Procédures modérées

24 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale des oocystes du parasite Eimeria pour reproduire une coccidiose, une partie subissant aussi un prélèvement sanguin, avec pour signes attendus perte de poids, apathie et plumes ébouriffées. L'objet n'est pas de soigner ces animaux mais de produire du parasite pour des études in vitro, faute de pouvoir le cultiver au laboratoire. Le porteur met en avant l'ampleur économique de la coccidiose en filière avicole et conclut que l'usage d'animaux vivants comme réservoir est nécessaire.

Objectifs

Les coccidioses sont les affections parasitaires les plus dommageables en filière avicole, du point de vue économique et du bien-être et de la santé des animaux (coût mondial annuel estimé à plus de 12 millards d’euros selon ANSES, août 2022). Cette pathologie est causée par Eimeria, un parasite qui infecte l’intestin et y crée des lésions. Les conséquences de la coccidiose sont importantes : diminution de l’ingestion, inflammations, diarrhées hémorragiques, développement d’autres maladies intestinales, et dans le cas de certaines espèces du parasite, peut même causer une mortalité. Les Eimeria forment des oocystes selon un cycle de vie défini en « utilisant » les cellules épithéliales de l’intestin. Ces oocystes sont ensuite excrétés via les fientes qui sont le principal moyen de transmission entre les animaux. Il existe différentes formes de coccidiose, la forme chronique et la forme aigüe qui se caractérisent par des signes cliniques spécifiques des espèces Eimeria. Actuellement, les méthodes destinées à contrer la coccidiose reposent principalement sur l’utilisation de produits chimiques anticoccidiens et sur le développement d’une immunité contrôlée par addition d’antibiotiques ionophores dans l’aliments. Mais des résistances peuvent survenir très rapidement avec l’apparition de coccidioses subcliniques voire cliniques. Ces stratégies sont restées efficaces tant que de nouveaux médicaments étaient régulièrement introduits. Mais aucun nouveau produit n’ayant été proposé depuis l’an 2000, la sensibilité à tous les médicaments existants a diminué, favorisant l’apparition de souches plus virulentes du parasite. De plus, la demande de la société en faveur d’animaux élevés sans antimicrobiens, d’aliments exempts de résidus et l’utilisation prophylactique de produits chimiques anticoccidiens étant en croissance constante, il est nécessaire d’identifier de nouvelles molécules anticoccidiennes. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’additifs alimentaires montrant des propriétés anticoccidiennes potentielles et agissant sur de nouvelles cibles moléculaires. Ces nouvelles approches de lutte contre la coccidiose devront être aussi efficace que les médicaments ou les combinaisons de médicaments actuellement utilisés et aboutir au développement d'un additif alimentaire anticoccidien. L’identification de nouvelles molécules anticoccidiennes repose sur des tests de criblage in vitro permettant de mesurer l’activité anticoccidienne avec différentes approches.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier, à partir de test in vitro objectifs, des nouvelles molécules d’anticoccidien à destination des volailles pour faire face aux résistances des solutions actuellement disponibles, et répondre à une attente sociétale en développant une solution pouvant être classée en tant qu’additif alimentaire. L’impossibilité technique de cultiver in vitro Eimeria tenella nécessite d’utiliser des animaux comme réservoir naturel du parasite. Le nombre d’animaux est réduit à la stricte nécessité numérique du nombre de parasite nécessaire à la réalisation des tests in vitro et non à la recherche d’une production en masse du parasite, [[Modification du 15/11/2023: à la constitution d’ une banque de cellules d’animaux infestés par Eimeria sp. et à la détection de cytokines pro-inflammatoires dans les fèces pour valider une méthode d’analyse de la réponse immunitaire non invasive chez le poulet]]. Sur la base de résultats in vitro probants, un autre projet pourra être menée afin de valider in vivo l’efficacité des molécules candidates.

Procédures

Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoins nutritionels pendant 26 jours. A 21 jours d'age, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml de substance sera réalisée sur chaque animal de la cage. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progessivement en fonction de la déglutition de l'animal. [[Modification du 15/11/2023: Une partie des animaux (8 sur 24) sera soumise à un prélèvement sanguin, un volume de sang de 4 ml necessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de contention ne dépassera pas 1 min]].

Impact sur les animaux

Signes cliniques pouvant apparaitre dès 4 jours après l'administration d’oocystes infectieux sporulés : baisse de consommation d’aliments, perte de poids, frilosité, apathie, plumes ébouriffées, position en boule. [[Modification du 15/11/2023: Inconfrot et stress dû aux prises de sang]].

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux infestés seront mis à mort , ils ne peuvent pas être réutilisés.

Remplacement

L’étude in vitro des parasites unicellulaires est un challenge scientifique et Eimeria n’y fait pas exception. Si des tests in vitro mimant le comportement infectieux existent comme l’invasion cellulaire avec des lignées de rein, il est n’est pas possible d’aboutir à un cycle complet du parasite et par conséquence à sa multiplication in vitro. La culture in vitro d’Eimeria tenella reste encore à l’heure actuelle impossible. Cette impossibilité technique de cultiver in vitro Eimeria tenella nécessite d’utiliser des animaux vivants comme réservoir naturel du parasite. Lorsqu’une méthode in vitro de multiplication du parasite sera disponible l’utilisation des animaux vivants ne sera plus nécessaire.

Réduction

Dans ce projet, la procédure expérimentale mise en œuvre peut être considérée comme une étude exploratoire où l’on cherche uniquement à produire des oocystes. Seize animaux au total seront nécessaires lors des deux campagnes de production d’oocystes. Le nombre d’animaux est réduit à la stricte nécessité numérique du nombre de parasite nécessaire à la réalisation des tests in vitro dans un laps de temps évitant le développement de manifestations intestinales sévères chez l’animal (diarrhées sanglantes). Le but de ce projet n’est pas de rechercher une production en masse du parasite étant délétère pour l’animal. Le nombre de huit animaux par campagne de production d'oocystes permettra également d’améliorer les conditions d’élevage. En effet, le poulet de chair est une espèce qui a besoin d’un nombre minimum d’individu pour pouvoir mettre en place une hiérarchie sociale participant à son bien-être. Le nombre de huit animaux vivants par campagne de production d’oocystes ne semble pas pouvoir être encore réduit

Raffinement

L’inconfort, le stress de la contrainte lors du maintien des animaux dû au gavage, sont réduits par une manipulation empathique des animaux par les applicateurs de la procédure, une administration unitaire de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL et par une surveillance minutieuse quotidienne des animaux à l’aide de la grille d’observation. [[Modification du 15/11/2023: L’inconfort et le stress dus à la contention de courte durée et la douleur légère liée à l’introduction de l’aiguille lors des prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux maintenus en décubitus latérale, un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie, en piquant le plus haut possible dans la veine jugulaire (proche de la tête pour réduire la formation des hématomes) et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires Pas d'utilisation d'anesthésique local en vue du prélèvement de sang car cela nécessiterait de capturer deux fois les animaux (application du produit et réalisation du geste) entrainant un stress et un inconfort supplémentaire]]. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux ne se coincent pas les pattes dans les mailles de la grille tout au long de l’étude et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture surtout en période de démarrage (J0-J8). L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux.

Choix des espèces

Les anticoccidiens recherchés constituent une solution contre la coccidiose aviaire des poulets de chairs (Gallus gallus domesticus) en élevage et sont destinés à être incorporés dans les aliments distribués aux volailles (poulet de chair). Notre modèle d’étude sera donc le poulet de chair (Gallus gallus domesticus) Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 28 jours

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés chaque jour pendant quinze jours et une partie est rendue allergique par trois injections intrapéritonéales, le déclenchement de l'allergie provoquant une baisse de température et des douleurs abdominales. L'objet est d'évaluer l'ajout d'une composante microbienne proche du lait maternel dans des formules infantiles, avec en vue le développement de produits laitiers fermentés pour les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro.

Objectifs

Les allergies touchent 30 à 40% de la population mondiale et parmi elles, les allergies alimentaires (AA) affectent plus de 6% de la population Européenne. Il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. Elles sont liées à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des stratégies au début de la vie pour induire un microbiote intestinal optimal et ainsi prévenir les allergies. Des études ont suggéré que l’administration de probiotiques (1 à 4 souches) en périnatal avaient un effet bénéfique pour la prévention de l’eczéma. Le microbiote du lait maternel fournit un apport en bactéries dans le tube digestif du nouveau-né. Il est très divers, riche en candidats probiotiques potentiels et représente un intérêt santé certain pour le futur enfant. Il serait potentiellement protecteur des allergies mais les études restent controversées. Aujourd’hui, les formules infantiles n’intègrent pas (ou très peu), de composante microbienne par rapport au lait maternel. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt d’une composante microbienne issue du lait maternel dans les formules infantiles en comparant l’effet de différentes formules chez des souriceaux sur la prévention de l’allergie alimentaire.

Bénéfices attendus

Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfiques pour des populations à risque de pathologies chroniques telles que les allergies. Ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.

Procédures

Les femelles reproductrices seront pesées tous les 2 jours après la fin de la reproduction pour déterminer la gestation. Gavages tous les jours pendant 15 jours chez la descendance. Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. Chez la descendance, les groupes rendus allergiques alimentaires reçoivent 3 injections intrapéritonéales (aiguille 22G) et 1 gavage, espacés chacun d’une semaine.

Impact sur les animaux

Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable SBEA et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendrons la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à l’euthanasie. Les souris sont hébergées avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches et servent de modèle pour l'allergie alimentaire. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses immunologiques des différentes populations cellulaires (lymphocytes T et B) seront réalisées et l’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et males reproducteurs seront utilisés à 8 semaines de vie afin qu’ils soient matures sexuellement. Afin d’étudier s’il y a une action précoce d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires, nous utilisons des souriceaux en début de diversification alimentaire (sevrage) c’est-à-dire à 2 semaines de vie.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis trois injections intrapéritonéales par semaine pendant trois semaines, de la chimiothérapie et des injections d'anticorps, pour tester six molécules censées bloquer la liaison cIAP1-TRAF2 dans les cancers. Une partie de ces souris immunodéficientes subit aussi une vaccination avec réinjection de cellules tumorales vivantes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à un éventuel essai chez l'homme, tandis que le porteur affirme que l'analyse des tumeurs dans leur environnement rend l'usage des souris nécessaire.

Objectifs

La thérapie ciblée des cancers est une stratégie thérapeutique très prometteuse permettant de cibler spécifiquement les anomalies des cellules tumorales. En gagnant en spécificité par rapport aux traitements conventionnels, cette stratégie thérapeutique réduit considérablement les effets secondaires et améliore la qualité de vie des patients. La protéine cIAP1 est promotrice de tumeur et a été retrouvée surexprimée dans de nombreux échantillons tumoraux humains de différente origine. Elle constitue une cible thérapeutique pertinente. Il a été montré que l’association de la protéine cIAP1 avec son partenaire TRAF2 était absolument nécessaire à son activité oncogénique. Une recherche de perturbateurs de liaison cIAP1 – TRAF2 en vue d’une utilisation en thérapie anti-cancéreuse a été entreprise. Une première génération de molécules a été obtenue et une seconde génération est en cours d’élaboration. Le présent projet a pour but d’évaluer les propriétés antitumorales des molécules élaborées. Six molécules seront testées en monothérapie ou associées à de la chimiothérapie conventionnelle et/ou immunothérapie.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une étude préclinique d’évaluation de nouvelles molécules à finalité thérapeutique anti-cancéreuse. L’objectif est de sélectionner au moins une molécule qui pourra ensuite faire d’objet d’une optimisation et d’une étude pharmacologique en vue d’essai thérapeutique chez l’homme.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane et subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans du sérum physiologique. Dans la procédure 2, les souris porteuses de tumeurs recevront trois injections intra-péritonéales par semaine des molécules à tester ou de son contrôle, et ceci pendant 3 semaines. Une injection unique de chimiothérapie sera réalisée en intra-péritonéale. Dans la procédure 2 et 3, l’injection d’anticorps aura lieu 3 fois par semaine pendant 3 semaines à partir du 14ème jour post-injection des cellules tumorales, en même temps que les molécules à tester. Ces injections seront réalisées en intra-péritonéale. Dans l’expérience de vaccination de la procédure 3, des cellules tumorales mortes seront injectées en sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Une semaine après la vaccination, des cellules tumorales vivantes seront injectées en sous-cutané (100 µL, 10 secondes) dans le flanc opposé et l’apparition d’une tumeur au deuxième point d’injection sera évaluée.

Impact sur les animaux

- Les molécules testées pourraient occasionner une réaction inflammatoire modérée au moment de l’injection. - Les souris sont immunodéficientes et donc plus sensibles aux infections - Le développement de grosses tumeurs pourrait gêner le mouvement de la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiées selon les pratiques recommandées pour les souris par l’union Européenne

Remplacement

L’objectif du projet est de vérifier si les molécules en développement peuvent exercer une activité anti-tumorale en agissant directement sur les cellules tumorales ou/et en stimulant la réponse immunitaire anti-tumorale. Ceci nécessite l’utilisation d’animaux pour analyser les tumeurs dans leur environnement. Toutes les procédures chez l’animal seront précédées d’une validation in vitro de l’efficacité des molécules. La procédure 1 sera précédée par une validation in vitro de la capacité des molécules à inhiber la signalisation intracellulaire pro-tumorale et la croissance des cellules tumorales. Seules les molécules montrant une activité anti-proliférative seront évaluées chez l’animal. Nous avons actuellement 2 molécules remplissant ces critères. Au maximum les 6 molécules seront analysées. La molécule la plus efficace sera ensuite utilisée dans la seconde et troisième série d’expériences (procédure 2 et 3). La procédure 3 sera précédée par une analyse in vitro de la capacité des molécules ou de la combinaison molécule-chimiothérapie à induire une mort immunogène. Seules les combinaisons efficaces seront testées in vivo.

Réduction

La première série d’expériences (5 souris / groupe) permettra de définir les concentrations efficaces et de choisir les molécules utilisées dans la seconde série d’expérience. Pour les 2 molécules les plus efficaces, nous répèterons l’expériences 2 fois de manière indépendante. La répétition permettra d’ajuster les concentrations si besoin. Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, la seconde et troisième séries d’expériences seront réalisées sur des groupes de 5 souris. Nous répèterons les expériences 2 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques.

Raffinement

Les injections sous-cutanées de cellules tumorales, intrapéritonéales ou intraveineuses des molécules ou agents thérapeutique seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés. Les souris auront une phase d’adaptation d’une semaine avant le début de l’expérimentation afin de les habituer à la manipulation et à la contention. Aucune douleur associée à ces gestes n’est attendue. Concernant les points limites adaptés les plus prédictifs, il s’agira des modifications de l’apparence physique, de la perte de poids, de l’apparition d’inflammation, du volume et de l’aspect des tumeurs, et des modifications du comportement L’arbre décisionnel ci-après sera suivi pour la prise en charge des animaux : 1. Si des changements de comportement ou d’apparence physique sont observées, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. 2. Si une légère inflammation au moment de l’injection des composés est observée, un anti-inflammatoire non stéroïdien pourra alors être administré de manière ponctuelle aux animaux. 3. Si des nécroses apparaissent sur les tumeurs, leur aspect et douleur seront évalués. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Dans tous les cas, si les animaux présentent une perte de poids ou une taille de tumeur définie comme point limite, ou si l’aspect des tumeurs le nécessite (nécroses douloureuses ou creuses) ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance telle qu’une inflammation persistante, les animaux seront euthanasiés selon les bonnes pratiques.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. Nous utiliserons des souris immunodéficientes nude (NMRI) pour la première série d’expérience permettant d’implanter des cellules exprimant cIAP1 ou un mutant invalidé de cIAP1. Lors de la seconde série d’expériences, nous utiliserons des souris immunocompétentes pour l’implantation de cellules cancéreuses d’origine murine et des souris immunodéficientes pour l’implantation des cellules cancéreuses humaines. Pour la troisième série d’expérience, des cellules cancéreuses coliques seront injectées à des souris immunocompétentes pour l’expérience de vaccination. Ensuite, l’analyse de la capacité des molécules ou des combinaisons de traitement à sensibiliser les tumeurs à une immunothérapie se fera sur des tumeurs faiblement immunogènes développées dans des souris immunocompétentes. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur pratique une implantation sous-cutanée puis une ouverture du crâne, avec des injections dont une en rétro-orbitaire et des séances de scanner, pour étudier la vascularisation dans la réparation d'os de la face. Il décrit des douleurs postopératoires modérées pendant 72 heures, avant la mise à mort pour l'imagerie et l'histologie. Il affirme utiliser des souris immunodéprimées porteuses de cellules humaines et qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" in vitro ou in silico.

Objectifs

L'os est un tissu dur vascularisé qui se renouvelle continuellement pour s'adapter aux exigences mécaniques et métaboliques du corps. Les maladies inflammatoires, infectieuses ou les traumatismes entraînent d'importants défauts osseux craniofaciaux, aux conséquences esthétiques et fonctionnelles. Des substituts osseux synthétiques ou biologiques ont été développés et sont actuellement utilisés pour traiter ces défauts avec des résultats encore inconstants et perfectibles. La vascularisation joue un rôle important dans la réparation osseuse. L’objectif de ce travail est d'arriver à caractériser et comprendre le rôle de la vascularisation puis d'en déterminer son rôle dans la réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux et mieux comprendre le comportement des vaisseaux implantés essentiel à toute survie d'un tissu greffé. Il s’attaque à un problème de santé majeur par le biais d’une stratégie d’ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble.

Procédures

Procédure 1 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée (5min), des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (2 acquisitions, 10min) Procédure 2 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale de craniotomie (10min) et des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (5 acquisitions, 25min)

Impact sur les animaux

A l'anesthésie, une dépression respiratoire peut très rarement être observées. Lors de la chirurgie, une complication hémorragique peut survenir. En post opératoires des douleurs modérées pendant 72h, hématomes, oedèmes et réouverture de la plaie par désunions des sutures peuvent être rarement observées. Concernant l'injection en rétro-orbitaire, un léger gonflement de l'oeil est rarement observé durant quelques minutes.

Devenir

Mise à mort pour permettre les analyses d'imagerie et d'histologie.

Remplacement

Ce projet s'intérêsse à la prévascularisation de greffon pour améliorer leur intégration in vivo et leur survie. Cela nécessite donc un modèle in vivo capable de supporter l’implantation de cellules humaines, comme la souris athymique nude. De plus, nous visons à transposer ce modèle de pré-vascularisation à la régéneration osseuse, qui présente une biologie complexe que l’on ne sait pas reproduire par ingénierie actuellement et dont la complexité ne peut être mimée in vitro ou in silico. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été limité grâce à une approche statistique de manière à déterminer la taille des groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par quatre par cage et disposeront d’un espace suffisamment complexe pour leur permettre d’exprimer leur comportement normal (enrichissement). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pendant 7 jours après la chirurgie puis 2 fois par semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un score de points limites de 3 dans une sous-catégorie ou si un indice total de 6 est atteint, l’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce de laboratoire appropriée, dont la biologie (vasculaire et osseuse) est proche de celle de l’homme. De nombreux outils d’analyses d’imagerie et d’histologie sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéprimées du fait de l’implantation de cellules humaines. Des souris de 8 semaines à 5 mois seront utilisées, les animaux étant alors de jeunes adultes et sont alors les plus à même de pouvoir procéder à une régénération tissulaire.

3 porcs vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont maintenus en contention dans un hamac et subissent jusqu'à quatorze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, pour mettre au point une technique de micro-échantillonnage de sang. Le porteur indique que la contention peut être source de stress et que les prélèvements peuvent provoquer douleur et hématomes. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à "l'animal entier" faute de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans le sang.

Objectifs

L'objectif de ce projet est la mise au point de méthodologie de micro échantillonnage de sang (maximum 200µL de sang prélevé) pour réduire l'invasivité des prélèvements sanguins lors d'études pharmacocinétiques à venir.

Bénéfices attendus

Les techniques de micro-échantillonnage permettent de réduire au minimum le volume de sang prélevé sur les animaux. Cela présente des avantages par rapport à la diminution du nombre d'animaux utilisé et l'amélioration des aspects liés au bien-être animal.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention pour réaliser les prélèvements sanguins. Contention manuelle via l'utilisation d'un hamac. La durée de la contention sera d'environ 1 minute. Il y aura 14 prélèvements de sang au maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement de sang est inférieure à la minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins uniquement. Les animaux seront contentionnés via un hamac. La contention via le hamac peut être génératrice de stress. Les prélèvements sanguins se feront au niveau des veines auriculaires, veines mammaires, veines caudale et veines saphènes. Les prélèvements peuvent engendrer de la douleur, des hématomes au niveau des sites de prélèvements. Si tel est le cas des analgésiques pourront être appliqués si nécessaire sur décision du vétérinaire responsable.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test chez le mini-porc. Les tests in vitro, ou les tests sur organe isolé ne peuvent pas traduire de la réponse d'un organisme entier. Il n'existe pas de modèle animal synthétique qui permette de mettre au point cette méthode.

Réduction

Trois animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal de replicats pour definir une bonne reproductibilité technique. Aucune approche statistique n'a été réalisé, mais les réplicats constituent d'importants contrôles de la qualité de la conduite des expériences et les test statistiques non paramétriques de type Mann-Whitney peuvent être utilisé dès n=3.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 3. De l'enrichissement (exemple: balle, jouet suspendus) seront présents autant que possible dans les boxes. Un suivi bi quotidien (voir plus) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Les animaux seront préalablement habitués à la contention dans un hamac et à la manipulation des zones d'intérêt. Un analgésique local ou du froid pourra être utilisé pour limiter la douleur de la piqûre de la zone d'intérêt. Les effets secondaires peuvent être de la douleur ou un hematome au site de prélèvement qui ne sera alors plus utilisé.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type de projet. Necessité de développer cette technique pour cette espèce. Jeune Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.

576 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit un emphysème par une injection d'élastase dans la trachée, via une incision au cou refermée par suture, et active un modèle génétique par des injections de tamoxifène. Les souris sont ensuite mises à mort pour prélever et étudier leurs poumons. Il reconnaît disposer de modèles d'organoïdes humains, mais affirme qu'ils ne peuvent "pas se substituer complètement" au modèle murin.

Objectifs

L’emphysème est une maladie pulmonaire impliquant une destruction irréversible des alvéoles, sans médicament disponible actuellement. Dans les poumons de patients ayant un emphysème, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Ces cellules peuvent sécréter différents facteurs bloquant la prolifération et la différenciation des cellules voisines. Nos données préliminaires montrent que l'absence de p16 répare l'emphysème chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules souches épithéliales des alvéoles, ou pneumocytes 2 sont à l'origine de ce processus de régénération alvéolaire lorsque p16 est absent. Ainsi, l’objectif du projet est d'étudier si l'absence du gène p16 spécifiquement dans les pneumocytes 2 pourrait mener à une réparation des alvéoles pulmonaires. Pour se faire, nous allons utiliser des souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. L’emphysème sera évalué par des analyses sur coupes de poumon. Pour tenter de comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation, nous étudierons la composition cellulaire des poumons de ces souris avec des analyses de l’expression génique de cellules individuelles. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous utiliserons le modèle de formation d'organoïdes (structure d’auto-assemblage de cellules épithéliales et mésenchymales en 3 dimensions).

Bénéfices attendus

Nous anticipons : i) de montrer que les cellules responsables de la régénération dans le poumon emphysémateux en l'absence de p16, sont les pneumocytes 2, ii) d'identifier une ou plusieurs sous-populations de cellules épithéliales issues de la différenciation des pneumocytes 2, ayant des capacités régénératives modulées par la délétion de p16. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée.

Procédures

Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Un modèle de souris génétiquement modifiée sera utilisé pour induire l’absence de p16 dans les pneumocytes 2. Ce phénotype n'est pas dommageable pour les animaux. Pour activer ce modèle génétique, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen par voie intrapéritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection (aiguille). Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. L'injection d’élastase se fait dans la trachée, à l’aide d’une aiguille. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une déletion de p16 dans les pneumocytes 2 permettra d’étudier directement si les cellules responsables de la régénération sont les pneumocytes 2, dans l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles d'organoïdes chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfontion des celules épithéliales chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variablilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 576, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 576 souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2 seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l’élastase vs 20 souris au PBS (contrôle), ii) la composition cellulaire des poumons de ces souris sera analysée à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 8 souris seront injectées à l’élastase vs 8 souris au PBS (contrôle) iii) le modèle d’organoides alvéolaires permettra d'étudier les propriétés des pneumocytes 2 à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l'elastase et 20 souris a PBS (contrôle). Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris injectés soit à l'élastase, soit au PBS, la moitié des souris seront injectées au Tamoxifen permettant d'avoir des souris contrôles (ayant une expression de p16 dans les pneumocytes 2) et des souris présentant une absence p16 dans les pneumocytes 2. Chaque expérience sera réalisée de manière préventive (Tamoxifen administré 3 jours avant l'injection) et de manière curative (Tamoxifen administré à partir de 21 jours, lorsque l'emphysème est déjà constitué).

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie. Il y aura une présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constitueront des critères d'arrêt et conduiront à la mise à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

320 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'adolescence, ils subissent un stress chronique imprévisible pendant 21 jours, cinq tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée et quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, pour modéliser des troubles psychotiques. Le porteur indique que ce stress ralentit la prise de poids, puis les rats sont mis à mort pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'une approche comportementale n'est possible qu'à l'échelle de "l'organisme entier" et que le rat offre une meilleure "performance translationnelle".

Objectifs

Les troubles psychotiques sont fréquents. Ils apparaissent généralement à l’adolescence, une période de grands changements, tant sur le plan physiologique, psychologique, que social. Ces troubles ont des conséquences majeures sur la vie personnelle, sociale, et professionnelle des patients et de leur entourage en font un véritable enjeu médical et socioéconomique. Malheureusement l’étiologie de la maladie reste mal connue car plurifactorielle. Son développement résulterait d’une interaction entre gènes et environnement, suggérant qu’il existe une vulnérabilité génétique précipitée par des facteurs environnementaux comme le stress psychosocial. Des adolescents ou jeunes adultes présentant des symptômes atténués ou très transitoires de psychose ont été identifiés comme des individus à ultra-haut risque de psychose. Deux tiers des sujets à ultra-haut risque ne développeront pas de trouble psychotique et les thérapies cognitivo-comportementales pourraient favoriser cette résilience au stress. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sensibilité ou la résilience au stress notamment pendant la période cruciale qu’est l’adolescence pourrait permettre de faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet, chez le Rat, vise à étudier les consequences comportementales pouvant s’apparenter aux les troubles psychotiques suite à stress chronique à l’adolescence afin d'identifier les mécanismes biologiques et moléculaires impliqués dans cette dernière et la résilience au stress et dans les effets bénéfiques de l’environnement enrichi (modèle de thérapies cognitivo-comportementales chez l’animal).

Bénéfices attendus

A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant la vulnérabilité au stress et l’effet des thérapies cognitivo-comportementales pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les stades précoces des troubles psychotiques.

Procédures

Les animaux pendant l'adolescence subiront sur une période de 21 jours un stress chronique un stress chronique imprédictible. Ils seront également évalués à 2 périodes de temps dans 5 comportementaux espacés de 24h au minimum et durant entre 5 minutes et 1h. Chez ses mêmes animaux 4 prélèvements sanguins seront effectués avec au minimum 3 semaines entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sur une période de 5 minutes sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le stress réalisé pendant l'adolescence va induire un ralentissement de la prise de poids. Les testscomportementaux utilisés peuvent engendrer un stress chez l'animal mais sont de courte durée. . Les prélèvements sanguins peuvent entrainner un stress et une douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau pour des analyses moléculaires

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est une nécessité pour cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes et une analyse de puissance statistique. De plus, certaines expériences présenteront un aspect longitudinal afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Les rats sont hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur sera soulagé avec des analgésiques. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur pour limiter le stress et la douleur associés à ce geste.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rongeur et plus particulièrement le Rat car il présente l’avantage, d’être proche physiologiquement de l’Homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure performance translationnelle. D'ailleurs, le Rat, contrairement aux souris, est plus réceptif aux interactions sociales et présente dans le temps des performances cognitives plus stables. De plus, des résultats préliminaires issus de notre laboratoire ont pu montrer que certains stress pendant l'adolescence pouvaient avoir des répercutions à long terme qui pouvaient varier d'un individu à l'autre, comme chez l'Homme. Les animaux issus de femelles gestantes commandées seront utilisés à partir de 28 jours de vie (adolescence) jusqu'à l'âge adulte.

1 200 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur met au point une greffe de cellules de cancer du pancréas directement dans le pancréas, par chirurgie abdominale ou par injection échoguidée, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins répétés. Les souris sont euthanasiées lorsque la tumeur approche 1 500 mm3 ou en fin d'étude, pour prélever sang, tumeur et organes. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reconstituer in vitro les interactions de la tumeur avec son microenvironnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe localisé à l’arrière de l’estomac. Il contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. Parmi les différents types de cancer du pancréas, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP), qui se développe dans le compartiment exocrine, représente 90-95% des cancers pancréatiques. L’ACP est un cancer très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (et seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les traitements classiques de l’ACP sont la chirurgie qui permet de retirer la partie tumorale tout en conservant la partie saine du pancréas, la chimiothérapie et l’irradiation, mais ces traitements ne permettent pas d’améliorer significativement les résultats cliniques. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pour déterminer leur efficacité anti-tumorale. Les modèles les plus couramment utilisés sont des modèles de greffes de cellules tumorales sous la peau des souris. Mais ils ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut constituer une barrière physique aux traitements. La greffe de cellules tumorales pancréatiques directement dans le pancréas, (greffe orthotopique pancréatique), permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée d’intérêt pour la recherche de nouveaux traitements. Ce projet vise à mettre au point des techniques de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique chez la souris via une méthode dite classique de chirurgie ainsi que par une méthode d’échoguidage non invasive – les deux techniques seront réalisées en différents sites du pancréas pour déterminer quelle approche permet de générer un modèle le plus ressemblant à la tumeur humaine. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée.

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre de l’ACP sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris immunocompétentes permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Bien que l’approche de la greffe orthotopique au niveau de la queue du pancréas soit la plus décrite, nous allons mettre au point l’injection orthotopique dans la tête du pancréas. En effet, ce site d’injection, bien que moins simple d’un point de vue de l’approche chirurgicale, est plus relevant scientifiquement vis-à-vis de la pathologie humaine. De plus, la greffe orthotopique dans le pancréas nécessite un acte de chirurgie dont nous allons essayer de nous affranchir par la mise en place d’une approche d’implantation per cutanée échoguidée. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la progression tumorale au cours des études permet de raffiner l’utilisation des animaux en les incluant progressivement dans l’étude. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Ce projet vise également à développer si possible ce modèle avec une méthode non chirurgicale moins invasive afin de favoriser le bien-être animal.

Procédures

- Puçage : afin d’identifier chaque animal, un dispositif sous cutané est implanté en vigile par trocart quelques jours avant l’étude (environ 10 secondes/souris) - Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Echoguidage sous anesthésie gazeuse pour l’implantation de cellules tumorales dans le pancréas : cette procédure sera réalisée une seule fois sur l’animal et durera 10-15minutes. - Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite de la chirurgie (7 à 10 jours), à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris et la mesure se fera sur une durée maximale de 8 semaines - « Microsampling » : prélèvements de sang, en cinétique, à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de marqueurs caractéristiques de la cachexie) (environ 20 secondes/souris) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction cardiaque.

Impact sur les animaux

-Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de de la mesure de la composition corporelle -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de l’administration des traitements en quotidien ou biquotidien ou triquotidien, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration) -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors des prélèvements sanguins par microsampling d’environ 20 secondes /souris -Douleur très légère lié à la piqûre lors des prélèvements sanguins par microsampling -Douleur légère due à la pathologie et possiblement associée à une perte de poids et/ou formation d’ascite et/ou cachexie -Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen

Devenir

Lorsque le volume tumoral total est proche de 1500 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, fournissant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

- Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la capacité des designs de ces études à l’aide d’un test statistique. Un modèle statistique longitudinal sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. - Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. - Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris mortes issues d’autres projets afin de maitriser les voies d’abords et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur afin de réduire le nombre d’animaux - Afin d’inclure toutes les souris greffées dans les études, nous utiliserons l’échographie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure avec un volume tumoral similaire ainsi le taux d’inclusion sera maximisé. - Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés maximum 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. - La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie - L’analgésie post-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. - Une seconde méthode de greffe orthotopique « non chirurgicale » par échoguidage percutané sera évaluée, ceci en vue de s’affranchir de douleurs opératoires et réduire les risques de pertes lors de la chirurgie. L’implantation cellulaire s’effectuera sous échographie par injection échoguidée en percutanée ne nécessitant pas de pré ou post médication. Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sur des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 1500 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. - La cachexie, signe clinique associé à la progression tumorale du cancer du pancréas, sera suivie via l’établissement d’une grille de scoring. La prise alimentaire, l’activité générale, la mesure de la composition corporelle par scanner non invasif EchoMRI (pourcentage de masse grasse, masse maigre et eau totale), de paramètres métaboliques (albumine, triglycérides) et hématologiques seront monitorés tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

20 chiens vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces chiens, déjà inclus dans des recherches sur la myopathie de Duchenne, subissent trois prélèvements sanguins lors d'épisodes de bronchopneumonie survenant au cours de leur vie, pour évaluer un marqueur sanguin, la procalcitonine. Le porteur décrit un stress modéré lié aux prises de sang et ne rapporte pas de mise à mort au titre de ce projet. Il affirme qu'il "n'est pas envisageable" d'étudier ce marqueur autrement que dans un "organisme entier" et que l'espèce canine s'impose puisque l'application vise le chien.

Objectifs

Chez le chien, le diagnostic d’une bronchopneumonie par fausse déglutition (BPFD) repose sur le contexte, les signes cliniques, des images radiographiques évocatrices et une augmentation marquée de la protéine C réactive (CRP), un marqueur d'inflammation, dans le sang. Néanmoins, les lésions radiographiques peuvent être discrètes et masquées par des lésions pulmonaires pré-existantes, notamment lors d’épisodes récidivants. De même, la CRP reste peu spécifique : la sévérité de son augmentation lors de BPFD est très variable selon les cas et les valeurs de CRP peuvent se chevaucher entre plusieurs affections respiratoires. Ces limites soulignent la nécessité d’évaluer d’autres biomarqueurs. Ces problématiques sont particulièrement vraies chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne et utilisés pour la recherche sur cette maladie, qui conduit à des difficultés de déglutition, prédispose à des épisodes récurrents de BPFD et où la chronicité des signes conduit le plus souvent à des augmentations plus modérées de la CRP. Par ailleurs, l’état inflammatoire inhérent à la myopathie peut être à l’origine d’une augmentation de la CRP sans lien avec une bronchopneumonie. La procalcitonine est un marqueur utilisé chez l’Homme et qui semble plus spécifique des infections bactériennes. Récemment, sa mesure par un kit ELISA a été validée chez le chien L’objectif de ce projet est de déterminer si la procalcitonine pourrait constituer un marqueur de BPFD qui répondrait aux problématiques soulevées par l’état actuel de l’arsenal diagnostique chez le chien. Ce projet exploitera les épisodes de BPFD survenant spontanément chez les chiens myopathes au cours de leur vie, sans interférence avec les projets dans lesquels ils seront inclus ni changement dans la gestion médicale habituelle de ces épisodes. A terme, si ce nouveau biomarqueur s'avère pertinent, il pourra constituer un outil pour mieux gérer ces affections non seulement chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne, mais aussi chez tous les chiens de compagnie qui présentent des BPFD.

Bénéfices attendus

Nous éméttons l’hypothèse que la procalcitonine sera un meilleur marqueur de BPFD que la CRP et donc que son augmentation sera plus marquée que celle de la CRP lors du diagnostic. Le bénéfice serait la validation d’un biomarqueur plus spécifique d’une infection bactérienne aiguë et/ou plus sensible dans les cas de bronchite bactérienne (sans pneumonie) afin de mieux diagnostiquer les BPFD, de mieux cibler les patients nécessitant une antibiothérapie, de mieux adapter la durée de l’antibiothérapie et ainsi de limiter l’antibiorésistance.

Procédures

Trois prélèvements sanguins de 3 mL sur chiens vigiles. Durée estimée : 1 minute pour le prélèvement, 5 minutes de manipulation incluant le temps de rassurer le chien, de prélever, d'effectuer un point de compression et de récompenser le chien.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables et nuisances sont modérés et essentiellement liés au stress lié à la réalisation de 3 prises de sang durant le suivi d’étude.

Devenir

Ce projet sera mené sur des animaux déjà inclus en procédures expérimentales et qui présenteraient des complications médicales de BPFD. Les BPFD, si elles n'induisent pas de difficulté respiratoire significative sur les chiens ne constituent pas en elles-mêmes un point limite et la procédure expérimentale initiale pourra donc être poursuivie normalement.

Remplacement

Cette étude visant à déterminer l'intérêt du dosage d'un biomarqueur d'inflammation systémique, il n'est pas envisageable de la réaliser autrement que dans un organisme entier. Par ailleurs, l'application de cette étude étant le diagnostic des bronchopneumonies par fausse déglutition chez le chien, il apparaît nécessaire de réaliser cette étude dans cette espèce. Enfin, les chiens atteints de myopathie de Duchenne développant spontanément ce type d'affection respiratoire et bénéficiant d'un suivi très rapproché dans des conditions standardisées, ils présentent un intérêt évident pour valider ou non ce biomarqueur qui pourra ensuite être appliqué aux chiens de compagnie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études antérieures sur ce biomarqueur ayant montré des résultats significatifs avec un tel effectif.

Raffinement

Une attention sera portée à la minimisation du stress lié à la procédure de prélèvement. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. A la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses. Habituellement les chiens GRMD présentent assez peu de signes d'inconfort respiratoire durant un épisode de bronchopneumonie, mais si tel éait le cas et que le prélèvement n'était pas indispensable au suivi clinique de l'animal, celui-ci ne serait pas effectué. Sur le plan de l'hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.

Choix des espèces

Ce projet ayant pour objectif de valider un biomarqueur chez le chien, il sera mené dans l'espèce canine. Les chiens GRMD recrutés pourront l'être à tout moment de leur vie. Les BPFD peuvent survenir à partir de l'âge de 4-5 mois (à ce stade les chiens GRMD pèsent entre 10 et 15 kg).

180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dix-sept interventions, dont trois injections d'une protéine avec adjuvant, sept anesthésies gazeuses, quatre prélèvements de sang et trois inhalations, pour tester un traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les souris sont ensuite mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'un "modèle murin est nécessaire" et que les cultures in vitro ou les organoïdes ne reconstituent pas tous les acteurs du système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Notre laboratoire a identifié la protéine (PAD4) responsable de la production des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde. Un nouveau traitement pour bloquer la réponse immunitaire contre la protéine PAD4 sera utile pour traiter la polyarthrite.

Bénéfices attendus

Développer un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Cette maladie bénéficie de traitements qui traitent les conséquences de la maladie (l'inflammation) mais pas la cause principale qui est la production d'autoanticorps.

Procédures

17 interventions : 3 injections de la protéine ou de la solution saline pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute

Impact sur les animaux

3 injections de la protéine ou de la solution saline avec l’adjuvant complet et incomplet pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute.

Devenir

Les 180 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.

Remplacement

L’objectif de cette demande est de tester l’effet d’un traitement qui pourra être utilisé chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde pour bloquer la production des autoanticorps. Chez les patients, il est difficile d’analyser les autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Un modèle murin est nécessaire car il permet d’induire les autoanticorps afin de comprendre comment ils sont produits et de développer des traitements pour bloquer leur production. D’autres alternatives à l’expérimentation animale comme la culture de cellules in vitro ou des organoides ne permettent pas de reconstituer tous les acteurs du système immunitaire pour analyser les mécanismes de production des autoanticorps et tester les effets d’un traitement.

Réduction

Nous allons suivre pendant 50 jours l’effet de la protéine PAD4 sur des souris de deux fonds génétiques différents. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Le nombre total de souris sera 180.

Raffinement

Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera réalisée pour chaque inhalation (3 par souris) et chaque prélèvement de sang dans la veine mandibulaire (4 prélèvements par souris) pour analyser leur sérologie. Les souris seront mises à mort pour analyser leur réponse lymphocytaire. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens deux fois par semaine. Les effets des procédures seront suivis selon une grille d’évaluation de la souffrance qui combine l’apparence générale, le comportement, la locomotion et les signes neurologiques des souris. Si une souffrance est observée, elle sera chiffrée par une grille de score. L’injection d’analgésiques sera faite si besoin. Chaque cage contenant au maximum 4 souris sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole.

Choix des espèces

Nous allons choisir les souris en fonction des facteurs de risque connus chez les patients atteints de la polyarthrite. Nous voulons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite touche l’homme ou la femme adulte, des femelles car la production d’autoanticorps est meilleure que chez les males, des souris qui ont certains gènes à risque de développer une arthrite. Nous allons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite rhumatoïde touche l’homme ou la femme adulte. Nous allons utiliser des souris agées de 6 semaines.