Procédures modérées

4 644 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour cribler des candidats médicaments anticancéreux de type anticorps-médicament. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau sur animal vigile, puis des injections intraveineuses répétées, et sont mises à mort à l'atteinte de points limites ou en fin d'étude. Le porteur précise que les souris non entrées en protocole seront "réformées" pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme que les preuves in vitro sont déjà faites et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer au modèle souris pour une greffe de tumeur humaine.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : La Procédure-1 permettra de déterminer les meilleurs modèles de tumeurs humaines greffées dans des souris démunies de système immunitaire par rapport à des cibles thérapeutiques choisies (CDX). La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s de référence. La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les modèles sélectionnés (CDX) dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité sont les données les plus importantes avec les données de tolérance afin de pouvoir choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables), chez les patients. ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Après une semaine d'adaptation à l'environement, les souris seront identifiées: - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous-scapulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les differents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnage auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection sous-cutanée ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. - De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’etre mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in-vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux, démunis de système immunitaire, seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger), dans des conditions sanitaires permettant de ne pas etre infectées. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses d’efficacité par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des greffes de tumeurs humaines, , des animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacocinétique seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif entre la souris et l’humain (cibles exprimées de façon identique entre la Souris et l’Homme), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris. Les animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF) et expérimentation sous PSM (les souris ne pouront pas contracter d'infections).

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois de régime gras destiné à induire un surpoids, elles subissent un test d'intolérance au glucose par injection, puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt-et-un jours. Le porteur indique attendre une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une perte de poids et une déshydratation. L'objectif est de comprendre le rôle des comorbidités liées à l'âge dans l'AVC, le porteur justifiant le recours à l'animal par des mécanismes qui "ne peuvent s'envisager que dans un organisme entier".

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

313 souris génétiquement modifiées pour modéliser le syndrome NARP vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à quatre âges, des tests de force musculaire, de motricité, d'équilibre et d'endurance, ainsi que des IRM et échocardiographies sous anesthésie, le porteur attendant un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire. L'objectif est de caractériser cette lignée avant de tester des candidats médicaments, une étape que le porteur décrit comme "jamais faite auparavant de manière détaillée". Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent "incomplets" et que le recours à l'"organisme tout entier" est une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.

Objectifs

Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse un vecteur de thérapie génique, une prise de sang et un jeûne de seize heures, avant le prélèvement de leur foie auquel elles ne peuvent pas survivre. Le projet vise à faire exprimer une protéine modifiée pour la rendre reconnaissable par un anticorps du commerce et faciliter son étude. Le porteur situe les bénéfices dans la biologie fondamentale et affirme que le foie ne peut être reproduit fidèlement en culture cellulaire.

Objectifs

L'utilisation d'anticorps pour purifier une protéine d'un fluide biologique est une stratégie bien connue et qui a fait ses preuves. Cependant, pour certaines protéines, il s'avère impossible d'obtenir un anticorps spécifique. Il est donc ici envisagé d'utiliser des souris transgéniques n'exprimant pas une protéine d'intérêt, et de réintroduire par thérapie génique la même protéine très légèrement modifiée afin qu'elle soit reconnue par un anticorps du commerce. Les souris obtenues exprimeront alors une protéine modifiée, ce qui rendra son étude possible. L'étude de protéines purifiées permet des avancées significatives dans le domaine de la biologie fondamentale, mais aussi des médecines humaine et vétérinaire. Il sera par exemple possible d'isoler la protéine d'intérêt afin de caractériser les autres molécules avec lesquelles elle entre en interaction.

Bénéfices attendus

La purification spécifique d'une protéine permettra son étude approfondie (liaison à l’ADN, interaction protéine-protéine, identification de ligands). Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront une contribution aux domaines de la médecine, de la pharmacologie et de la nutrition.

Procédures

Les animaux recevont une injection intraveineuse sous anesthésie locale (2 minutes de contention dans un dispositif prévu à cet effet), et il sera pratiqué une prise de sang (30 secondes de contention manuelle), ainsi qu'une mise à jeun de 16h, dont seulement 4h pendant la période nocturne.

Impact sur les animaux

L'injection au niveau de la veine de la queue du virus pour la thérapie génique demande une contention de l’animal stressante, et l’injection engendre éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie, mais qui ne devrait pas chuter en-dessous d'un seuil mettant en péril la santé de l'animal.

Devenir

Comme les animaux ne peuvent pas survivre au prélèvement de leur foie, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L’utilisation de l’animal entier est envisagée car le foie est un environnement complexe, qui ne peut pas être mimé avec fidélité en culture cellulaire. Cet organe est constitué d’une grande diversité de cellules et est affecté par des signaux hormonaux et nutritionnels provenant de tout l’organisme. Cependant, la phase animale n’est engagée que si des tests préliminaires sur des cellules en culture des différents transgènes utilisés sont concluants (gène rapporteur, reconnaissance par un anticorps du commerce). Ces tests ont déjà été fait sur des lignées cellulaires du commerce puis sur des cellules isolées d’un animal, et sont concluants.

Réduction

L’utilisation de lignées de grande proximité génétique permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, les tests de puissance statistique pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les 2 heures le premier jour puis 2 fois par jour pendant 1 semaine) après l'injection à la veine de la queue et après le prélèvement sanguin à la joue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Une méthode d'évaluation du stress et de la douleur est prévue. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 4h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de la protéine d'intérêt, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.

Choix des espèces

Les modèles d’invalidation de gène que nous utilisons ne sont disponible que chez la souris. Les animaux qui sont utilisés sont de jeunes adultes, dont le foie est arrivé à maturité. Comme l'étude porte sur le métabolisme et que la race de souris utilisée développe des troubles métaboliques spontanément avec l'âge, les animaux trop vieux sont à éviter.

108 souris, jeunes et âgées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le muscle de leur patte est lésé par injection de venin de cobra afin d'étudier le rôle de deux protéines dans la régénération musculaire. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il indique léser les deux pattes de chaque animal pour diviser par deux le nombre de souris, et conclut que des lignées cellulaires ou modèles 3D ne reproduisent pas le muscle en régénération.

Objectifs

Des souris saines seront utilisées pour ce projet. Des études préliminaires dans le laboratoire ont montré la diminution avec l'age de protéine présente au sein du muscle et qui pourrait impacté le bon fonctionnement de la régénération musculaire. Le processus de lésion et régénération musculaire sera induit par une injection de toxine (venin de cobra). La toxine déclenche le processus de régénération musculaire sans affecter le comportement de l'animal. Cette technique permet une lésion de l'ensemble du muscle injecté de façon reproductible. L'injection de toxine sera utilisée pour suivre les différentes étapes de la régénération musculaire et voir l'effet de nos deux protéines d'intérêt sur le processus de régénération musculaire. Pour ce faire, nous allons effectuer l'extinction de ces protéines au sein des muscles de souris jeunes puis nous allons ajouter ces protéines au sein de muscles de souris agées afin d'observer si cela améliore leur régénération musculaire.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de mettre en évidence le rôle de deux protéines d'interêt dans le processus de régnération musculaire dans la muscle squelettique, et cela dans le muscle jeune et plus agé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative par la mise en évidence de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Trois injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Deux injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée avant et après la lésion musculaire.

Impact sur les animaux

Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de stress chez l'animal et n'est utilisé que pendant un court temps, non nuisible pour l'animal. De plus, l'injection d'analgésique avant et après l'injection permet de réduire au maximum la douleur chez l'animal et donc le stress. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.

Remplacement

Les paramètres d'auto-renouvellement des cellules souches musculaires et leur potentiel de fusion avec les fibres musculaires sont essentiels pour comprendre la physiopathologie musculaire. Notre projet s'intéresse aux interactions entre les différents types cellulaires au sein du muscle en régénération, et nécessite donc des modèles murins. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ni de modèle 3D qui ne reproduisent pas fidèlement la diversité et l'organisation des types cellulaires au sein du muscle en régénération.

Réduction

L'injection de cardiotoxine dans les deux pattes présente une nuisance supplémentaire pour les animaux mais reste tolérable et tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance des animaux. Cette double injection nous permettra de diviser par deux le nombre de souris nécessaire en utilisant chaque souris pour deux analyses différentes. Les expériences seront effectuées sur un lot expérimental réduit de 6 souris afin de garder suffisamment d’individus pour effectuer des analyses statistiques robustes et fiables tout en réduisant le nombre d’animaux au strict minimum. Nous utiliserons comme test statistique le test de Student pour comparer la moyenne des différentes conditions biologiques expérimentales entre elles (groupe contrôle versus traité)

Raffinement

1)L es animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine à leur arrivée au sein de l'animalerie. 2) En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés par nos soins 2 fois par semaine. Cela va permettre de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d'interaction sociale, tout changement pourrait refléter une souffrance, douleur ou stress même minime chez l'animal. Les douleurs dues à la lésion musculaire et le mécanisme de régénération se mettant en place dans les premières 24h, l’animal sera particulièrement surveillé pendant cette période. L'animal sera mis à mort en cas de douleurs trop importantes pour éviter toute souffrance inutile. 3) Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. 4) La procédure est peu invasive (injection intramusculaire simple sans chirurgie) pour permettre d'induire le processus de régénération musculaire et l'injection des molécules. 5) Des anesthésiques (isoflurane 3-4%) et analgésiques seront utilisés au cours de la procédure afin de prévenir au maximum le stress des animaux. L'analgésique sera utilisé avant et après l'induction de la lésion musculaire et l'anesthésique au cours de l'induction de la lésion musculaire ainsi que durant les injections des molécules d'intérêt. 6) Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Afin d'observer si nos protéines ont un rôle dans le processus de régénération musculaire physiologique, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées afin de découvrir le rôle de nos deux protéines d'intérêt. Dans un second temps, afin d'observer si nos protéines peuvent avoir un effet sur la régénération musculaire dans un contexte de vieillissement, des experiences sur souris agées de 24 mois seront effectuées. Seules des souris mâles seront utilisées pour cette étude comme les hormones femelles peuvent impactées le processus de régénération musculaire, et que les mâles sont principalement touchés par les maladie du muscle comme la dystrophie.