Procédures modérées

41 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs yeux, afin d'étudier le rôle du micro-ARN mir155 dans la formation des vaisseaux de la rétine. Le bénéfice avancé reste conditionnel, un futur médicament qui préserverait l'intégrité des vaisseaux si le mir155 les déstabilise. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'angiogenèse de la rétine et qu'aucune culture 3D n'est envisageable.

Objectifs

L'angiogenèse est un processus biologique qui consiste en la formation de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus est conduit par les cellules endothéliales. Il est fondamental pour la cicatrisation des tissus et le développement embryonnaire. Cependant, l’angiogenèse aggrave de nombreuses maladies telles que le cancer et les pathologies inflammatoires chroniques. Une dérégulation de ce processus est responsable des rétinopathies. Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures. L’accessibilité du réseau vasculaire à la surface de la rétine permet une quantification précise de différents paramètres comme la fraction de tissu vascularisé, la densité de vaisseaux et le niveau de ramification du réseau vasculaire, et cela sur l’intégralité de la surface de la rétine. Il existe déjà des protocoles standardisés pour la quantification de ces paramètres dans ce modèle. Ceci est réalisable en injectant d’une part, un inhibiteur (anti-miR-155 ou antagoMir) pour évaluer sa capacité à bloquer le processus, et d’autre part en injectant un activateur (miR-155 mimic) pour stimuler le processus. L’analyse des paramètres d’angiogenèse sera effectuée par microscopie confocale après immunofluorescence réalisée sur les rétines entières, à l’aide d’un protocole déjà établi.

Bénéfices attendus

Si le Mir155 déstabilise les vaisseaux sanguins matures, il sera possible d'utiliser un medicament qui l'inhibera pour que les vaisseaux restent intacts (intégrité vasculaire préservée)

Procédures

Nous souhaitons dans un premier temps, administrer localement (injections intraoculaires sous anesthesie générale par inhalation d'isofluorane ) deux doses différentes de ces molécules couplées à un fluorochrome afin d’évaluer la quantité de molécules que nous retrouverons dans les cellules endothéliales de la rétine. Dans un deuxième temps, nous administrerons ces deux molécules non marquées, à la concentration la plus efficace (d’un point de vue de la demi-vie et du ciblage des cellules endothéliales) , afin de déterminer leurs effets sur l’angiogenèse (ce qui nous permettra ensuite de réduire le nombre d’animaux). L'intervention dure 20 min. Le prélèvement de la rétine ne peut se faire sans éviter l'euthanasie de l’animal .

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir de la procédure d’injection intraoculaire. Il n’y pas d’inconfort ou d’effets indésirables connus causés par cette procédure comme déjà décrit dans la bibliographie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale . Il est impossible d'étudier l'angiogenese de la rétine sans euthanasier l'animal puisque nous devons prélever les yeux pour l'extraire.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier la croissance et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). La mise au point de certains paramètres (dose-réponse, toxicité, demi-vie du composé à injecter…) de l’expérience peut être réalisée sur cellules endothéliales d’origine commerciale mais il est impossible de « mimer » l’angiogenèse de la rétine et d’étudier son intégrité en culture 2D. Aucun protocole de culture 3D n’est envisageable.

Réduction

Basé sur notre expérience du modèle, nous devons prendre en compte que les étapes d’injection et dissection peuvent induire la perte de 10% des échantillons (1 œil) et que le traitement pourrait échouer sur 10% des animaux (1 œil). Par conséquent, nous avons pu réduire le nombre d’animaux à 5 animaux par sous-condition pour que l’analyse soit statistique ceci pour chacun des 3 groupes expérimentaux. D’autre part, l’avantage d’étudier l’œil est que chaque animal constitue son propre contrôle car nous étudierons aussi l’œil non injecté (contralateral) qui constituera un contrôle interne permettant d’évaluer les effets du composé injecté (animaux traités au miR ou antimiR) et également les effets de la procédure d’injection en elle-même (animaux injectés avec la version contrôle du miR ). Ceci permet de réduire le nombre d’animaux en évitant de sacrifier une autre série d’animaux juste pour collecter des yeux sains.

Raffinement

Les souris adultes sont hébergées en groupe sociaux, la plupart du temps entre frères ou entre sœurs dans un environnement approprié (litière, boisson et alimentation, dôme) L’élevage est supervisé par le personnel compètent de l’animalerie conventionnelle Pour limiter une éventuelle douleur liée à l’injection, un anesthésique local en gel ophtalmique sera appliqué sur la paupière avant et après l’injection. De plus, nous délivrerons un anti-inflammatoire non steroidien qui permettra une couverture de la douleur sur 24h, soit jusqu'à l'euthanasie des animaux Nous veillerons à ce que la phase de réveil se fasse dans les meilleurs conditions (surveillance accrue, température de la cage...). Nous veillerons à ce que les animaux s’alimentent et s’hydratent normalement. Nous surveillerons leur comportement et l’apparition d’éventuelles blessures.

Choix des espèces

En se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait que le modèle de rétine postnatale de souris C57Bl6J est le plus approprié pour l’étude de l’angiogenèse in vivo. Ce modèle présente l’avantage d’être peu invasif . Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau, subit une biopsie de la queue et des tests de mémoire en labyrinthe, pour étudier le lien entre un récepteur et les lésions de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique des douleurs liées à la biopsie et aux injections stéréotaxiques et un stress lié aux tests. Il qualifie de "stricte nécessité" le recours à des animaux vivants pour relier comportement cognitif et lésions du cerveau.

Objectifs

L’objectif général de ce projet et de la présente demande vise à mieux comprendre le lien entre le récepteur FXR (et son rôle dans l'insulinosensibilité centrale) et les mécanismes physiopathologiques de la maladie d'Alzheimer et ce, en appréhendant les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement des lésions dans la maladie d'Ahzheimer et les tauopathies (pathologies caractérisée une agrégation intraneurale de la proteine Tau) et pouvant être influencer par le récepteur FXR. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA pouvant in fine aboutir de nouvelles startégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre projet va apporter la preuve de concept selon laquelle le récepteur FXR pourrait influencer la pathlogie Tau physiopathologie de la MA et des tauopathies.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de vecteurs viraux (voies intracraniale: 1x, moins de 5min,procédure entière moins de 60 min). Nous réaliserons également des tests de comportement afin d’évaluer les performances cognitives des animaux (actimétrie: 1x, 10 min; labyrinthe: 1x, 10min, 130 moin en cage d'hébergement (phase de retention) et 5 min soit 45 min). Les animaux subiront une biopsie de queue (moins de 5 min, 1X).

Impact sur les animaux

Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue (douleur modéré; 1x) -Stress associé aux investigations comportementales -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiquesdouleurs/infections post-opératoires

Devenir

En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés; à savoir mettre en lien le comportement cognitif et les lésions histopathologiques et l'insulinosensibilité centrale. Ce lien nécessitant l amise à mort de tous les animaux pour pouvoir réaliser des marquages histologiques, immunomarquages et/ou western blot. De ce fait, aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de ce projet sur les 5 ans à venir est estimé à 360. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout enpermettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombred’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.

Raffinement

LES ANIMAUX SERONT OBSERVES TOUS LES JOURS, PESES REGULIEREMENT, PAR DU PERSONNEL SPECIALEMENT FORME. DURANT LES DIFFERENTS PROTOCOLES, TOUT SERA MIS EN OEUVRE POUR MINIMISER LE STRESS AUQUEL LES ANIMAUX SONT SOUMIS. LES ANIMAUX SERONT HEBERGES EN GROUPE, ET DES ELEMENTS D'ENRICHISSEMENT DU MILIEU SERONT MIS A DISPOSITION, PAR EXEMPLE COTON POUR LA CONFECTION DE NIDS... LES ANIMAUX SERONT SUIVIS PRECISEMENT POUR CHAQUE PROTOCOLE, POUR LESQUELS DES POINTS LIMITES ADAPTES ONT ETE DEFINIS. TOUTE SOUFFRANCE, ANGOISSE OU COMPORTEMENT INHABITUEL SERA PRIS EN CHARGE PAR DES APPROCHES APPROPRIEES. LES PROCEDURES EXPERIMENTALES DE CHIRURGIES SERONT REALISEES SOUS ANESTHESIE GENERALE PAR VOIE INTRAPERITONEALE. EN CAS DE DOULEUR, UN ANALGESIQUE SERA ADMINISTRE. LES ANIMAUX PRESENTANT UN DES POINTS LIMITES SPECIFIES POUR CHAQUE APPROCHE EXPERIMENTALE SERONT SACRIFIES DANS UNE SALLE DEDIEE; LE TOUT EN LIEN AVEC LE RESPONSABLE DU BIEN ETRE ANIMAL.

Choix des espèces

Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (pathologie Tau). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’expression cérébrale de FXR via l'usage de vecteurs viraux et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire.

84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau provoquant une lésion du cortex moteur, la pose d'une électrode sur le nerf vague et des séances de stimulation et de tests moteurs. Le porteur indique que la lésion peut réduire la préhension de la patte avant droite et que la pose de l'électrode peut gêner la nuque. L'étude vise à savoir si la stimulation du nerf vague améliore la récupération après une lésion cérébrale, en vue d'une transposition "à plus long terme" chez l'humain.

Objectifs

Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. Un tier d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Comme nous l’avons montré depuis plusieurs années chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisés. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. Elle permet une récupération des fonctions motrices et une modulation bénéfique de molécules de l’inflammation et du stress oxydatif. La question est donc de savoir si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion cérébrale afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’Homme. . Les objectifs de ce projet sont donc (1) de développer les techniques de lésion cérébrale et stimulation du nerf vague et (2) de tester les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion.

Bénéfices attendus

La mise en place de ces techniques de lésion cérébrale et de stimulation du nerf vague chez le rat permettra de conclure sur les effets de la stimulation du nerf vague après une lésion cérébrale qui est une étape cruciale dans la recherche d’optimisation de la thérapie cellulaire pour la lésion cérébrale. En effet, les effets bénéfiques attendus de la stimulation du nerf vague sur la lésion cérébrale pourront être évalués à court terme dans le cadre de la thérapie cellulaire pour optimiser les conditions de greffe et ainsi mieux prendre en charge la réparation cérébrale après une lésion chez l’animal. Le but à plus long terme étant d’appliquer ces deux approches thérapeutiques (transplantation + stimulation) chez l’Homme ayant subi une lésion cérébrale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale en présence d'antalgiques pour tous les animaux, durée de 10 min pour 84 rats ou 40 min pour 24 rats. Pour tous les animaux: 2 ( 84 rats) ou 3 ( 24 rats) sessions de tests du comportementaux moteur en condition vigile, durée 10 min par session. Pour ces 24 rats: stimulations du nerf vague en condition vigile, durée 30 min: 1 session pour 12 animaux et sessions répétées quotidiennes, 5 jours par semaine pendant 4 semaines pour 12 autres animaux. Pesées en condition vigile: 1 fois par jour en suivi post-chirurgie pour tous les animaux, puis 1 fois par semaine pendant 5 semaines pour 24 animaux.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil, et une légère perte de poids ponctuelle pourrait également apparaitre. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. Le placement de l’électrode pourra entrainer une gêne et un inconfort au niveau de la nuque. Lors des pesées individuelles des animaux, ou des tests de motricité, les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant maximum 10 minutes. Pour la stimulation du nerf vague les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sans contention dans laquelle ils pourront se retourner ou se mettre sur les pattes-arrières pendant toute la durée de la stimulation (30min) puis ils seront replacés dans sa cage d’hébergement avec leur congénère. La stimulation est indolore. La stimulation aiguë pourra engendrer un léger stress lors du placement de l’animal dans le dispositif. Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’analyser les effets in vivo d’une stimulation du nerf vague sur une lésion cérébrale du cortex moteur afin d’optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire dans le cadre de la lésion cérébrale chez l’Homme. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.

Réduction

Cette étude est une mise au point technique avec une procédure de type go, no go. Elle permet, de fait, la réduction du nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps 3 groupes de 12 animaux seront utilisés et si les résultats sont validés les expériences sur 4 autres groupes de 12 animaux seront menées. Des tests statistiques nous ont permis de déterminer le nombre minimal d'animaux pour avoir des résultats significatifs. De plus, cette étude sera réalisée sur les 2 sexes, les mâles et les femelles car le traumatisme crânien concerne aussi bien les hommes que les femmes, mais nous serons attentifs à l’éventuel impact du sexe sur nos résultats. Les mâles et femelles ne peuvent être hébergés dans la même cage et l’isolement étant un stress pour les rongeurs, nous aurons besoin de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) par groupe, afin que chaque rat ait un congénère dans sa cage. L’ensemble du projet prévoit donc minimum 3 groupes de 12 animaux et maximum 7 groupes de 12 animaux. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. En effet, les animaux seront placés dans leur cage d’hébergement par 2 de même sexe, 10 jours avant les expérimentations. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion et la stimulation afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi en post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague (. De part sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes de souche non-consanguine Sprague-Dawley (âgées de 8 semaines) car l’intérêt scientifique concerne la lésion corticale traumatique chez l’adulte. A 8 semaines la différence de poids entre mâle (320-380g) et femelle (210-260g) est importante mais ne gênera pas l’expérimentation, nous utiliserons donc des rats mâles et femelles agés de minimum 8 semaines (adultes) car le traumatisme crânien est aussi fréquent chez les femmes que les hommes.

320 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immunisé de façon répétée puis subit des prélèvements de sang portant sur plus de 10 % du volume sanguin sans reconstitution, avant une exsanguination finale sous anesthésie pour récolter le sérum. Le porteur indique maintenir les animaux en vie de 11 à 24 mois pour produire ces anticorps destinés à la transplantation et à la cancérologie. Il justifie le choix du porc par le volume de sérum récolté, un animal remplaçant selon lui plus de cent "petits animaux".

Objectifs

L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales, pour des applications de développement clinique en transplantation et en cancérologie. Cette saisine est un amendement à l’autorisation APAFIS dans le but d’optimiser le protocole d’immunisation avec notamment la recherche de la meilleure voie d’administration.

Bénéfices attendus

Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue vis-à-vis des cellules ciblées, 3- une activité anti-inflammatoire. 4- une spécificité démontrée par une série d’analyses histologiques sur tissus humains.

Procédures

Prélèvements de sang sous tranquillisation (animaux à moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation ; - 10 minutes pour l’administration injectable de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Il est à noter que plusieurs animaux peuvent être manipulés en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens). Les temps pris par les procédures vont s’intercaler ce qui permet aux opérateurs de réduire le temps global des procédures.

Impact sur les animaux

Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

Devenir

A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou par un euthanasiant.

Remplacement

Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels (existant principalement dans les domaines de l’envenimation, de la transplantation et de l’anémie aplastique sévère) par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans).

Réduction

Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le petits animaux), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. Un porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux. Aucun test statistique ne soutient cette comparaison qui est évidente à l’ égard de la différence de taille entre ces espèces (un porc pesant en moyenne 110 Kg). En outre, le porc est maintenu en vie pendant une période de 11 à 24 mois, alors que les protocoles de prélèvement de sérum sur petit animal comprennent en général une à 2 prises de sang avant mise à mort par exsanguination. Ces 2 facteurs justifient les différences importantes dans le nombre d'animaux nécessaires pour collecter une quantité identique de sérum, lorsque des porcs sont choisis et non des petits animaux (tels que des lapins). En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. C’est pour cette raison que nous réalisons cet amendement. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps.

Raffinement

Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas pour éviter l’écrasement des porcelets. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage. L’optimisation du protocole d’immunisation permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection).

Choix des espèces

Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné dès l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’anticorps pour soigner de 100 à 1000 patients (en fonction de la dose administrée dans les indication de Transplantation ou d’oncologie). Les porcelets sont élevés puis immunisés à partir d’un minimum de 6 semaines d’âge (> 20Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules de mélanome sous la peau, jusqu'à dix gavages et six injections dans l'abdomen, pour tester une molécule censée resensibiliser les tumeurs aux traitements. Le porteur indique que la tumeur au flanc peut gêner les déplacements et que le gavage peut irriter la trachée. Les retombées pour les patients atteints de mélanome résistant restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de démontrer l'effet de la molécule chez la souris.

Objectifs

Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, un gène fréquemment altéré et impliqué dans la résistance aux traitements. Nous avons identifié une molécule capable d'inhiber l'action de ce gène et de resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales, un gavage par jour ou tous les deux jours pendant deux semaines soit 6 ou 10 gavages et pour certains animaux. Certains subiront aussi 6 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement. Le gavage peut provoquer une irritation de la trachée, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress. Aussi, les injections peuvent induire des plaies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur).

Raffinement

Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.

75 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit par voie rectale un produit destiné à provoquer une inflammation du côlon, subit des coloscopies et des IRM sous anesthésie, puis l'administration orale ou rectale d'un anticorps. Le porteur indique que l'induction de l'inflammation peut entraîner saignements, douleurs, diarrhées et déshydratation, et que les animaux sont tués par injection intracardiaque en fin de protocole. Il décrit le mini-porc comme le "modèle le plus adapté" pour tester une nouvelle forme orale d'un médicament déjà commercialisé en perfusion.

Objectifs

L’inflammation chronique de l’intestin et du côlon (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Selon l'Association François Aupetit (AFA), 8000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année en France. Les traitements conventionnels des MICI sont à base d’antiinflammatoires (acide 5-amino-salicylique, Pentasa®), de corticoïdes ou d’immunosuppresseurs (Azathioprine). Dans cet arsenal thérapeutique, l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-TNF en monothérapie s’avère être efficace, notamment sur les cas compliqués. Ce sont les molécules les plus puissantes disponibles actuellement en clinique. En 2014, 3 formes de ce médicament à base d’anti-TNF ont obtenu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en France pour le traitement des MICI administré par perfusion. Leurs indications ciblent le traitement de la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique modérée à sévère chez les patients réfractaires aux traitements conventionnels cités ci-dessus. Cependant, les effets secondaires de ces nouveaux médicaments sont parfois importants pour les patients, notamment l’apparition des saignements liées à l’injection répétée par voie intraveineuse de ce médicament. De façon intéressante, nous avons développé une autre forme de ce médicament de manière à l’administrer par voie orale. Cette voie permettra ainsi d’éviter ces effets secondaires. Cependant, l’efficacité de ce médicament administré par voie orale reste à démontrer. Cette recherche préclinique chez le mini-porc permettra de valider d’une part la faisabilité et la tolérance de la voie orale pour l’administration de ce médicament et d’autre part, l'efficacité thérapeutique de son activité anti-inflammatoire dans un contexte pathologique. Cette étude comportera deux grands objectifs : (1) Valider un modèle animal (mini-porc) qui développe la maladie de l’inflammation chronique de l’intestin et du colon, (2) confirmer la sécurité et l’efficacité du traitement administré par voie orale par rapport à la voie parentérale (perfusion) et rectale.

Bénéfices attendus

Notre étude apportera la validation préclinique d’une formulation pharmacologique innovante permettant d’administrer un traitement anti-TNF par voie orale. De manière générale, cette étude apportera un intérêt clinique majeur chez les patients souffrant de pathologies chroniques et déjà sous traitement parentérale (perfusion). L’utilisation d’une nouvelle forme galénique innovante s’accompagnera d’une meilleure tolérance et d’une action d’installation plus rapide que les traitements actuellement mises sur le marché. Les bénéfices attendus par l’utilisation d’un bio-médicament avec une nouvelle forme galénique administrée par voie orale sont nombreux : 1. Une libération locale ciblée de la substance active au site d'action. 2. Réduction des infections à répétitions. 3. Une meilleure observance du traitement liée à un mode d’administration plus simple, sans les contraintes de stockage et de stérilisation retrouvées avec les formes injectables. 4. diminution importante de la charge hospitalière (soulagement du système économique de la santé) 5. La fabrication d'une forme galénique sèche (comprimé) est simple et moins couteuse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection par voie intra-rectale (induction de l’inflammation par 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) et le Dextran Sulfate Sodium (DSS) + injection du traitement en solution ou dispersion), un gavage (administration des comprimés) et deux examens d'imagerie pour l’évaluation et le suivi du traitement (coloscopie + IRM avec injection de produit de contraste sous anesthésie générale). L’administration du médicament par voie orale à travers la sonde nasogastrique et par voie rectale à l’aide d’une canule rectale (dispositif médical) après fixation d’une seringue va durer approximativement 10-15 min. Une surveillance rapprochée des animaux sera effectuée afin de s’assurer de la tolérance des interventions.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux notamment ceux inclus dans les phases 1 (sauf lot 1.1 : contrôle négatif), 2 et 3 (modèle de MICI), seront soumis à une injection d'un produit pouvant être irritant par voie rectale, afin de déclencher une inflammation colique. Cette intervention nécessite une anesthésie générale et l'utilisation d'une procédure de coloscopie. Cette intervention peut entrainer un saignement du colon, les animaux peuvent ressentir des douleurs, rarement une modification du poids (+/- 10%), des diarrhées pouvant entrainer une déshydratation. Par ailleurs, un stress lié à l'administration du traitement orale sera remédié avec une prémédication. Le traitement peut nécessiter une courte sédation de l'animal car le comprimé de 5 mm de diamètre ne doit pas être croqué (comprimé enrobé). Les animaux seront euthanasiés par l'injection létale intracardiaque du T61 à la fin du protocole expérimental ou lorsqu’un des points limites sera atteint.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à chaque date (Mois 3 : Phase 1 et 2, Mois 12 : Phase 3), puis une autopsie (évaluation macroscopique des tissus) et des prélèvements de tissus biologiques pour une analyse moléculaire et histologique seront effectués. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas d’apparition d’un point de limite.

Remplacement

Pour réaliser cette étude préclinique, nous utiliserons un modèle de maladie inflammatoire chronique intestinale (MICI) chez le mini-porc pour mimer la pathologie chez l’homme. Il s’agit d’un modèle animal le plus adapté d’une part par les ressemblances anatomiques et processus physiopathologiques du tube digestif avec l’homme, et d’autre part par sa corpulence proche de la taille humaine. Cette étude comporte la sécurité et l’efficacité de la forme galénique du traitement antiinflammatoire des MICI ciblant la partie distale de l’intestin. De ce fait, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation du modèle animal par une évaluation in vitro ou ex vivo ou un modèle d’intestin artificiel « in silico ». Une administration des comprimés à taille humaine chez la souris ou le rat n’est pas réalisable, elle ne reflèterait pas les conditions physiopathologiques observées chez l’Homme. De plus, ce mammifère est le plus couramment utilisé dans les évaluations pharmacologiques des MICI. A notre connaissance, aucune étude expérimentale n’a évalué à ce jour l’efficacité d’un bio-médicament sous une forme galénique par voie orale. L’utilisation chez le mini-porc d’un bio-médicament sous une nouvelle forme galénique (développé en collaboration avec un industriel) permettra de démontrer la preuve de concept in vivo (efficacité, tolérance et sécurité) dans le traitement des MICI avant la réalisation des premiers essais cliniques sur l'homme.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. De surcroît, le nombre des animaux choisis permet de réaliser une étude comparative entre les groupes d’animaux sains et avec un MICI induite. Ce qui permet de valider le modèle pathologique. Ensuite, une étude d’efficacité du traitement selon le mode d’administration « orale versus intra-rectal » sera réalisée pour comparer les groupes traités avec les non-traités « placebo ». Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une évaluation efficace de l'induction ciblée de l'inflammation au niveau du colon. Il est prévu d’évaluer l'efficacité des formes galéniques innovantes pour une période de 5 ans sur 75 mini-porcs, soit 15 mini-porcs par an en moyenne. Nous envisageons de faire des groupes de 6 à 7 mini-porcs. Ce nombre est le minimum possible, puisqu’il tient compte des analyses statistiques et des éventuelles pertes de mini-porcs pendant l'anesthésie ou des procédures liées à l’induction de l'inflammation. Nous allons réaliser des tests statistiques de comparaison entre les différents groupes de type « Mann-Whitney » non paramétrique. Les différences entre les groupes seront jugées statistiquement significatives lorsque la valeur P est inférieure à 0.05.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les mini-porcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE. La douleur liée aux interventions chirurgicales est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'induction de l'inflammation pour visualiser tout signe de complications post-opératoires imprévues qui nécessiteraient l’euthanasie de l’animal. Ainsi, les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo chez l'animal, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins, chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux (analgésiques en pré- et post-opératoire et médication spécifique pour limiter les éventuelles douleurs induites par l'inflammation). Les membres de l'équipe possèdent la formation "concevant et réalisant" et la formation de chirurgie chez l'animal (AUEC).

Choix des espèces

Le modèle d'induction de l'inflammation chronique de l'intestin (MICI) chez le mini-porc sera utilisé pour évaluer et caractériser l’efficacité in vivo de nouvelles formes galéniques. C’est l’un des meilleurs modèles d’étude des MICI puisqu’il permet de s'approcher aux conditions physiopathologiques observées chez l'homme (similitudes de l’anatomie de l'appareil digestif, de la composition de la flore intestinale et du temps de transit). De surcroît, ce modèle permettra d’utiliser des technologies perfectionnées utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme (IRM, coloscopie) dans le diagnostic, le contrôle, le traitement et le suivi de la maladie. Cette étude préclinique permettra ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI et leur traitement. L’objectif est de confirmer la preuve de concept in vivo avant de passer aux études cliniques chez l'Homme. - Dans un premier temps, les mini-porcs seront utilisés pour valider l’induction de l’inflammation chronique intestinale chez le groupe non-traité et le groupe traité par voie intra-rectale avec le bio-médicament. Ce dernier est administré soit en solution ou en dispersion d’un comprimé broyé contenant la dose thérapeutique de l’anticorps monoclonal afin de montrer d’abord son efficacité locale. L’induction de la maladie et l’efficacité locale du bio-médicament seront évaluées par le calcul des scores Wallace (étude macroscopique : extension des lésions) et Ameho (étude microscopique : immuno-histologie) et par le dosage des marqueurs biologiques (réponses inflammatoires, dosage des cytokines, MPO, TNFα, numération formule sanguine, …). -Dans un deuxième temps, les mini-porcs seront utilisés dans le cadre d'efficacité de la thérapie par voie orale. - Puis, afin de se rapprocher de la clinique en termes de taille et de structure anatomique de l'appareil digestif humain, le modèle du grand mammifère mini-porcs de type Gottingen adultes (40 à 60 kg) sera utilisé pour évaluer l’efficacité, la sécurité et la répétabilité de la thérapie à long terme (6-12 mois).

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une puce sous-cutanée, est logé seul pendant deux mois et demi, soumis pour la moitié d'entre eux à un régime gras, puis à des tests comportementaux et à un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement crée un stress chez cette espèce grégaire et que les tests peuvent provoquer anxiété et douleur modérée. L'étude cherche à relier chez le mâle et la femelle les effets d'un régime gras sur les rythmes de 24 heures, le métabolisme et la mémoire.

Objectifs

Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles. AVENANT: Notre hypothèse tertiaire est qu'un accès du régime gras et sucré chronomodulé (c'est-à-dire ici limité à la période habituelle d'alimentation chez la souris) pourrait, comme chez les individus mâles, réduire l'impact nutritionnel sur les fonctions cognitives des souris femelles.

Bénéfices attendus

La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h (approches de nutrition chrono-modulée).

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les souris recevront une puce électronique sous-cutanée, ce qui pourrait provoquer une légère inflammation au site d'injection. Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental. AVENANT: Le régime chonomodulé devrait limité le surpoids des animaux.

Devenir

L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.

Réduction

Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.