Procédures modérées

32 cailles japonaises vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis confiées à une association pour placement en refuge ou famille d'accueil. Chaque oiseau est filmé quinze minutes par jour pendant cinq jours et subit deux prélèvements de sang, pour valider des mouvements de plumes de la tête comme marqueurs d'émotions positives. Le porteur indique que le transport, l'isolement et les prises de sang sont des sources de stress, et que les mâles adultes sont maintenus en cage individuelle faute de pouvoir cohabiter. Il présente ces marqueurs comme une piste pour évaluer, à terme, le bien-être des oiseaux d'élevage.

Objectifs

L’existence d’états émotionnels chez l’animal est de plus en plus acceptée dans le monde scientifique. L’idée que ces états subjectifs sont au centre du bien-être animal s’est peu à peu imposée au cours des dernières décennies. Les premières études, poussées en partie par l’intérêt grandissant du public pour le bien-être des animaux en captivité, se sont concentrées sur les émotions négatives, telles que la peur et la souffrance. Cependant, avec l’accumulation des connaissances sur le sujet, l’importance des émotions positives est devenue prépondérante. En effet, le bien-être n’est pas seulement l’absence d’états négatifs, mais aussi la possibilité pour l’animal de vivre des émotions positives. Par ailleurs, comprendre les contextes et les modalités d’expression des émotions positives a à la fois un intérêt appliqué et fondamental, car leur étude pourrait nous en apprendre davantage sur nos propres émotions en termes d’évolution, de fonction, etc. L’étude de ces états positifs est essentielle à notre compréhension de l’animal. Cela est particulièrement vrai chez les oiseaux, qui ont été considérablement moins étudiés à ce sujet que les mammifères. Notre objectif est d’étudier l’expression des émotions positives chez une espèce d’oiseau nidifuge, la caille japonaise (Coturnix c. japonica). Des travaux précédents ont mis en évidence l’existence d’un potentiel marqueur morphologique des émotions positives chez la caille. En anticipation d’une récompense, nous avons observé des mouvements de plumes sur des zones localisées de la tête de l’oiseau, ce qui pourrait être une forme d’expression faciale positive chez l’oiseau. L’objectif de cette étude est de valider ces expressions faciales comme marqueurs des émotions positives, en analysant leur expression dans différents contextes positifs et les corrélant avec des marqueurs physiologiques connus dans la littérature.

Bénéfices attendus

Nous espérons pouvoir identifier des marqueurs d’émotions positives chez la caille. Ces marqueurs sont encore peu nombreux car peu explorés chez l’oiseau. Ils permettraient d’en apprendre davantage sur leurs capacités émotionnelles. Ces marqueurs seront réutilisés pour évaluer les effets de divers facteurs, tels que l’histoire de vie ou la complexité environnementale. Enfin, de tels marqueurs pourraient trouver des applications dans l’amélioration du bien-être des oiseaux d’élevage. Nous espérons également mettre au point une méthode de mesure hormonale non invasive.

Procédures

Toutes les cailles seront testées individuellement dans un dispositif dont le sol est couvert de copeaux de bois, afin d’observer l’expression des comportements de bains de poussière. Chaque test durera 15 minutes par jour et sera filmé pour être finement analysé. Un test sera fait par jour, l’expérience se poursuivra sur cinq jours. Ensuite, deux prélèvements sanguins seront réalisés sur deux jours pour évaluer certains taux hormonaux. Des prélèvements de fèces seront également réalisés pour comparer les taux hormonaux présents dans les fèces et dans le plasma.

Impact sur les animaux

Le transport et l’isolement pendant les phases de test peuvent perturber les cailles. Cependant, les cailles sont habituées à la manipulation et la durée d’expérimentation ne va pas excéder 15 minutes par jour, ce qui permet une longue période de repos pour l’animal en dehors des tests. Les prélèvements sanguins sont également une source de stress. Les prélèvements seront réalisés par un personnel expérimenté, ce qui limitera la douleur et le temps de contention nécessaire. De plus, le prélèvement sera arrêté dès que l’animal se mettra à bouger.

Devenir

Le projet n’implique aucune atteinte à l’intégrité physique et comportementale des animaux. Ceux-ci pourront donc être confiés à une association de réhabilitation des animaux de laboratoire pour placement en refuge ou en famille d’accueil.

Remplacement

Nous étudions des signes physiologiques et morphologiques d'émotions positives chez des animaux vivants, ce qui exclut tout type de remplacement.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi (16 mâles et 16 femelles) permet d’avoir un effectif suffisant pour les analyses physiologiques et comportementales tout en tenant compte d’un possible effet sexe dans l’expression des émotions. Il permettra ainsi d’assurer une puissance statistique suffisante pour la réalisation d’analyses statistiques non paramétriques.

Raffinement

Chez la caille japonaise, les mâles adultes ne peuvent pas être maintenus en groupe car ils expriment des comportements agressifs. Ceci impose donc de maintenir également les femelles en cage individuelle. Lors de la phase expérimentale, les oiseaux seront déplacés et manipulés par des personnes compétentes et expérimentées. Les phases de tests seront limitées à environ 15 minutes par jour et par animal pour limiter les contraintes pour l’animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un personnel expérimenté et seront stoppés si l’animal commence à bouger, afin d’éviter toute blessure. Les oiseaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté. La détection de tout changement de comportement ou de blessure induira un isolement de l'individu pour l’administration de traitements.

Choix des espèces

Les cailles japonaises sont domestiquées depuis des siècles. En raison de leur petite taille et de leur développement rapide, elles sont rapidement devenues populaires tant dans l'industrie agricole que pour la recherche scientifique. Leurs caractéristiques comportementales peuvent être clairement identifiées par des tests validés scientifiquement. Leurs capacités émotionnelles sont néanmoins encore trop peu étudiées. Les cailles seront âgées d'un an. Elles seront donc compètement matures et développées sexuellement. A cet âge le profil comportemental est stable et nous pourrons donc observer des différences interindividuelles robustes, ainsi que de potentielles différences liées au sexe.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections sous-cutanées deux fois par semaine pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire et des tests de force et de respiration, pour évaluer une protéine médicament combinée à une thérapie génique. Le porteur décrit des gestes réalisés sur des rats habitués et une perte de poids limitée, et prévoit une sédation systématique pour l'injection intraveineuse. Il qualifie d'"indispensable" le recours à ce modèle de rat, présenté comme plus fidèle à la maladie humaine que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l'absence d'une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardio-respiratoire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique visant à la restauration de dystrophine sont prometteuses et en cours d’évaluation. Nous posons l'hypothèse qu’une thérapie préalable induisant un maintien de l’intégrité et de la croissance musculaire amplifierait le bénéfice de ces thérapies géniques, limitées lorsque les fibres musculaires dégénèrent et laissent place à du tissu conjonctif et graisseux, tous deux non contractiles. La protéine médicament testée dans ce projet est un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Cette étude a pour objectif d’évaluer le bénéfice de la combinaison protéine médicament / thérapie génique dans un modèle de rat DMD. En cas de validation chez le rat d'un effet synergique des deux approches combinées, la pertinence d’un essai clinique chez les enfants atteints de DMD, encouragée par des résultats précliniques robustes, serait augmentée et le processus sans doute accéléré.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés à base de protéine médicament et de thérapie génique pour optimiser la restauration de la fonction perdue dans les muscles dystrophiques. La protéine médicament joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire par une potentialisation du processus de nécrose-régénération des fibres musculaires. Nous attendons donc à court terme une synergie protéine médicament/thérapie génique qui optimisera l'efficacité chez le rat DMD de la première génération de médicaments de thérapie génique. À plus long terme et en cas de succès, nous soutiendrons le développement clinique de cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique (seconde génération de médicaments).

Procédures

Procédure 1 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous-cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. En fin de procédure, un unique test d’agrippement et une quantification non-invasive du patron ventilatoire seront réalisés (durée totale de 45 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). Procédure 2 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous- cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. Au cours de la procédure, trois séries d'évaluation non-invasive sur animal vigile seront réalisées à 4 semaines d'intervalle : évaluation de la force d’agrippement, du patron ventilatoire et du rythme cardiaque par ECG (durée totale d’une heure). Une semaine avant la fin de la procédure, ils seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et soumis à une échocardiographie (20 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). À l'issue du prélèvement, les animaux toujours anesthésiés sont évalués pour la force musculaire de leur muscle tibial antérieur (30 minutes).

Impact sur les animaux

A 5 mois, les conséquences de la maladie impactent très peu la qualité de vie des animaux. Afin de privilégier une méthode la moins invasive possible pour les animaux, nous avons optimisé notre produit et réussi à obtenir des données fiables de pharmacocinétique et d'efficacité en l'administrant par voie sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. Le geste réalisé sur des rats habitués est réalisé sans contention ferme, au cours d'un moment d'interaction positive. Les injections répétées en sous-cutané sur un même site d’injection pouvant entrainer l’apparition de granulomes (jamais observés sur nos précédentes cohortes), nous alternerons néanmoins les sites d’injection. L’unique injection intraveineuse sera effectuée dans la veine de la queue chez les rats âgés de 12 semaines (4 semaines au démarrage plus 8 semaines de prétraitement). Pour prévenir une réponse de stress éventuelle des rats en raison de la nécessité de réaliser cette injection sur des rats maintenus quelques minutes dans un tunel de contention, ils seront de façon systématique préalablement sédatés. Si besoin, les plus agités (anxieux) seront en plus légèrement anesthésiés pendant 5 minutes. Tous ces traitements sont parfaitement tolérés par les animaux et maîtrisés. Nous avons montré qu'ils évitent les conséquences perverses d'une réponse de stress exagérée, en particulier les arythmies cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et améliorent la croissance et la survie des fibres musculaires. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Nous avons préalablement contrôlé que les protéines médicaments étaient bien actives dans des cellules musculaires, et avons réalisé les premières expériences chez la souris modèle (peu sévère) de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui tester l’efficacité de ce traitement combiné dans un modèle dystrophique plus sévère et plus proche de la physiopathologie humaine, le modèle du rat DMD. L’utilisation de ce modèle nous parait indispensable pour évaluer le bénéfice du traitement sur des processus tels que le maintien précoce de la masse musculaire mais aussi la régénération du muscle déjà atteint.

Réduction

Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur le modèle de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons de plus optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Nous utilisons 8 rats par groupe, ce qui permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

1 360 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est vacciné puis, 28 jours plus tard, reçoit en six points une injection intradermique de toxine diphtérique pour contrôler l'activité du vaccin, ce qui provoque des érythèmes et un inconfort dans les 48 heures. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré, faute de données sur son interaction avec l'essai. Il affirme que l'évaluation de l'activité du vaccin exige un "organisme entier" et qu'aucune méthode in vitro n'est disponible.

Objectifs

L'objectif du projet est de vérifier la conformité des vaccins contenant la valence diphtérie vis à vis de leur activité antidiphtérique avant leur libération sur le marché.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats d'activité des vaccins pour la valence antidiphtérique est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.

Procédures

6 jours après l'arrivée, chaque lot de cobayes est vacciné par voie sous-cutanée au niveau de l'aine avec une dose de vaccin comprenant la valence antidiphtérique. Cette vaccination dure moins de 30 s par animal. 28 jours après la vaccination, les animaux sont challengés avec différentes doses de toxine diphtérique pour vérifier la protection du vaccin. Pour cela chaque cobaye reçoit en 6 points 6 doses différentes de toxine. L'administration se fait par voie intradermique en 3 points sur chaque flanc préalablement rasé. Les injections de toxine durent environ 2 min par cobaye.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie sous-cutanée n’entraine pas de nuisances visibles ni au niveau du comportement ni de l’aspect des animaux. L'administration de la toxine par voie intradermique 28 jours après n'entraine pas non plus de nuisances visibles au moment de l'injection. On peut néanmoins s'attendre à un léger stress lié à la contention et une douleur modérée pour ces injections. Dans les 48h suivant cette épreuve, les cobayes développent des réactions aux points d'injection sous forme d'érythèmes plus ou moins étendus qui peuvent créer un inconfort.

Devenir

A la fin d'un essai tous les animaux sont euthanasiés car ils ne peuvent être réutilisés en essai.

Remplacement

La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer l'activité des vaccins diphtériques.

Réduction

Plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - contrôle en méthode monodose lorsque la méthode a pu être validée, -optimisation des essais : le test de plusieurs lots de vaccins en même temps versus une même référence est privilégié lorsque la programmation des essais le permet -limitation des retests au maximum - mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots pour certains vaccins dont la stabilité de la production a été prouvée.

Raffinement

L'enrichissement mis à disposition des animaux est le suivant: - Mise à disposition permanente de foin compressé - Utilisation de tubes en PVC servant de cachette en semaine, remplacés par des balles les week-ends. En cas d'observation d'anomalies du bien-être, les animaux sont isolés et bénéficient d'une surveillance renforcée. Si l'anomalie engendre une souffrance trop importante, les animaux sont immédiatement euthanasiés. Les médications antalgiques ne peuvent pas être administrées en l'absence de connaissances sur leurs interactions avec l'essai.

Choix des espèces

Le cobaye est le modèle le plus sensible utilisé pour les essais basés sur les réactions dermiques inflammatoires c’est pourquoi il a été retenu par la Pharmacopée Européenne. Les cobayes pèsent entre 250 et 300 g à leur arrivée ce qui correspond à un âge de 4-5 semaines.

52 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux à quatre interventions chirurgicales sous anesthésie, la dernière sans réveil, avec des effets attendus comme douleur, perte de poids et troubles neurologiques. L'objet est d'optimiser la greffe de cellules endocriniennes encapsulées pour le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Le porteur présente le porc comme un modèle proche de l'homme, après des essais déjà menés sur des rongeurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. De manière générale, il s’agit d’optimiser les techniques de transplantation de cellules endocriniennes, ici îlots de Langerhans pour le traitement du diabète de type 1, et cellules parathyroïdiennes pour le traitement de l’hypoparathyroïdie. Cette optimisation se fera en étudiant les performances apportées par l’encapsulation des cellules et par le choix de sites alternatifs. De manière plus précise : - Développement d’un dispositif d’encapsulation de cellules endocriniennes pour la greffe : choix du biomatériau selon sa biocompatibilité et choix de son meilleur site d’implantation - Evaluation de l’apport bénéfique apporté par l’encapsulation sur la greffe d’îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes, en matière de survie et de fonction du greffon, dans un cadre d’autogreffe. - Evaluation l’intérêt de site alternatifs accessibles par voie endoscopique mini-invasive tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale (sans encapsulation au sein de dispositifs).

Bénéfices attendus

A court et moyen terme, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, les résultats de cette étude permettront : - de pouvoir transplanter des îlots de Langerhans chez des patients diabétiques au sein de sites alternatifs moins invasifs que celui actuel (intrahépatique via un accès par la veine porte, nécessitant une laparotomie) - de développer une thérapie innovante, efficace et durable de l'hypoparathyroïdie - de limiter la perte de fonction du greffon au cours du temps - de diminuer les traitements immunosuppresseurs, très contraignants et à haut risque d'effets secondaires chez les patients

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront répartis en 4 différents groupes. La nature et le nombre d’interventions auxquelles les animaux seront soumis dépendra des groupes formés. Les animaux du groupe 1 seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la deuxième sera sans réveil. Ces interventions dureront au maximum 2 heures. Les animaux du groupe 2 seront soumis à 3 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Les animaux de la procédure 3 seront soumis à 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire). Enfin, les animaux de la procédure 4 seront soumis à 6 procédures chirurgicales effectuées sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Deux de ces interventions n’impliqueront pas d’incision chirurgicale. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, troubles neurologiques et métaboliques, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (jusqu'à 3 mois) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier estomac et rectum, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux dispositifs d'encapsulation améliorant la survie et la fonctionnalité d'îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes greffés au sein d'un organisme, dans une optique thérapeutique contre le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Au sein de ce projet, nous souhaitons évaluer la tolérance de ces dispositifs par l'organisme, la survie des cellules greffées et leur fonctionnalité in vivo, ainsi que le potentiel intérêt de sites alternatifs pour la greffe tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale. Il s'agit donc d'une approche d'ordre physiologique et intégrée à un organisme, d'où la nécessité d'utiliser des animaux pour ce projet. Nous ne pouvons donc pas remplacer l'utilisation d'animaux car nous souhaitons évaluer le comportement du greffon in vivo.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. - Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : anesthésie gazeuse et opioïdes et/ou anti-inflammatoires -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Le modèle pré-clinique porcin est un modèle à haute valeur translationnelle : sa proximité avec l'Homme est très grande, d'un point de vue métabolique, physiologique, ou encore anatomique. Par ailleurs, il permet une bonne transposition des techniques chirurgicales et présente un métabolisme glucidique semblable. La tolérance du dispositif et son effet sur la survie et la fonctionnalité des cellules greffées ayant déjà été étudié sur modèle rongeur, l'objectif serait de reproduire ces études mais sur un modèle à plus grande valeur translationnelle, afin de pouvoir transposer cette innovation thérapeutique directement sur l'Homme. Des miniporcs seront alors utilisés : ils présentent une taille et un poids adulte raisonnables permettant une stabulation moins compliquée que des porcs charcutiers (300 kg à l'âge adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme quelque peu différent des individus adultes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (d'au moins 1 an). Leur taille et leur poids permettra de faciliter les techniques chirurgicales et les prélèvements sanguins. Par ailleurs, leur métabolisme glucidique sera d'autant plus proche des patients adultes, cible de cette innovation thérapeutique.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par des bactéries après mise en narcose, puis tuées 72 heures plus tard pour un prélèvement sanguin et tissulaire terminal. L'objet est d'étudier la réponse immunitaire à des bactéries responsables de sepsis et de tester une molécule candidate. Le porteur qualifie la souris de modèle "incontournable" et affirme que le recours à l'animal est "inéluctable".

Objectifs

Les infections chez les patients atteints de mucoviscidose ou de la maladie granulomatose chronique (CGD :Chronic Granulomatous Disease) et âgés sont en recrudescence en raison de l'acquisition par les bacteries de mecanismes de resistance aux antibiotiques. C’est particulièrement vrai pour les bactéries P. aeruginosa, B. cenocepacia, C. violaceum ou S. Typhimurium responsables de sepsis. Afin de comprendre et d'étudier les aspects par lesquels ces pathogènes altèrent la réponse immunitaire et la physiologie de l'hôte, nous souhaitons utiliser un modèle d'infection chez des souris sauvages et génétiquement invalidées pour des gènes de la réponse antibactérienne. L'ensemble de ces gènes est commun a l'Homme et la souris. L'utilisation de modèles génétiquement invalides pour des effecteurs de la réponse immune nous permet d'isoler les cibles essentielles quant à l'élimination des bactéries pathogènes par l'organisme mais également de pouvoir, à terme, moduler la réponse antibactérienne de manière appropriée. Compte tenu de la susceptibilité aux infections microbiennes des patients, nous avons identifié́ une molécule qui permet de limiter in vitro les effets inflammatoires induits par les pathogènes. Ce projet vise à la fois à étudier et approfondir les connaissances quant à la dérégulation de la réponse immune mais également évaluer le potentiel anti-inflammatoire et antibactérien d’une molécule prometteuse.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous distinguons deux types de bénéfices : - Scientifique : les connaissances générées seront utiles quant à la compréhension de notre immunité au regard des bactéries étudiées - Santé : Notre molécule pharmacologique d’intérêt pourra démontrer son efficacité quant à la réduction de l’inflammation pathologique induite par ces bactéries dans nos modèles infectieux.

Procédures

Durant cette étude, les animaux seront prétraités à la molécule d’intérêt ou avec l’excipient seul (dose unique pour laquelle l’administration nécessite une dizaine de secondes de manipulation). 3 heures post traitement, après avoir provoqué un état de narcose, les animaux seront infectés. La dose infectante sera administrée en 1 fois. La durée de l’opération est de l’ordre de 30 s. Après infection, les individus seront transférés dans leur cage et le réveil sera vérifié. 72h post infection, tous les animaux seront anesthésiés par injection afin de procéder au prélèvement sanguin terminal et tissulaire.

Impact sur les animaux

Du stress pourra être engendré lors de la préhension et la contention des animaux afin de procéder aux administrations (10 à 30s). Concernant la fréquence des nuisances, il y aura une nuisance modérée due à l’injection unique de bactéries d’une durée de 10 à 30 secondes et une nuisance due à l’injection du traitement d’une durée de 30 secondes. L’infection en tant que telle peut produire une nuisance chronique légère en lien avec la réaction inflammatoire générée durant 3 jours (temps maximal de suivi du protocole).

Devenir

Tous les animaux seront, après anesthésie, mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sanguins et de tissus.

Remplacement

Dans ce projet, nous étudions l'activité anti-inflammatoire et anti bactérienne d’une molécule d’intérêt dans un système complexe. Les études in vitro ont déjà été réalisées sur des cellules de patients et ont montré une activité antibactérienne et anti inflammatoire prometteuse. Il n'existe, aujourd’hui, aucun modèle alternatif et le recours à l’utilisation de l’animal est inéluctable afin d’étudier l’impact des infections au niveau tissulaire et organique.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 1680 souris sera utilisé. Nous utiliserons des cohortes d'individus réduites à la taille minimum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos tests statistiques à l’aide de modèles murins déjà validés par plusieurs publications au sein de notre équipe, à savoir 10 individus par groupe (7 pour les analyses anti inflammatoires/antibactérienne et 3 pour les analyses histologiques). L’étude sera réalisée en tripliquât afin de reproduire et confirmer les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans une structure zootechnique adaptée et répondant aux normes règlementaires en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Ils sont hébergés selon les normes réglementaires et éthiques en vigueur et bénéficient d'un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur état général (posture, pelage) seront effectuées tout au long de l'expérience par des membres du personnel formés de l'équipe zootechnique et par le personnel de l’équipe scientifique, Nous disposons d’une structure en charge du bien-être animal avec un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress et/ou la douleur des animaux.

Choix des espèces

La mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire est extrêmement développé chez la souris adulte car le modèle murin (de par son utilité, sa versatilité, la présence de modèles génétiques proches de l'humain et les équipements scientifiques disponibles) demeure alors incontournable. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique un grand nombre des observations faites chez l’humain. De plus, de par la présence de nombreux outils génétiques développés chez la souris, la diversité des modèles utilisés ne peut être obtenue que dans l’espèce murine. Cependant les modèles cellulaires sont couramment utilisés au sein de notre laboratoire et constituent un préalable avant la mise en place de modèles animaux. Néanmoins, ces modèles cellulaires sont limités quant à l'information obtenue sur la complexité et l'intégration de la réponse immune dans son ensemble.

4 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections intramusculaires d'un candidat vaccin, cinq prélèvements sanguins à l'oreille, puis une ponction intracardiaque de 30 mL de sang sous anesthésie qui sert de mise à mort. L'objet est de produire des anticorps contre la bactérie Klebsiella pneumoniae résistante aux antibiotiques. Le porteur affirme qu'il n'est "pas encore possible" de se passer de l'animal pour produire des anticorps polyclonaux et justifie la mise à mort par le volume de sang à récupérer.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale. Ce projet en particulier, vient compléter les différents groupes déjà testés en étudiant cette fois l’administration des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées, sans modification génétique associées à l’adjuvant (ces cellules sont appelées « cellules porteuses »). Ajouter ce groupe à l’étude a pour but de déterminer si les cellules porteuses sont capables d’entrainer une production d’anticorps spécifique ou non et d’évaluer l’importance de la réponse immunitaire associée à leur administration (via la quantité d’anticorps retrouvé en fin d’expérience).

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer si les cellules porteuses ont un rôle dans l’efficacités du vaccin (activation de l’immunité, production d’anticorps). Les informations récoltées permettront d’en apprendre d’avantage sur le fonctionnement du vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 3 injections de cellules porteuses + adjuvant (200µL) par voie intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - 3 injections intramusculaires à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) - Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. Nous n’attendons donc aucune toxicité lors de l’administration des cellules porteuses. - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire directement suivi d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 4 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seul 1 groupe de 4 lapins sera administré par les cellules porteuses + adjuvant (protocole de 3 immunisations) afin de compléter des données précédemment obtenus (pas de groupe control). Comme ce projet ne comporte qu’un groupe, aucun test statistique de comparaison ne sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations des cellules porteuses et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration des cellules porteuses n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.