures
Les souris pourront subir une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique sur une hauteur de 2cm environ. Cette procédure chirurgicale aura lieu une seule fois et durera environ 30minutes. Les souris pourront recevoir des injections en intrapéritonéale, cette procédure dure quelques secondes et l’animal est contentionné pendant moins d’une minute. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par jour durant toute la durée de l’expérimentation. Les souris pourront recevoir des injections en intraveineuse. Pour cela la souris est contentionnée durant 2-3 minutes et l’injection dure quelques secondes. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par semaine durant 7 semaines. Un prélèvement sanguin au niveau sub-mandibulaire pourra être réalisé une seule fois. Cette procédure dure moins d’une minute. Le suivi de la pousse tumorale chez les souris sera réalisé par imagerie. Pour cette procédure, les souris devront être immobilisées durant environ 30min et la procédure sera réalisée au maximum 14 fois durant toute la durée de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
Les animaux ne présentent habituellement aucun signe de souffrance avant que la tumeur atteigne la taille que nous avons fixé comme point limite. Il est alors possible que les animaux commencent à montrer des signes de stress physique et comportementale. D’un point de vue comportemental, les souris peuvent acquérir un comportement asocial, voir agressif ce qui n’est pas le comportement habituel de l’espèce. Nous pouvons observer aussi un arrêt de la toilette et possiblement une dépilation volontaire signe d’une détresse. D’un point de vue physique, nous pouvons observer un amaigrissement, notamment au niveau du bassin de l’animal, signe d’une perte d’appétit de l’animal lié à une détresse causée par une taille de tumeur importante. L’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution peut entrainer une douleur transitoire. Les autres injections par voie intrapéritonéale ou intraveineuse n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront développé une tumeur.
Remplacement
Dans la mesure du possible, les études que nous menons sont réalisées dans des modèles in vitro de cultures cellulaires. Cela nous apporte de nombreux éléments qui nous permettent d’affiner nos hypothèses ou d’en émettre de nouvelles. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement tumoral afin d’étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses précises à nos problématiques de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. Une veille scientifique continue sera également effectuée, afin d’éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire leur nombre autant que possible, tout en permettant d’identifier des effets biologiques suffisamment fiable, évalués par des analyses statistiques valides. Nos calculs ont pris en compte la variabilité interindividuelle ainsi que l’effet attendu. Afin d’améliorer la relevance de ces résultats, nous avons décrit trois modèles permettant d’induire un cancer du foie. Ces modèles ne seront pas réalisés de manière concomitante. Ainsi, bien évidemment, si une hypothèse est invalidée dans le premier modèle étudié, elle ne sera pas testée dans les autres modèles afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leur stress au cours de la procédure. Une fiche de suivi sera tenue, de manière journalière la semaine suivant l’induction de la tumeur puis de manière tri-hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure afin de vérifier l’état général des animaux et de prévenir toute souffrance évitable. Les animaux bénéficient des conditions normales d’hébergement et de soins de notre animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit, enrichissement des cages, nourriture à volonté). Toutes les souris en expérimentation possèderont du coton dans les cages en tant qu'enrichissement. De plus, dès que les souris commenceront à présenter une perte de poids détectable, de la nourriture en gel ou des crochets humides seront ajoutées dans leur cage. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation contraignante ou invasive sera réalisée sous anesthésie générale par voie gazeuse et la douleur sera prise en charge par administration d’antalgiques. Lors des chirurgies, le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure en évaluant les réflexes et la respiration. Pour prévenir une potentielle baisse en température, les animaux seront placés sur un coussin chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours des procédures. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, une mise à mort anticipée de l’animal sera réalisée.
Choix des espèces
Pour le moment, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement adéquat pour étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses à notre problématique de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. De plus, l’existence de lignées de souris transgéniques permet des études mécanistiques approfondies qui nous permettront de mieux décrypter les voies de signalisation impliquées dans la fonction des cellules lymphoïdes et ainsi dans le contrôle de la progression du cancer du foie. Par ailleurs, il est à noter que le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, au niveau des composants moléculaires et cellulaires, ce qui nous permet d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans le processus tumoral, et d’envisager par la suite un transfert de technologie chez l’homme. Pour ce projet, les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6 à 12 semaines afin d’être proche de la situation de la pathologie humaine. Les souris présenteront ainsi un système immunitaire pleinement fonctionnel.