Procédures modérées

12 000 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au métronidazole pendant dix jours puis à des molécules à tester, avec quatre anesthésies et quatre tests comportementaux, pour cribler cinquante molécules candidates contre la sclérose en plaques. Le porteur estime la mortalité prématurée à environ 10 % pour le développement et 10 % pour l'exposition au métronidazole, et certaines doses peuvent être toxiques. Il justifie le recours au têtard par sa transparence et par le grand nombre d'individus que produit l'espèce.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurologique et inflammatoire, c’est la première cause d’handicap chez le jeune adulte, et touche environ 110 000 personnes en France, avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. Dans cette maladie, la perte de la gaine de myéline (structure graisseuse qui entoure et protège une partie du neurone, permettant la conduction de l’information nerveuse) peut se traduire par un ralentissement voire une interruption de la conduction du message nerveux. Les personnes atteintes de ce type de désordres sont progressivement ou d’amblée handicapées, sur le plan physique et cognitif. Au cours des 20-25 dernières années, des progrès remarquables ont été réalisés dans la prise en charge des patients par l’introduction de traitements visant la composante inflammatoire de la maladie. Cependant bien que ces traitements diminuent notoirement les symptômes, ils ne semblent pas avoir une forte influence sur l’amélioration du statut clinique ou pour prévenir la progression du handicap, comme évalués par les scores cliniques classiques. Des faisceaux d’arguments (modèles expérimentaux, examens neuropathologiques de cerveaux de SEP, nouvelles méthodes d’imagerie chez les patients SEP) suggèrent que la remyélinisation (régénération de la myéline) est un élément clé dans la restauration des capacités motrices et cognitives. L’effort international actuel est donc d’essayer de développer des molécules favorisant la remyélinisation, pour améliorer la prise en charge de la maladie et donc la qualité de vie des patients. Le but de notre projet est d’étudier des molécules améliorant la remyélinisation dans un modèle animal de sclérose en plaques (Xenopus laevis), en couplant des analyses histologiques et comportementales adaptées aux têtards. A plus grande échelle, si ces molécules présentent un effet bénéfique sur la remyélinisation, elles pourront présenter un espoir thérapeutique pour les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, ou plus largement les maladies affectant la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des molécules pouvant favoriser la remyélinisation. Identifier des molécules remyélinisantes permettrait dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, d’éviter la neurodégénérescence et à terme la dégradation des capacités fonctionnelles. Les molécules pro-remyélinisantes identifiées pourraient ensuite être utilisées comme piste thérapeutiques.

Procédures

Les têtards sont mis en contact avec du métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) durant 10 jours, puis avec des molécules à tester pro-myélinisantes pour une durée de 3 jours maximum. Les têtards sont mis en contact avec les molécules dans leur eau de balnéation. Les têtards vont être anesthésiés 4 fois 5 minutes (3 jours minimum entre chaque anesthésie) pendant toute la durée de la procédure. Ils effectueront 4 tests comportementaux de moins de 5 minutes avec un temps de 3 jours minimum entre chaque test.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture à l’épuisette, pour les tests comportementaux, peuvent aussi induire un léger stress chez le têtard, sans entrainer de blessures ou de comportements anormaux. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines de ces concentrations soient toxiques et peuvent entrainer la mort des têtards. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent également.

Devenir

Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux molécules à tester, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immunologiques plus poussées sur leurs tissus.

Remplacement

Le développement de stratégies thérapeutiques visant les maladies démyélinisantes est confronté à la difficulté de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. C’est la raison pour laquelle les modèles de culture cellulaire ne suffisent pas. A l’opposé, le recours à des animaux vertébrés, qui ont un système nerveux organisé avec des couches de myéline, comparable à ce qui est retrouvé chez l’Homme (et donc intéressant pour étudier les maladies qui atteignent cette structure) peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo. Cette étape permet de choisir plus objectivement les molécules efficaces et de les tester ensuite chez l’homme. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus laevis repose sur les arguments suivants : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux - Le Xenopus laevis est un animal robuste et facile d’élevage en comparaison à d’autres modèles animaux - Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus mammifères)

Réduction

Dans le souci de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules oligodendrocytaires dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation des têtards au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux. Nous souhaitons utiliser environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée en triplicat à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle (8 groupes au total), avec 10 têtards par condition (soit 80 têtards en triplicat donc 240 têtards au total). Ces calculs ont été réalisés à la suite de calculs de puissance pour les expériences proposées. Le nombre de 10 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée au cours du développement pour certains têtards. Chaque molécule nécessitera 240 (80x3) têtards, et nous avons 50 molécules à tester, soit au total environ 12 000 têtards.

Raffinement

Les têtards sont placés dans un bain de 4L d’eau (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à une température de 23 degrés avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée au minimum une fois par semaine avant le commencement du protocole pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques, et tous les 3 jours suite à l’exposition au métronidazole. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des souches d’arbres flottants en composite plastique sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés pour éviter toute souffrance animale. Si les doses n’ont pas précédemment été déterminées dans d’autres modèles animaux, elles sont adaptées à partir de l’efficacité des molécules in vitro. Par notre expérience, ces doses sont peu ou pas toxiques chez le têtard de Xénope. Suite à l’anesthésie, les animaux sont placés dans un bac avec une oxygénation de l’eau plus importante et avec leurs congénères, et surveillés dans les minutes suivantes jusqu’au réveil, qui a lieu généralement 5 minutes après la fin de l’anesthésie, avec une reprise de la nage normale. Durant l’exposition au métronidazole, les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition.

Choix des espèces

La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre stade 50 et 55. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des oligodendrocytes in vivo et sans recours à l’euthanasie des animaux. De plus, le stade 48 correspond au début de la myélinisation dans le système nerveux central, au stade 50-55 la myélinisation est beaucoup plus avancée, donc plus facile à étudier.

386 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie induisant une thrombopénie, des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et, pour certaines, une chirurgie du crâne permettant d'imager la moelle osseuse, le tout sous anesthésies répétées. Le porteur classe les procédures en modéré surtout à cause du stress lié aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil. Il affirme que l'étude de la formation des plaquettes exige un animal adulte vivant et que la souris est la seule solution.

Objectifs

La thrombopénie correspond à une baisse de la numération plaquettaire exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est le passage des MKs au travers de la barrière des vaisseaux (intravasation), ces évènements, très rares, permettent la libération des plaquettes dans la circulation sanguine. Avenant : dosage de la TPO plasmatique dans le sang. La thrombopoïétine (TPO) est une hormone produite en grande partie par le foie qui permet la régulation de la production des plaquettes par les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. La concentration en TPO est inversement proportionnelle avec la courbe de la numération plaquettaire avec un décalage dans le cadre d’une thrombopénie. Or, notre modèle de thrombopénie induite par chimiothérapie, nécessite une vision complète des conditions biologiques dont l’évolution de la concentration en TPO endogène au cours des traitements ce qui induit l’utilisation d’animaux vivants. En effet, l’une des perspectives du projet est d’administrer de la Romiplostim, un analogue de la TPO, qui permettrait de limiter/réduire la thrombopénie dans le cadre de la CIT. Cependant, la fenêtre d’administration de cet analogue n’est pas bien définie pour être pleinement efficace. L’objectif de cet avenant et de nous permettre de définir la fenêtre d’administration optimale de la Romiplostim® en fonction de la concentration en TPO endogène. Notre projet concerne la capacité de la moelle et des mégacaryocytes résidents à se remanier et restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT).

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie par un analogue de la TPO, le Romiplostim.

Procédures

Nous avons précisé « Tous les animaux seront anesthésies quelques minutes au masque pendant les injections des traitements pharmaceutiques (une seule injection au début de l'étude) puis pendant les prélèvements d'un faible volume de sang à la queue tous les 2 jours. La durée moyenne de ces injections est 1 minute. Certains animaux seront soumis en plus à une séance d’imagerie de la moelle d’une durée maximale de 3h, tandis que d’autres seront soumis à un prélèvement sanguin terminal (durée 2 minutes) . Ces gestes seront réalisés sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Pour l’ensemble des substances injectées aucune souffrance, aucune perte de poids, aucun saignement n’a été observé. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. En ce qui concerne les expériences par microscopie, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui n’expriment aucun phénotype dommageable. Ces expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées, elles subiront une petite chirurgie cutanée sur le sommet du crâne pour laquelle nous anticipons une légère inflammation et surveillons les saignements potentiels. Tous les animaux seront mis à mort avant leur réveil.

Devenir

A l’issu des procédures tous les 386 animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.

Réduction

Les souris issues de la première série d’expériences seront utilisées pour les études de cytométrie. Afin d’éviter des répétitions inutiles, le point « homéostasie » avant traitement sera réalisé une seule fois par traitement médicamenteux. A la fin des observations intravitales, les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est déterminé de manière à obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmaceutique, qui dans notre cas est le Romiplostim. L’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées à un âge habituel de souris adulte entre 8-18 semaines afin de standardiser au mieux les différents traitements. Les souris C57/Bl6 sont commandées par notre service selon nos besoin, il nous est donc aisé d'ajuster les âges de nos différents groupes.

2 979 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle transgénique de trisomie 21 présente des malformations cardiovasculaires et une fréquence anormale d'hydrocéphalie, et les souris subissent tatouage et coupe de la queue, chirurgies cérébrales avec implants optiques, restriction alimentaire de six jours et tests cognitifs. La plupart sont tuées pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique garder les surplus d'élevage porteurs du génotype pour d'autres projets. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux modèles souris et prête aux procédures un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Le syndrome de Down (SD) est causé par une modification du chromosome 21 humain. Il entraîne des caractéristiques physiques et neurologiques spécifiques, y compris des problèmes intellectuels. Les personnes atteintes de SD ont des difficultés avec des fonctions cérébrales importantes pour mener une vie autonome, comme l'attention et la mémoire. Ces fonctions dépendent d'une partie du cerveau appelée le cortex préfrontal. Les personnes atteintes de SD rencontrent des difficultés dans leurs interactions sociales et ont du mal à filtrer les informations, en particulier au niveau de certaines cellules cérébrales. On pense que l’excès d'inhibition du cortex préfrontal est un mécanisme important à l'origine des problèmes intellectuels chez les personnes atteintes de trisomie. Cependant, on ne sait pas encore quel rôle jouent les différents types de cellules cérébrales dans ces difficultés. Ce projet vise à comprendre comment les modifications des circuits cérébraux chez les personnes atteintes de trisomie du chromosome 21 influent sur leurs capacités cognitives. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles murins de la trisomie.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans le dysfonctionnement des circuits corticaux qui sous-tendent les déficits cognitifs connus. En particulier, ce projet fournira des informations précieuses sur les cibles moléculaires potentielles pour les thérapeutiques pharmacologiques visant à améliorer les performances cognitives des personnes atteintes du syndrome de Down.

Procédures

Ce projet nécessitera d’élever nos animaux pour réaliser nos procédures expérimentales, afin de piloter de manière raisonnée cet élevage et ne pas produire plus d’animaux que nécessaire certains mâles pourraient êre isolés de manière temporaire. Dans le cadre de l’élevage il y aura la réalisation d’un tatouage et d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours. Les deux actes ne sont réalisés qu’une seule fois et dureront moins de 2 minutes par animal au total. Nous allons enregistrer l'activité électrique neuronale dans la region préfrontale du cerveau en utilisant des souris transgéniques. Pour cela, les animaux subiront une chirurgie sous anesthesie générale qui prendra environ 30-40 minutes par animal. Ensuite, nous implanterons du matériel optique pour stimuler le cerveau avec de la lumière (30 minutes d'intervention pendant la même anesthésie). Nous enregistrerons l'activité des neurones chez des animaux qui seront éveillés et libres de leurs mouvements, ce qui nécessitera 1 à 3 heures d'intervention. Nous allons également stimuler le cerveau de ces animaux pendant qu'ils effectuent des tâches cognitives. Cette étape impliquera à nouveau une chirurgue et une implantation de fibres optiques pour la stimulation. Certaines de ces expériences nécessiteront des injections de substances pharmacologiques dans la cavité abdominale des souris et une restriction alimentaire pendant 6 jours pour les motiver à effectuer certaines tâches comportementales. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de permettre les différents prélèvements et analyses nécessaire. Toutes les opérations chirurgicales (durée 30-40 min) seront effectuées sur des animaux complètement endormis et soumis à un traitement analgésique avant, pendant et après l'intervention.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage au niveau de la pulpe digitale. Les systèmes cardiovasculaire et gastro-intestinal des embryons de notre modèle de souris de la trisomie 21, présentent des malformations ce qui complique leur survie. Les malformations du système cardiovasculaire sont similaires à celles observées chez les patients atteints du syndrome de Down. Ces souris présentent aussi des déficiences intellectuelles observées dans les tests de mémoire de court et de long terme. Des observations préliminaires indiquent une fréquence anormalement élevée d'hydrocéphalie. Nous allons surveiller et documenter l'incidence des hydrocéphalies afin de déterminer si cela est dû à un accouplement particulier avec des lignées de souris congéniques ou si cela fait partie du phénotype. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. Stress et isolement pour les tests comportementaux et contraintes avec la restriction alimentaire. Dans le cas où il serait nécessaire d’isoler un animal, s’agissant d’animaux grégaires, il pourrait ressentir un stress.

Devenir

Les animaux reproducteurs seront euthanasiés à 18 mois maximum. Les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever leur cerveau pour analyse post-mortem. Les animaux produits dans notre procédure d’élevage non utilisés dans ce projet et porteurs d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans des projets scientifiques dédiés de notre équipe, donc en utilisation continue.

Remplacement

Les questions traitées dans cette étude n’ont pas encore trouvé de réponse dans les recherches menées par la communauté scientifique internationale et, à notre connaissance, a l’heure actuelle nous sommes la seule équipe à y travailler. Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de la trisomie et aux croisements avec des souris exprimant des rapporteurs fluorescents, pour atteindre les objectifs du projet: analyses des caractéristiques physiologiques ainsi que moléculaires des circuits neuronaux inhibiteurs génétiquement identifiés dans le contexte de la trisomie. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information (comportement, neuropathologie produisant des déficiences cognitives et neurodegeneration chez l'Homme).

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 2979) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés d’un côté à la fois pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre, et d’un autre pour l'électrophysiologie et l'optogénétique afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur un même animal. Notre maitrise du geste chirurgical limite les pertes d’animaux en post-opératoire. Toutefois, les avantages de l'utilisation d'animaux pour de nombreuses techniques sera mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience cumulée au cours de la vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris aux tâches cognitives réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et il est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépend de la variabilité de la lecture biologique. Il est donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Des tests paramétriques et non-paramétriques sont utilisés en fonction de la distribution normale ou non-normale des données. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur une plateforme en ligne ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront approuvés par le comité d’ethique et le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation/allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris âgées de moins de 120 jours après la naissance pour garantir qu’elles s n’arrivent pas aux phases critiques du phénotype Un suivi de poids sera réalisé de manière hebdomadaire afin de détecter l’apparition de formes marquées du phénotype. Pour les animaux fragilisés par le phénotype des croquettes seront disponibles en fond de cage, de l’hydrogel, ou des biberons d’accès facilité (tétine plus longue). Nous serons attentifs et tracerons tous les signes d’hydrocéphalie dès la naissance des petits. Nous définirons des points limites qui, s'ils sont atteints, nous conduiront immédiatement à l'euthanasie de l'animal afin de réduire les souffrances inutiles.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous étudions. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maîtrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (mâles et femelles). L'élevage nécessite d'avoir des animaux reproducteurs adultes. Toutes les procédures qui nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux ont atteint un stade de maturation final.

14 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin sous anesthésie générale et locale, un motif dans l'œil droit pouvant selon le porteur diminuer "de manière très modérée" l'acuité visuelle, avant d'être tués pour l'analyse histologique des tissus oculaires. Le porteur affirme que le traitement "reste sans douleur" et s'appuie sur une étude antérieure menée sur neuf lapins. Il indique qu'il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo du cristallin permettant un suivi sur plusieurs semaines, le projet servant une startup à établir une preuve de concept contre la presbytie.

Objectifs

La presbytie, qui survient systématiquement après 45 ans, concerne 1,8 milliard de personnes, dont 826 millions ne sont pas ou sont mal corrigés. Il est documenté qu'elle est causée par une rigidification du noyau du cristallin empêchant les muscles accrochés à sa périphérie de modifier l’épaisseur et la courbure nécessaires à l'accommodation. Le cristallin est composé de cellules contenant des protéines appelées cristallines, qui sont solubles et le rendent transparent en homogénéisant son indice de réfraction. En vieillissant, les agrégats de cristallines (création de ponts disulfures principalement), deviennent insolubles et rigidifie le noyau. L’hypothèse principale est qu’il est nécessaire de « ramollir » le noyau du cristallin en désagrégeant les protéines cristallines. Une des techniques les plus appropriées pourrait être le laser femtoseconde. Ce dernier permet d’envoyer de très courte impulsion d’énergie photonique avec précision dans le tissu sans dégagement d’énergie thermique. Après une étude de safety menée en 2021 sur 9 lapins ayant montré que la création de patterns (= motifs 2D ou 3D) au laser femtoseconde dans le cristallin d'un lapin n'entraine pas d'effets délétères à court, moyen et long terme sur les tissus opthamologiques de l'animal ; la startup a effectué de nombreux tests ex vivo sur cristallin de cochon. Ces tests avaient pour objectif d'effectuer une gamme de marquage au laser femtoseconde (distance entre les points de tir laser, puissance...) afin d'en étudier les interactions laser-matière. Ils ont alors pu observer des paramètres permettant d'obtenir des tirs lasers qui restaient transparents dans le cristallin. 1/ confirmer ou infirmer IN VIVO la correspondance entre les paramètres laser et types d’interaction laser matière observés en EX VIVO (bulles de coalescence, bulle de cavitation, marquage sans apparition de bulles, pas de marquage apparent) 2/ confirmer ou infirmer l’évolution des différents types d’interactions sur plusieurs semaines (résorption des bulles, atténuation ou disparition totale des marquages…) 3/ identifier les paramètres qui permettent d’obtenir un marquage maintenant la transparence ou permettant de la récupérer en IN VIVO afin d’en évaluer les effets biomécaniques (assouplissement), dioptriques ou autres. Données d’entrée à des études ultérieures. 4/Caractériser In situ les impacts laser des différentes interactions lasers (tissulaires et protéiques) 3 semaines après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la stratup d'obtenir des connaissances sur l'interaction laser-matière sur le long terme (impossible à obtenir en ex-vivo ou in-vitro) confirmant ou infirmant les résultats qu'ils obtenus en ex vivo et leur permettant ensuite d'aller plus en avant sur des études d'efficacités de leur traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin. 6 lapins auront 2 phases de tirs lasers. et 4 lapins n'en auront qu'un seul. Les animaux seront sous anesthésie générale et locale. Rapellons que ce traitement laser très focalisé reste sans douleur pour l'animal et que des tests précédents ont montrés qu'à cette puissance, il n'y a pas d'effets délétères pour la cornée et la rétine des animaux.

Impact sur les animaux

Les nuanciers créés dans l'oeil gauche de l'animal sont de très petite taille (environ 2mm²) et ne devraient pas avoir d'impact sur la vision de l'animal. Le pattern qui sera créé dans l'oeil droit de l'animal pourrait diminuer l'acuité visuelle de manière très modérée. Les puissances lasers qui seront utilisées durant cette étude sont inférieures à celles utilisées durant l'étude de 2021, par conséquent aucun effet délétère pour la cornée ou la rétine n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous devons analyser en histologie les tissus oculaires de ces animaux afin de pouvoir conclure.

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo de conservation du cristallin satisfaisant et permettant un suivi de l'organe sur plusieurs semaines. De plus, il n'existe aucun modèle de cristallin permettant de simuler l'interaction avec le système immunitaire pour ce genre d'intervention chirurgicale.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'intervention chirurgicale pour la première phase et de 4 lapins par groupe pour la deuxième phase afin de pouvoir effectuer toutes las analyses histologiques dont certaines nécessite un globe oculaire entier.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Une précédente étude menée par notre laboratoire a démontrer qu'à cette fluence de laser le tir laser dans le cristallin n'induit aucun dommage à la rétine et la cornée du lapin. Cette précédente étude a par ailleurs permis de tester et d'optimiser le système de tir laser et son docking. Ce dernier sera d'autant plus optimisé puisqu'il sera testé sur des têtes de lapins de boucheries et des yeux de lapins énucléés ex vivo et modifié au besoin courant la fin de l'année 2023 et le début 2024. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire (cristallin et cornée) proche de l'homme. Pour que le traitement du cristallin soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgésd’environ 3 mois (12 semaines).

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intracérébrale de cellules tumorales à travers un orifice pratiqué dans le crâne, puis une injection de nanoparticules et deux séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tué. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et prévoit un isolement d'une nuit pour éviter que les animaux ne rongent leurs sutures. Il indique que des tests cellulaires ont présélectionné trois nanoparticules mais que l'évaluation de leur accumulation tumorale n'est "pas remplaçable" sans animaux.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgré un traitement agressif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l’apport de nanoparticules radio-sensibilisante est envisagée. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer la distribution de nouveaux agents nanoparticulaires dans un modèle dans un modèle murin de glioblastome.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de documenter l’accumulation de différents nanovecteurs radiosensibilisants avant de réaliser une étude d’efficacité thérapeutique en utilisant leurs propriétés radiosensibilisantes mais également l’association avec des chimiothérapies.

Procédures

Tous les animaux seront injectés en intracérébral avec des cellules tumorales. La durée totale de la chirurgie est de 15 minutes et est implique une anesthèsie. L'injection unique intraveineuse de thérapie est réalisée en bolus sur une durée de moins de 5 secondes. Deux séances d'imagerie sont planifiées et impliquent une anesthèsie de 10 minutes à 4heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives à la chirurgie incluse dans le protocole. En effet, la chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pendant une nuit afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures. Au moment des sessions imageries, les animaux seront anesthèsies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les 3 types de nanoparticules que nous allons évaluer. Toutefois, pour cette phase d’évaluation de l’accumulation tumorale des nanovecteurs, le recours à des animaux n’est pas remplaçable.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. En effet, une simulation en utilisant G-power, montre que pour mettre en évidence une éventuelle différence d’accumulation de nos nanovecteurs supérieure ou égale à 20%, nous groupes doivent être constitués de 12 individus, avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux recevront en per opératoire une injection sous cutanée de buprénorphine et au site d'incision une injection de lidocaïne. Ils seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales ainsi que lors de l’examen IRM - normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la température rectale. Pendant l’examen IRM un suivi du rythme respiratoire sera réalisé afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Un arbre descisionnel est mis en place pour arrêter toute souffrance à laquelle les animaux pourraient être exposés.

Choix des espèces

Le rat est retenu pour cette étude dans la mesure ou le modèle est bien documenté et établi dans notre laboratoire.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent huit semaines de tests comportementaux (discrimination visuelle, mémoire spatiale, coordination motrice, mémoire de travail) et reçoivent une injection bihebdomadaire d'un traitement, avant d'être tuées pour prélever cerveau, foie et muscles. Le porteur indique n'attendre aucun phénotype dommageable de la lignée trisomique et recourir à une eau de boisson légèrement acide pour renforcer l'apprentissage sans priver les animaux. Il affirme que l'étude de fonctions cognitives impose de travailler sur un "organisme vivant dans son intégrité".

Objectifs

Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles associées à des trisomies. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la restauration de déficits cognitifs (apprentissage, mémoire) et de coordination motrice dans un modèle de trisomie. Un traitement potentiel, déjà évalué sur un autre modèle de trisomie, a montré son effet positif sur des fonctions simples. Le présent projet souhaite étendre la caractérisation du traitement sur d’autres fonctions d’apprentissage et de mémoire. Il permettra de qualifier plus précisément les effets de l’administration du traitement.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à étudier les effets thérapeutiques visant à réduire des défauts de coordination motrice et d’apprentissage et de mémoire. Cette étude constitue donc la base pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.

Procédures

Les animaux seront évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 8 semaines. 4 semaines d’apprentissage de discrimination de motif visuelle, 2 semaines de tests évaluant la mémoire spatiale, 2 ou 3 (suivant le test choisi) jours de mesure de coordination d’activité motrice et 1 jour d’évaluation de la mémoire de travail + jours de repos entre les tests. Les animaux subissent une injection (30 s) bi-hebdomadaire (sur les 8 semaines de tests) d’un traitement visant à améliorer leurs fonctions cognitives sans effet négatif décrit.

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommagable n’a été rapporté lors d’études précédentes de la lignée de souris étudiée. L’injection du traitement par voir intra-péritonéale entraînera une légère douleur. Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétente l’eau lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée au cours des manipulations quotidiennes des animaux pendant les tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux de la lignée transgénique étudiée seront mis à mort car nous allons faire des prélévements (cerveau, foie, muscles …) pour faire des études approfondies des tissus et des processus moléculaires

Remplacement

La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer l’effet d’un traitement sur les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les animaux auront une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par du lait mélangé à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. La boisson sucrée présentée dans le test devient d’autant plus appétente que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (trisomie). Les souris seront testées une fois adultes (8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients porteurs de trisomie montrent des défauts cognitifs à l’âge adulte.