Procédures modérées

1755 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail porte sur des embryons pour étudier le rôle de récepteurs d'un facteur de guidage neuronal, les femelles gestantes recevant une injection destinée à bloquer l'action d'hormones sexuelles et les animaux étant identifiés par prélèvement d'un fragment d'oreille. Le porteur affirme que ces souris génétiquement modifiées ne développeront pas de douleur, ce qui contraste avec la gravité modérée déclarée pour l'ensemble. Il conclut que la complexité du développement cérébral ne peut être reproduite in vitro et que la souris partage 98 % de son patrimoine génétique avec l'humain.

Objectifs

Dans le monde animal, la plupart des espèces possèdent un axe de symétrie avec des extrémités avant/arrière et des faces ventrale/dorsale. Le système nerveux central (SNC) de ces espèces est composé de 2 hémisphères qui sont reliés par des neurones particuliers, les neurones commissuraux. Ces neurones projettent leur fibre sur des neurones cibles situés du côté opposé. Au début du XXième siècle, S. Ramon y Cajal avait déjà décrit en détail ces connexions reliant les deux moitiés du cerveau, et observé que les fibres nerveuses croissent en direction d’une structure ventrale et médiane, la plaque du plancher. Des études biochimiques ont identifié la protéine responsable de cette croissance. Enfin, des études ultérieures identifièrent plusieurs récepteurs à ce facteur de guidage neuronal. Toutefois, ces études sont contradictoires et sont soumises à controverse. Ce projet vise à trancher définitivement quant aux rôles de ces différents récepteurs à l’aide de modèles murins permettant de « casser » spécifiquement des gènes avec un contrôle spatial (tissu spécifique) et temporel (au moment voulu).

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle de différents récepteurs à un facteur de guidage neuronal pendant le développement du système nerveux central. Une meilleure compréhension des mécanismes développementaux impliqués dans la mise en place du système nerveux central pourrait faciliter la compréhension de troubles psychiatriques comme l’autisme ou l’épilepsie ou des problèmes moteurs (strabisme). En effet, ces pathologies sont associées à des défauts de connexions neuronales qui mettent en jeu les gènes étudiés dans ce projet.

Procédures

Tous les animaux seront marqués par la pose d'une bague auriculaire et un prélevement d'un bout d'oreille sera réalisé à l'aide d'un poinçon. Ce geste d'identifcation/genotypage est réalisé en moins de 10 secondes. Les femelles gestantes de la procédure 2 et 3 recevront une injection intrapéritonéale d’un produit dont l’activité prévient l’interaction entre des hormones sexuelles et leurs récepteurs.Il n’est pas connu de nuisances associées à ces injections et ce geste est bref (5 secondes). Pour les animaux de la procédure 1 seul un geste réalisé (identifaction/prélevement pour génotypage) et pour les animaux des procédure 2 et 3 un second geste est réalisé (injection intrapéritonnéale).

Impact sur les animaux

Les animaux génétiquement modifiés utilisé dans cette demande de projet ne développeront pas de problèmes pouvant être à l’origine de douleur. En effet, nous utilisons un système génétique permettant d’invalider spécifiquement les gènes étudiés dans un tissu et à un temps voulu. Ce modèle murin permet de définir la localisation où les gènes sont invalidés et le moment désiré. Il permet de contourner les problèmes associés à la perte total du gène

Devenir

Ils seront tous mis à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

La compréhension du développement du système nerveux central ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du tissu cérébral est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions cellulaires et de la communication intercellulaire. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur une analyse en microscopie et ne fera pas intervenir de tests statistiques. Les tissus seront techniqués de manière à pouvoir analyser de nombreuses caractéristiques sur un individu. Les analyses ex vivo seront réalisées sur un nombre défini d’échantillons déterminé par l’utilisation d’un test de puissance statistique.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Les modèles murins utilisés dans cette demande de projet permettent un contrôle spatial et temporel de l’invalidation des gènes. Grâce à ces modèles génétiques, nous restreignons l’effet de la perte de ces gènes aux structures étudiées. De plus, les embryons sont analysés avant que les structures responsables de la douleur soient mises en place.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Nous travaillerons sur les embryons car c’est à ce moment-là que le système nerveux central se développe.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique d'un vecteur délivrant de l'ARN par différentes voies, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis est tué pour prélever ses organes. Le porteur présente cette étude de biodistribution comme exigée par les autorités réglementaires en vue d'un usage futur chez l'humain. Il cite des modèles alternatifs comme les organoïdes ou les organes sur puce, mais conclut qu'aucun ne renseignerait sur la dissémination de l'ARN dans un "organisme complet".

Objectifs

La caractérisation du profil de biodistribution d'un produit après administration in vivo est un élément majeur du programme de développement préclinique. Les études de biodistribution, exigées par les autorités réglementaires, ont pour objectif de déterminer la dissémination du matériel biologique dans les tissus et les fluides ciblés et non-ciblés, ainsi que leur transmission dans les lignées germinales. Ce projet a pour objectif d’évaluer la biodistribution d’un vecteur non intégratif délivrant de l’ARN chez l’animal, nécessaire pour comprendre la pharmacologie du produit. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. Plusieurs voies d’injection vont être testées, avec un ensemble d’organes analysés post mortem, en relation avec la voie d’injection en question.

Bénéfices attendus

Cette étude de Biodistribution chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en déterminant comment il se répartit dans les différents organes et tissus de l’organisme; - de valider l’expression transitoire de l’ARN distribué sans évènement(s) d’intégration dans le génome; - d’évaluer son efficacité de dissémination pour optimiser les doses et les schémas posologiques pour maximiser son efficacité thérapeutique; - de conceptualiser la thérapie adaptée à l’utilisation du produit en termes de contenu du vecteur et de méthodes d’administration appropriées pour atteindre les cibles biologiques.

Procédures

Les animaux recevront 1 seule injection, soit par voie intraveineuse, ou intramusculaire, ou sous-cutanée, ou intradermique (durée 2-3 minutes). On réalisera un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) sous anesthésie gazeuse, avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Dans le cadre d’une étude de biodistribution, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. Dans cette étude, l’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN se fera par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. Ces injections peuvent entrainer un stress ou une douleur chez l'animal. Par ailleurs, ces souris subiront une anesthésie pouvant induire un stress lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal pour une étude de biodistribution peut se faire selon : - L’utilisation de modèles alternatifs tels que la culture de cellules adaptées, les modèles bio-informatiques ou les organoïdes; - l’utilisation d’organes sur puce qui permettent de modéliser la biodistribution dans un environnement plus proche de la réalité. Cependant, aucun de ces outils ne pourra apporter de réponses précises sur la biodissémination des ARN dans un modèle d’organisme physiologique complet nécessaire à la validité scientifique requise. La fonctionnalité du vecteur de transfert d’ARN prévu pour cette étude est systématiquement validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont.

Réduction

La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe, en comparant les résultats des études moléculaires et histologiques entre animaux ayant eu le vecteur non-intégratif amenant un ARN et les controles ayant eu le véhicule. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d'animaux, les mêmes organes seront utilisés pour l'ensemble des analyses, moléculaires et histologiques, évitant ainsi de doubler le nombre de souris.

Raffinement

Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans les études de biodistribution pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 12 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.

105 rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires d'un vecteur de thérapie génique, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe dans l'abdomen ou une injection intraveineuse, avant une exsanguination terminale sous anesthésie. Le porteur présente cette étude comme un essai pilote destiné à sélectionner l'approche la plus efficace avant une étude ultérieure à plus grand effectif. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit un transfert de gène dans un "organisme entier" et que l'animal est le "seul organisme vivant" permettant cette étude.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD codant pour la protéine Dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires. L’absence de Dystrophine dans l’intégralité des muscles de l'organisme provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. La thérapie génique est une des approches prometteuses pour le traitement de la DMD. L’efficacité thérapeutique passe par le transfert d’un gène thérapeutique dans les muscles, à l’aide d’un vecteur viral recombinant dérivé du virus adéno-associé (AAV). Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine, appelés microDystrophines (MD) ont été générés. Si les premiers résultats obtenus après injection de patients DMD à l’aide de vecteurs AAV-MD sont encourageants, nous savons déjà que la correction ne pourra qu'être partielles et il reste nécessaire de développer des produits de 2ème génération qui seront alternatifs ou complémentaires à la thérapie génique AAV-MD. L'objectif de notre projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique basée sur le blocage de canaux calciques, présents à la surface des cellules musculaires, et dérégulés dans la DMD. L'utilisation de bloqueurs de canaux calciques spécifiquement dans les muscles cardiaques et squelettiques représente une stratégie complémentaire à la thérapie génique AAV-MD. Ce projet est une étude pilote dans laquelle nous souhaitons faire la preuve de concept que l’inhibition moléculaire d'un canal calcique (via l'utilisation de vecteurs AAV) peut être bénéfique pour traiter la DMD. Pour cela, nous traiterons des rats DMDmdx à l’aide de différentes stratégies.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de (i) cumuler des 1ères données suite à un traitement combinatoire AAV-MD + inhibition d'un canal calcique via une approche pharmacologique, et (ii) sélectionner l’approche moléculaire la plus efficace pour inhiber l’activité d'un canal calcique à l'aide d'un vecteur AAV, et améliorer les lésions histologiques musculaires du rat DMDmdx. La construction la plus efficace sera ensuite évaluée pour son efficacité thérapeutique dans le même modèle animal du rat DMDmdx, mais avec un nombre d’animaux plus important par groupe expérimental afin d’assurer la robustesse des évaluations phénotypiques. Cette efficacité thérapeutique sera évaluée seule et en combinaison avec un traitement AAV-MD. Cette seconde étude fera l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentent un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit final sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire afin de pouvoir prétendre ensuite réaliser un essai clinique chez des patients DMD.

Procédures

(i) Pour maximum 66 animaux: injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: environ 10min. (ii) Pour maximum 22 animaux: implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iii) Pour maximum 12 animaux: injection intravaineuse dans une veine caudale sur animal vigile. Geste réalisé une fois par animal sous analgésie. Durée de l'intervention: maximum 5min. Puis, 2 semaines après, implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iv) Pour tous les animaux (maximum 105): Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) Injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie. Elle ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Durée de l'intervention: environ 10 min. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intramusculaire d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection intramusculaire d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale : cette procédure chirurgicale peu invasive sera réaliséz une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie générale, et avec une analgésie adaptée. Malgré tout, les animaux pourraient ressenti une douleur modérée au niveau de la zone d’incision pendant la période de cicatrisation (maximum 7 à 10 jours). Durée de l'intervention: maximum 20 min. (iii) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal et la douleur provoquée par la ponction de l'aiguille. Durée de l'intervention: maximum 5 min. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (iv) Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses calcique, moléculaires, biochimiques et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité. Ce projet, qui vise à faire la preuve de concept que l’inhibition d'un canal calcique peut en effet être bénéfique pour réduire les anomalies calciques et les lésions musculaires liées à la pathologie DMD ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses pilotes qui seront réalisées ici (analyses calciques, moléculaires, biochimiques et histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D’autre part, par l’identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettre de réduire le nombre total d’animaux qui seront à inclure dans l’étude qui suivra et qui visera à évaluer l’efficacité thérapeutique de la meilleure construction, en combinaison ou non avec un AAV-MD. En effet, tester d’emblée ces 10 approches d’inhibition moléculaires calciques aurait demandé l’inclusion d’un nombre très important d’animaux, supérieur au nombre total qui sera inclus via ces 2 études.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés : souris mdx et chien GRMD, présentent des limites pour les projets pré-cliniques. La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Les animaux seront injectés à l’âge de 1 mois pour les animaux traités avec les vecteurs AAV, et à l’âge de 1,5 mois pour les animaux traités avec le produit Pyr10. Le décalage de 15 jours entre ces 2 groupes est lié au fait qu’il faut au moins 15 jours pour obtenir une expression significative d’une protéine après injection d’un vecteur AAV, alors que le produit Pyr10 sera actif immédiatement. Les animaux seront ensuite mis à mort à l’âge de 3 mois. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats DMDmdx présentent des anomalies calciques dans leurs muscles, avec une augmentation de ces défauts au cours du temps, et la mise en place de fibrose musculaire bien présente à 3 mois d’âge. L’âge de début des différents traitements et la durée de ceux-ci permettront donc d’évaluer les bénéfices sur la dystrophie musculaire des stratégies d’inhibition testées et de les comparer entre elles. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter un dispositif de mesure, puis des tests d'équilibre, de motricité et des mesures auditives et vestibulaires dont le nystagmus post-rotatoire. Ces procédures ne visent pas à produire des connaissances mais à maintenir les compétences techniques du personnel, dont la validité expire tous les six mois dans l'établissement. Le porteur décrit le remplacement comme "difficilement applicable" puisque l'objectif est l'entraînement au geste lui-même.

Objectifs

La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Ce projet est dédié au maintien des compétences des personnels maîtrisant les gestes techniques impliqués dans ces 2 procédures. Ceux-ci ayant une durée de validité de 6 mois dans notre établissement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux spécifiquement pour ce maintien de compétence. Ainsi, la bonne formation du personnel permet 1) d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués, et 2) d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Cette demande d’autorisation de projet a un double objectif : 1. Former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permettra une montée en compétence des expérimentateurs et donc in fine une diminution probable des mauvaises manipulations pouvant conduire à des mises à morts inutiles ou à des reproductions d’expérimentation. 2. Raffiner les procédures expérimentales, notamment évaluer la possibilité de réaliser diverses procédures fonctionnelles et comportementales sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures afin 1) d’améliorer la santé et le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal pratiqués et 2) d’optimiser les procédures expérimentales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Procédures

Procédure 1 : Mesure de l'activité cérébrale et analyse comportementale de la fonction motrice chez le rat. La procédure comporte une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispostif de mesure de l’activité du cerveau. Ensuite, des tests de comportement (30min au total) sont effectués pour évaluer la motricité et l’équilibre de l’animal. Procédure 2 : Mesure du nystagmus post-rotatoire et évaluation des fonctions vestibulaire et auditive. La procédure inclut une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispositif de fixation pour réaliser le test du nystagmus post-rotatoire (10min). Ensuite, des tests de comportement (10min au total) sont effectués pour évaluer l’équilibre de l’animal. Enfin, des mesures auditives sous anesthésie médicamenteuse sont pratiquées (20 secondes de mesure ; 1h pour le reveil de l’animal dans une armoire chauffante).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux chirurgies crâniennes.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet sont mis à mort à la fin de la procédure les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale. Les mesures fonctionnelles, comportementales et de mises à mort n’offrent pas cette possibilité.

Réduction

Ce projet vise à former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permet une montée en compétence des expérimentateurs et donc une diminution probable des mauvaises manipulations. Une approche de formation « centralisée » sera mise en œuvre afin que plusieurs personnes puissent assister simultanément aux procédures. L’utilisation de chaque animal est optimisée autant que possible pour réaliser à la fois des explorations fonctionnelles et comportementales : - Les animaux dont l'activité cérébrale est mesurée sont également utilisés pour les tests comportementaux et mis à mort pour l’analyse histologique. - Les animaux dédiés à la mesure du nystagmus post-rotatoire sont également utilisés pour les tests comportementaux, la mesure des produits de distorsion acoustiques, les dosages sanguins et mis à mort pour l’analyse histologique. Ceci permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures.

Raffinement

- Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Après chaque procédure invasive, un suivi renforcé des animaux sera réalisé afin d’identifier toute forme de souffrance ou d’atteinte de point limite ; - Les animaux seront hébergés à plusieurs par cage à chaque fois que cela est possible ; - Un enrichissement varié (tunnel, éléments de nidification, briquettes en bois) leur sera apporté ; des friandises issues de fournisseurs d'aliments pour animaux de laboratoire leur seront données après la réalisation des gestes ; - Si possible, les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins une semaine avant le début des tests.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur le rat Long Evans. Le rat est un des modèles recommandés dans les lignes directives de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques, domaine d’expertise du laboratoire. La souche Long Evans a été choisie car il est possède une oreille interne plus proche de l’Homme que celle des rats Albinos. Les procédures sont réalisées sur des rats adultes afin que la croissance du crâne soit terminée, et permettre ainsi les chirurgies crâniennes.

360 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 300 tués à l'issue et 60 réutilisés dans d'autres projets. Ils reçoivent des administrations répétées d'un candidat médicament et jusqu'à dix prélèvements sanguins à l'oreille par 24 heures, certains subissant une chirurgie d'implantation d'un cathéter artériel suivie d'un isolement pouvant durer deux semaines. Le porteur indique que les animaux cathétérisés et ceux destinés à des prélèvements d'organes sont mis à mort. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", aucune méthode in silico ou in vitro ne reproduisant la pharmacocinétique dans un modèle en "corps entier".

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer le profil pharmacocinétique et la tolérabilité de futurs médicaments après leur administration chez le lapin. Pour cela, au cours de chaque étude, des prélèvements sanguins répétés sont réalisés chez l’animal vigile après l’administration du candidat-médicament afin d’évaluer la concentration du produit testé et/ou des métabolites. Dans certains cas, une chirurgie préalable sera nécessaire afin d'implanter un cathéter dans une artère pour réaliser les prélèvements sanguins. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à une grille de surveillance adaptée à chaque étude et en particulier des sites d’injection (tolérance locale). Des prélèvements d'organes post-mortem pourront être effectués en fin d'étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes sur le profil pharmacociétique chez l'animal et d’évaluer ses éventuels effets secondaires locaux avant de pouvoir passer aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Selon la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Les composés à tester seront administrés aux animaux par différentes voies avec moins de 3 min par administration (2 administrations max/jour, sur un mois max). Ces administrations pourront être réalisées chez l'animal vigile ou chez l'animal anesthésié. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile au niveau de la veine marginale de l'oreille ou de l'artère centrale de l'oreille (environ 2 minutes par prélèvement). Le nombre maximal de prélèvement sur 24h sera de 10. Dans certains cas, une chirurgie d'implantation de cathéter (sous anesthésie générale) pour réaliser ensuite les prélèvements de sang sera nécessaire (durée 20-45min).

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les membres de la Structure Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques. La manipulation d'animaux vigiles pour induire l'anesthésie, l'analgésie, administrer le produit et réaliser les prélevements de sang peut engendrer à l'animal un stress mineur de durée courte. La chirurgie d'implantation (si elle a lieu) peut induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins postopératoire. Post-chirurgie, les animaux seront isolés (2 semaines maximum) pour éviter toute détérioration du cathéter. Cet isolement engendrera un stress d'intensité modérée. Les lapins de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun (24h maximum). Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations sous-cutanés, intrapéritonéales, intradermique, intramusculaire et intraveineuse ; ou une contrainte légère lors de l'administration par voie orale du produit ; ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins à l'oreille.

Devenir

Tous les animaux implantés avec des cathéters seront mis à mort. Seront aussi euthanasiés les animaux pour lesquels des prélèvements d’organes sont prévus en fin d'expérience. Certains animaux pourront être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le lapin afin d'étudier la pharmacocinétique d’un candidat médicament. La pharmacocinétique consiste à suivre le devenir d'un produit dans un organisme (le plus souvent, concentration du produit dans le sang). Le candidat-médicaments dans un organisme (de son entrée à sa sortie) est soumis à différentes voies d'absorption puis de dégradation pour enfin être éliminé (dégradation hépatique, rénale, etc..). Ainsi, le recours à l'animal est à l'heure actuelle indispensable car il est nécessaire d'utiliser un modèle en "corps entier". En effet, aucune modélisation in silico ou analyse in vitro ne peut reproduire la complexité de la pharmacocinétique d'un composé chez le mammifère (absorption, dégradation, élimination).

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (6 animaux/groupes ou dose) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer d'éventuelles analyses statistiques. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques (avec échelle de cotation des réactions observées en local), • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.,• La mise en groupe des animaux (hors animaux implantés avec un cathéter)• La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, •Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période postopératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le lapin est très utilisé dans les modèles d'hemostase. Cette espèce est donc particulièrement pertinente pour évaluer le profil pharmacocinétique de substances en complément d'études sur la coagulation. Ce projet sera réalisé sur des animaux adultes car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal boit de l'eau contenant des ions perchlorates pendant quatre mois, avant l'induction d'une colite par instillation intra-colique, provoquant perte de poids et d'appétit sur deux jours. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré car il fausserait les résultats, et que les animaux souffrant trop seront isolés ou tués. Il présente cette étude comme "exploratoire", préalable à un projet "plus complet" sur le lien entre pollution et maladie de Crohn.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. La France est un pays fortement agricole et un des plus utilisateur de pesticides en Europe. Un cluster de sur-prévalence de la MC est notamment situé dans le nord de la France, région très sujette aux épandages massifs de produits phytopharmaceutiques (PP). Depuis quelques années une nouvelle préoccupation autour des effets santé des ions perchlorates est en train de naître. Ces ions sont des contaminants de l'eau de boisson et sont notamment issus de l'ionisation en milieu aqueux des perchlorates d'ammonium et de potassium issus principalement de la dégradation d'anciennes mines et munitions issus de la guerre mais peuvent provenir également de rejets industriels. Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire sur l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive. L’objectif de cette étude exploratoire est de pouvoir répondre à cette demande avant de redéposer un projet plus complet.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment que peu d'information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données essentielles et importantes concernant un potentiel effet pro-oxydant et pro-inflammatoire des ions perchlorates sur le système digestif. D'autre part, le développement d'une colite expérimentale chez des animaux traités ou non par les ions perchlorates apportera des données supplémentaires et capitales sur la capacité de ces ions à modifier le profil inflammatoire colique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des ions perchlorates de sodium dans l'eau de boisson pendant 4 mois consécutilfs. Ce mode d'administration ne génère aucune perturbation dans le bien-être des animaux. Après les 4 mois d'administration des ions perchlorates, nous induirons une colite expérimentale chez certains groupes d'animaux comme décrit dans le protocole expérimental. Ce modèle de colite est un modèle inflammatoire d'intensité modérée d'une durée de 3 jours limitant au maximum les potentiels effets délétères chez les animaux. Ce modèle est parfaitement maîtrisé par l'expérimentateur. Une perte de poids et d'appétit est observée au cours des deux premiers jours de colite. A l'issue des 3 jours de colite, les animaux sont mis à mort pour prélèvements tissulaires comme décrits précédemment.

Impact sur les animaux

Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 16 semaines. La procédure est qualifiée de légère. Le modèle de colite expérimentale est un modèle de colite très modérée. La procédure est qualifiée de modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée. L'administration du TNBS se fait par l'intermédiaire d'un capillaire en plastique inséré dans le colon à 5 cm de l'anus. Cette administration ne dure qu'environ 2 min et se fera sous anesthésie. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage respective et surveillés régulièrement pendant les heures suivant la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale pour les prélèvements de sang et d'organes ainsi que l'analyse ultérieure des marqueurs d'intérêt.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité chez de jeunes animaux soumis ou non à un polluant environnemental administré par voie orale (eau de boisson), impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=96; n=12/groupe expérimental) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles et femelles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure. De ce fait, 12 animaux mâles et femelles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique, cela aurai pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables. Les animaux seront suivi quotidiennement avec une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose induira une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat, excepté une perte d'appétit et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas où nous observerons des signes de douleur trop importants, l'animal sera isolé de ses congénères, voire mis à mort. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années pour cette espèce. Notre hypothèse de travail est que l’exposition aux ions perchlorates pendant des phases critiques du développement (enfance et adolescence) pourrait favoriser la survenue des MICI. Nous avons sélectionné un stade de développement en adéquation. Les animaux mâles et femelles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 16 semaines consécutives. A l'âge d'environ 21 semaines, les animaux subiront une anesthésie pour l'induction de la colite expérimentale. Nous souhaitons travailler pendant la phase aiguë inflammatoire et devront mettre à mort les animaux 3 jours après l'induction de la colite.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à des fins d'enseignement universitaire. Chaque animal est infesté chirurgicalement par le ver Taenia crassiceps, gardé 70 jours, puis soumis à des tests comportementaux (open field, planche à trous, boîte claire-obscure, néophobie, rotarod) avant la mise à mort et le prélèvement des parasites. Le porteur décrit un projet pédagogique servant de "fil rouge" sur trois années de licence pour 200 à 250 étudiants. Il affirme qu'une partie des résultats repose sur une "approche pédagogique alternative" par analyse bibliographique.

Objectifs

Taenia crassiceps est un parasite à cycle complexe qui possède comme hôte définitif un canidé sauvage ou domestique et comme hôte intermédiaire un rongeur. Chez l’hôte intermédiaire la souris, le parasite réalise une multiplication asexuée intense. L’augmentation de la charge parasitaire est associée à une modification des taux d’hormones sexuelles chez les souris. Les souris femelles voient leur taux d’œstrogène augmenter très significativement. Les souris mâles arrêtent de produire de la testostérone et produisent des œstrogènes ce qui conduit à une féminisation des mâles hormonalement parlant. Ces changements hormonaux s’accompagnent de modifications profondes de la réponse immunitaire et des comportements des souris parasitées. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir étudier l’ensemble de ces modifications et du fonctionnement de cette interaction hôte parasite au travers de plusieurs enseignements réalisés en Licence de biologie en Licence 1ère année sera étudiée la multiplication asexuée par bourgeonnement du parasite, en licence 2ème année seront quantifiés les taux d’hormones sexuelles dans le sang de souris mâles et femelles, en licence 3ème année sera étudiée la réponse immunitaire des souris saines et infectées par le parasite ceci par l’intermédiaire de numérations lymphocytaires sur frottis sanguins et les comportements des souris saines et parasitées seront analysés en focalisant sur des comportements de stress et de mesure de la capacité physique des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet pédagogique permet aux étudiants d’aborder dans un modèle d’interaction hôte parasite de nombreux concepts écologiques, physiologiques, endocrinologiques et moléculaires. L’idée de ce projet est un fil rouge que les étudiants analysent tout au long de leurs trois années de licence et qui leur permet de comprendre comment un parasite peut prendre le contrôle de son hôte à son profit, ceci leur permet de développer des analyses intégratives des molécules aux populations pour comprendre comment cette prise de contrôle s’opère. Ceci est déterminant pour les apprentissages que l’équipe pédagogique souhaite que les étudiants maîtrisent en fin de Licence afin de les former au mieux pour leur poursuite d’étude en Master.

Procédures

Infestations expérimentales de souris par les larves du cestode Taenia crassiceps par chirurgie. Une seule intervention chirurgicale est pratiquée chez les animaux, l'acte chirurgical dure environ 8 minutes / animal. Les animaux sont ensuite gardés à l'animalerie 70 jours avant euthanasie et prélèvement de sang et des parasites. Les animaux sont soumis à des tests comportementaux réalisés par les étudiants sur souris saines et infectées (openfield, planche à trous, boite claire/obscure, néophobie, rotary road), pour chaque souris, chaque test comportemental est réalisé pendant 60 secondes d'observation.

Impact sur les animaux

Les nuisances qui peuvent être attendues sur les animaux sont liées à la chirurgie pratiquée pour l’infestation. L’infestation est réalisée par une incision extrêmement réduite (3 mm), un seul point de suture est réalisé pour refermer l’incision. De plus, la gestion de la douleur post-opératoire est assurée par une injection sous-cutanée de Buprénorphine toutes les 12h pendant 24h. Le développement des larves dans la cavité péritonéale ne provoque pas de nuisances sur les tissus des rongeurs. Les larves du parasite sont libres dans la cavité péritonéale et ces larves se nourrissent par osmotrophie trans-tégumentaire sans aucun effet direct sur les tissus de leur hôte. A 70 jours, la charge parasitaire est faible chez les animaux et ces derniers sont euthanasiés avant que le parasite n’induise de potentielles souffrances chez l’animal.

Devenir

Le but du projet est de produire des parasites de l'espèce Taenia crassiceps et de récupéré du sang chez la souris souris, ainsi que d'étudier les comportements des animaux. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites et le matériel biologique afin d'assurer l'ensemble des approches pédagogiques envisagées.

Remplacement

IImpossible, on ne peut pas réaliser le cycle du parasite in vitro. Il n'existe pas non plus de culture cellulaire permettant de mener des approche similaires in-vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte intermédiaire pour être maintenu et la souris est connue pour être l’hôte intermédiaire privilégié pour cette espèce de cestode. La technique d’infestation chirurgicale permet de maintenir en laboratoire le parasite par transfert des parasites de souris à souris et donc en ne manipulant exclusivement que le stade larvaire du parasite, sans ne jamais passer par le stade adulte. Dans la stratégie 3R , le nombre d'animaux utilisé est le plus faible possible car nous veillons à ce que ce soit les mêmes animaux qui soient utilisés pour les tests comportementaux et pour ensuite la récupération des échantillons biologiques utilisés par les étudiants. Pour limiter également l'utilisation des animaux, une partie des analyses et des résultats exploités par les étudiants sont acquis à partir d'une approche pédagogique alternative reposant sur l'analyses bibliographiques de la litérature scientifique existante sur le sujet des modifications physiologiques et comportementales induites par les parasites chez leurs hôtes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été pensé pour réduire au maximum les animaux utilisés tout en maintenant un travail statistiquement et scientifiquement robuste de la part des étudiants. Un total de 360 souris sera utilisé dans ce projet et cela permet de travailler avec les étudiants de 3 années de Licence dans 4 matières d’enseignement ce qui représente un contingent total d’environ 200 à 250 étudiants selon les années. La souris permet de produire des parasites et le matériel biologique nécessaire à l’ensemble des approches proposées sans ressentir de souffrance ou mortalité précoce. Le nombre d’animaux est basé sur 6 lots de 6 souris mâles ou femelles saines et parasitées. 6 lots car les étudiants en TP sont répartis en 6 groupes de 3 étudiants (trinômes) qui pourront chacun travailler avec 6 souris par conditions expérimentales afin d’avoir un nombre suffisant de réplicas biologiques pour mener des approches statistiques robustes. Pour les tests comportementaux les mêmes lots de souris sont utilisés. Le sang récupéré chez les souris à 70 jours d’infection est suffisant pour faire travailler l’ensemble des autres groupes d’étudiants de licence 1ère, 2ème et 3ème année toujours dans ce même objectif de réduire le nombre de souris qui sont utilisées. Ainsi le besoin annuel en animaux s’élève à 72 souris par an.

Raffinement

Nous avons fixé le nombre optimal de parasites qui sont utilisés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de cestodes et d’induire les modifications physiologiques et comportementales sans engendrer de mortalité chez la souris. Le temps de développement au sein de l’animal a également été optimisé pour récolter les parasites et les échantillons biologiques avant que la pathologie induite par le parasite soit dommageable pour la souris hôte. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Pendant le développement du parasite chez l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu. La mortalité ne survient jamais suite à l’infestation. L’infestation par chirurgie pour le transfert des larves du cestode peut être une source d’inconfort pour l’animal, mais des soins post-opératoires sont prévus afin de palier à ces potentielles souffrances, le protocole a été pensé pour éviter tout signe de souffrance. Cependant, durant cette période de développement parasitaire, tout rongeur retrouvé en souffrance, score de 3 dans les points limites (voir annexe 1), est euthanasié par un personnel habilité. L’euthanasie peut également être effectuée par le RBEA. Les points limites sont : la pâleur de l’animal, la perte de contacts sociaux, le dos vouté, le poil hérissé, les yeux mi-clos, diminution ou arrêt de l’alimentation, l’immobilité ou le museau gonflé ; le pointage pour chacun de ces points limites est de 1 ou 2. Chaque animal ayant un score égal ou supérieur à 3 est euthanasié au CO2. Aucune médication n’est donnée car l’infestation par le parasite n’est pas réversible ; aucune médication ne peut être donnée car elle interfère avec le développement du parasite. Le point d’arrêt a été fixé à 70 jours post-infestation. Avant chaque séance de travaux pratiques l'enseignant responsable et le technicien animalier (titulaires du niveau 1 et chirurgie) informent les étudiants sur la réglementation et l'éthique sur l'utilisation des animaux en science. Les bonnes pratiques en terme de manipulation des animaux leur sont présentées afin d'éviter tout stress pour les animaux en particulier dans les tests comportementaux pratiqués par les étudiants.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est l’hôte intermédiaire le plus souvent retrouvé en milieu naturel pour ce cestode parasite Taenia crassiceps. La souris apparaît donc comme le modèle principal pour maintenir les larves du cestode Taenia crassiceps en laboratoire. La souris permet de produire les parasites et le matériel biologique parfaitement adaptés aux tests envisagés en minimisant la souffrance et en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes. Les animaux infestés sont âgés de 8 à 9 semaines.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.