Procédures modérées

1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour implanter des électrodes de stimulation et des fibres optiques et injecter des virus dans le cerveau, avant deux mois de tâches de prise de décision et un enregistrement neuronal terminal sous anesthésie. Le porteur signale des douleurs possibles liées aux craniotomies, des infections des sutures et des bagarres entre souris pouvant les blesser. Il justifie le recours à la souris par le fait que l'étude ne serait "réalisable que sur des animaux", et rattache les retombées, de futures pistes de traitement de l'addiction à la nicotine, au long terme.

Objectifs

L’exposition à la nicotine pendant le développement peut augmenter la vulnérabilité à l’addiction, vu que plus de 90 % des fumeurs adultes ont commencé à fumer pendant leur adolescence. Cependant, la manière dont la nicotine produit cette vulnérabilité reste peu connue, limitant ainsi notamment nos pistes d’intervention et de traitements visant à réduire l’usage de la nicotine. L'adolescence est une période où le cerveau est supposé subir une poussée de plasticité qui sous-tend en particulier l'émergence des aspects cognitifs, émotionnels et motivationnels des comportements chez l’adulte, qui sont tous liés à l'activité des neurones dopaminergiques (DA) de l’aire tegmentale ventrale (ATV). L'apprentissage par renforcement et la flexibilité comportementale sont des domaines comportementaux-clés, qui ont été largement associés aux changements d'activité des neurones DA. La flexibilité comportementale fait référence à la capacité d'abandonner des activités précédemment gratifiantes pour explorer de nouvelles stratégies lorsque les conditions environnementales changent. L'exploration est un processus adaptatif important qui permet de découvrir des alternatives plus avantageuses. En particulier, l'exploration peut être orientée vers des options incertaines, puisque la réduction de l'incertitude a une valeur informative. La flexibilité comportementale est donc un comportement-clé dans le cadre de la vulnérabilité à l’addiction, qui peut être changée par l’exposition à la nicotine pendant l'adolescence. D’un point de vue fondamental, ces travaux visent donc à améliorer notre compréhension des effets de la nicotine sur le développement du système dopaminergique pendant l’adolescence, et les effets à long terme d’une exposition à la nicotine pendant cette période sur la prise de décision chez les adultes. De manière importante, si l’exposition à la nicotine pendant l’adolescence produit des changements dans la prise de décision quand ces souris atteignent l’âge adulte, nos résultats nous permettront aussi d’envisager de développer des interventions visant à réduire la vulnérabilité à l’addiction à la nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière les voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle face aux substances addictives et de comprendre comment celles-ci sont impactées par l’usage de nicotine pendant l’adolescence. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité, et elles sont liées à la prise de la nicotine pendant l’adolescence, qui – bien qu’étant un enjeu de santé majeur en France- se généralise avec l’introduction des « e-cigarettes ». Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique permettra d'appréhender efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à cet enjeu sociétal majeur.

Procédures

Une biopsie d’oreille et/ou de queue va être réalisée sur les souris transgéniques. Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'implantater d'électrodes de stimulation electriques, mais aussi d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Tous les chirurgies durent environ 1h chacune. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3-4 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 2-3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 mois environ, et à la fin les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques pourront connaître un inconfort transitoire lors du prélèvement rapide des biopsies. Les souris qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Des infections au niveau des sutures peuvent également survenir. Des bagarres entre souris blessant superficiellement ou gravement certaines souris peuvent aussi survenir. Il peut également y avoir des effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique, pouvant troubler l'activité locomotrice des animaux.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure en tant qu'étude électrophysiologique – Soit si des points limites sont atteints, - Soit que pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous prélevons systématiquement le cerveau de tous les animaux testés afin de confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée. Donc on étudie les cerveaux de tous les animaux utilisés dans ces expériences après leur mort.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires ainsi que les tests de puissance statistique. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Vu que notre projet porte sur les variations inter-individuelles en identifiant les stratégies idiosyncratiques/personnalisées de souris, un nombre minimum de 50 animaux par groupe pour les expériences comportementales est nécessaire pour atteindre la puissance statistique pour pouvoir comparer ces variabilités. Pour les expériences ne concernant que l’électrophysiologie, notamment en procédure 5, on peut réduire le nombre de souris nécessaires vu que l’analyse est faite par groupe et pas par individu. Pour ces expériences, le nombre de souris nécessaire pour une puissance statistique est 20.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux taches comportementales progressivement pendant la première semaine de conditionnement. Pour faciliter l’habituation des animaux aux manipulations et aux environnements de test, les animaux seront toujours tenus en « berceau » c’est-à-dire sortis de leur cage en glissant les mains ouvertes sous la souris pour la transporter entre les environnements sur les mains ouvertes. Toutes manipulations par la queue de la souris seront évitées. Pour la gestion de la douleur, les souris vont être examinées par le même expérimentateur chaque jour, dès le jour de leur chirurgie. Des points limites adaptés aux procédures ont été définis entrainant une réponse appropriée. Cependant, des bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Si l'étendue des blessures n'est pas trop grave, des soins seront apportés aux souris blessées (en fonction de la grille d’évaluation) et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Une fois le regroupement effectué, les souris seront surveillées pendant quelques heures pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si certains effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique sont constatés, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. Les critères d'arrêt surtout pour les phases post-opératoires concernent des signes de douleurs accrues constatés.

Choix des espèces

La souris a été choisie car le système dopaminergique mésocorticolimbique est bien conservé chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs par rapport à l'Homme, anatomiquement et fonctionnellement. En addition, il y a une période adolescente bien marquée chez la souris, ce qui n'est pas le cas chez les espèces comme les invertébrés, les poissons ou encore les oiseaux. Ces deux points indiquent que les souris sont l’espèce idéale pour ce projet. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d'autres modèles. Ces outils génétiques sont des moyens de moduler les réseaux neuronaux (par exemple l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés permet l’invalidation d'un gène, sa réexpression ciblée en utilisant l’optogénétique) difficilement accessibles même chez d'autres mammifères, tels que le rat ou le singe. Les souris sont considérées juvéniles lorsqu'elles sont à moins de 21 jours après la naissance, l'adolescence commence quand les souris sont naturellement sevrées environ 21 jours après la naissance. L'âge adulte est atteint quand les souris complètent leur maturation sexuelle et hormonale à environ 60 jours après la naissance. Des animaux âgés de 3 semaines sont utilisés pour les pré-traitements nicotiniques et les expériences, mais toutes les étapes de chirurgie, conditionnement comportemental, et neurophysiologie/euthanasie ne sont réalisées qu’une fois atteint l'âge adulte.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois incisions dans la peau du dos sous anesthésie, refermées par fil et par colle, puis est suivi une vingtaine de jours avant d'être tué pour prélever la ligne de suture. Le projet compare des colles de suture développées par le laboratoire, en vue d'un marquage CE et d'une étude clinique. Le porteur retient le lapin car les rongeurs arrachent les corps étrangers de leur peau, alors qu'un lapin peut porter un gilet de protection.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes formules de suture nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) pour la suture d’incision chirurgicale. 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel :un prélèvement histologique sera réalisé à J21 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique.

Bénéfices attendus

La suture de plaie traumatique ou d’incisions chirurgicales est réalisée soit par colles chirurgicales, soit par un fil de suture, soit une agrafe. La suture par fil/agrafe créé des lésions du derme et implique la présence d’un corps étranger dans la suture, engendrant un risque d’apparition d’une infection cutanée post-opératoire. Ils ont également comme inconvénient de ne pas stabiliser parfaitement la plaie lorsque des tensions sont exercées dessus. Le bord à bord des berges cutanées est maintenu uniquement au niveau du point de suture ; ceci a pour conséquence de rouvrir la plaie, gênant la cicatrisation et laissant une cicatrice fibreuse voire des cicatrices hypertrophiques ou chéloïde. Des rapports montrent que l’incidence de la formation d’une cicatrice hypertrophique après une chirurgie se trouve entre 33% et 91%. D’après l’enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France, la prévalence des patients infectés était de 4,97% en 2006 (au niveau du site opératoire dans 14% des cas). Ainsi, l’utilisation d’une colle chirurgicale ayant une force d’adhésion équivalente à une suture permettrait de résoudre les limites détaillées ci-dessus (bord à bord parfait, pas de corps étranger, pas de lésion, une parfaite stabilisation des berges de la plaie…). Les seuls produits actuellement utilisées pour cette application sont les colles de cyanoacrylate (Leukosan). Elles ont pour avantage d’avoir un temps de prise rapide et une haute résistance au déchirement. Cependant leurs faibles propriétés adhésives à la peau font qu’elles ne sont indiquées que pour les sutures de petites plaies avec un taux de déhiscence de 20%. Elles ne peuvent ainsi pas être utilisées en alternative d’une suture par fil ou agrafe. L’étude des propriétés adhésives des colles chirurgicales actuellement commercialisées montre que la faible adhérence de ces colles est due au fait qu’elles se fixent sur la surface desquamante des tissus biologiques. Or, il s’avère que l’adhésion à un tissu biologique repose sur un ancrage à son extrême surface. Les produits testés dans cette étude reposent sur ce principe. Cet ancrage à la superficie du tissu permet d’atteindre des performances techniques inégalées (équivalente à une suture par fil et dix fois supérieures aux colles chirurgicales).

Procédures

Procédure chirurgicale d’incision et suture cutanée sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anethésique 4 injections d’anti-inflammatoire 3 incisions cutanées Suture par fil Suture par collage

Impact sur les animaux

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation

Devenir

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 21 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés le long de la ligne de suture pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies traumatiques et les incisions chirurgicales sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, nous souhaitons évaluer la qualité de la cicatrisation in vivo. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. Par ailleurs dans le développement d’un nouveau dispositif médical, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité des matériaux avant le passage chez l’Homme.

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de suture utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. Nous avons prévu d’utiliser le t test pour évaluer statistiquement les différences de temps de cicatrisation.

Raffinement

La peau du dos de l’animal va être incisée à 3 endroits lors de la chirurgie. L’animal sera placé sous anesthésie générale pour la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis environ 21j le temps de la cicatrisation puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil. Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux bois à ronger dans leur environnement de vie.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de suture de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans que l’animal ne sollicite sa suture. Par ailleurs, chez un lapin adulte de 2.5kg, la surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des incisions prévues dans cette étude. Enfin, un animal mature dispose de structures anatomiques cutanée et système immunitaire adaptés aux besoins de l’étude.

188 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent plusieurs immunisations sous anesthésie et des prélèvements sanguins, puis sont infectés par le SARS-CoV-2 par le nez, pour évaluer un rappel d'un vaccin à ARN destiné aux pays à faible revenu. Le porteur indique que l'infection provoque une perte de poids entre le quatrième et le septième jour et que tous les animaux survivants sont mis à mort, les manipulations ayant lieu en laboratoire de haute sécurité. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour évaluer le vaccin sur un système immunitaire complet.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une initiative qui a pour mission de faciliter le développement et d'améliorer l'accès aux médicaments essentiels dans les pays à revenu faible et intermédiaire, et notamment l’accès aux vaccins contre la COVID-19. Ce projet propose d’évaluer chez le modèle hamster l’efficacité d’un boost avec le vaccin ARN ‘générique’ à distance d’une immunisation complète, c’est-à-dire lorsque les anticorps produits suite à l’immunisation avec un autre vaccin commercialisé contre le SARS-CoV-2 auront disparus. L’évaluation de l’efficacité s’effectuera sur 2 critères principaux : - L’Immunogénicité induite par le boost avec le vaccin générique. - La protection induite par le vaccin grâce à la réalisation de challenge infectieux en regardant plusieurs critères d’efficacité : la réplication virale au sein de différents organes (prélèvements post-mortem), la symptomatologie (apparition de signes cliniques et utilisation de points limites adaptés pour prévenir la souffrance animale) et l’histopathologie (réalisée sur des organes prélevés post-mortem). C’est un projet multisite impliquant deux laboratoires différents situés dans le même bâtiment.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de vérifier l'efficacité d'un boost réalisé avec un vaccin 'ARN' générique produit par le Centre de Transfert de la Technologie des vaccins à ARN messager afin de réduire les inégalités dans l’accès aux vaccins contre la COVID-19 dans les pays à revenu faible et intermédiaire.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : Les animaux seront immunisés par voie intramusculaire (une injection dans une cuisse). Cette intervention dure en moyenne 5 minutes (anesthésie + immunisation). Une dose de rappel sera effectuée 21 jours après cette première injection (dans l'autre cuisse), selon les mêmes conditions, puis une dose de boost environ 210 jours après la dernière injection. Cette immunisation n’induit qu’une douleur légère et de courte durée. Ces immunisations seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins seront réalisées sous anesthésie générale (trois maximum par animal, avec un intervalle d’au moins 21 jours entre deux prélèvements). Cette intervention dure en moyenne 6 minutes (anesthésie + prélèvement). Les animaux sont également pesés régulièrement (1 minute). Après leur transfert dans le deuxième établissement utilisateur : Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. Les animaux sont également pesés tous les jours (1 minute). Un ou deux prélèvements seront effectués sur chaque animal: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).

Impact sur les animaux

Concernant l’immunisation : l’administration d’un vaccin chez le hamster induit une douleur légère et de courte durée. Les animaux sont anesthésiés pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins et l’infection par voie intranasale. Les animaux sont également pesés tous les jours. Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanément résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Un lavage nasal, sous anesthésie, est réalisé une ou deux fois pour chaque animal.

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le développement d’un vaccin passe par plusieurs étapes indispensables. La première est sa construction : l’objectif est de présenter des éléments caractéristiques du microbe ciblé au système immunitaire. La seconde correspond aux essais précliniques, qui est le cadre dans lequel s'inscrit notre projet. C’est une étape indispensable pour sélectionner les meilleurs candidats et éviter d’administrer à des humains des vaccins inefficaces ou qui seraient trop inflammatoires. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer l’efficacité du candidat vaccin en condition réelle, mettant en jeu le système immunitaire complet d’un être vivant. Enfin, la dernière consiste à réaliser des essais cliniques chez l’Homme.

Réduction

Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel G*Power, pour une puissance de 80%, un risque alpha de 5%. Au sein de la littérature, ainsi qu’au cours de nos expériences précédentes, nous avons observé et obtenu un écart type de 0.5log (en quantité de particules virales) chez les animaux non immunisés et de 0.4log (en unités arbitraires, pour les sérologies) chez les animaux immunisés. Pour considérer une différence de 1log comme significative (en quantité de particules virales et en unités arbitraires pour les sérologies), nous avons donc utilisé une « taille d'effet » de 2 pour le calcul (Taille d'effet = Δ/écart-type).

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés (isoflurane) pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins, l’infection par voie intranasale et lors de la réalisation d’un lavage nasal (Induction au sein d’une boite : Isoflurane 5%, 2L/min). D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré lorsque les hamsters présentent une atteinte de l’état général (mesuré quantitativement grâce à une grille de score). Par ailleurs, des points limites adaptés, entrainant la mise à mort de l’animal, ont été choisis. Les animaux (3 ou 4 par cage) seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving », et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés régulièrement durant la période d’expérimentation (quotidiennement après infection). Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué de la façon suivante (les 2 établissements sont dans le même bâtiment à un étage de distance) : Les cages contenant 3 animaux (enrichies en aspen brick et paper shaving et sans privation de nourriture et boisson) seront opacifiées par l’ajout de couvertures sombres et le transfert aura lieu en période de faible affluence.

Choix des espèces

Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2 puisque la souche originelle de SARS-CoV-2 est capable d’infecter naturellement les hamsters syriens dorés. Animaux âgés de 3 à 10 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études précliniques sur le SARS-CoV-2.

56 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie de pose d'implant utérin sous anesthésie, sept à neuf prélèvements sanguins et plusieurs transports entre deux sites, pour évaluer un dispositif destiné à traiter les fibromes chez la femme. Le porteur indique que, le jour de la mise à mort, les brebis encore anesthésiées seront utilisées pour la formation chirurgicale d'internes dans le cadre d'un autre projet, avant l'euthanasie. Il précise avoir écarté le primate, habituellement utilisé pour ce type d'étude, au profit de l'ovin.

Objectifs

L’objectif principal est la tolérance d'un implant utérin (type stérilet) qui permettrait de traiter localement les fibromes chez la femme. Le devenir dans l'organisme du principe actif contenu dans les implants intra-utérins à libération longue durée sera évalué. Les critères d’évaluation sont: - La teneur en principe actif dans les tissus utérins à différents temps (1 mois, 2 mois ou 3 mois) - La teneur en principe actif dans le plasma sanguin par prise de sang à différent temps et au stade terminal. Les objectifs secondaires et critères d’évaluation sont les suivants: - Evaluation de la tolérance locale du principe actif par une évaluation macroscopique et histologique des organes en terminal (utérus, ovaires, vagin, foie, rein) - Évaluation de l’état du système de délivrance du principe actif à l'issue de l'expérience par prélèvement de l’implant. L’évaluation de la dégradation est macroscopique et des caractérisations physico-chimiques seront réalisées. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2).

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation animale permettra d’évaluer les prototypes d’implants en termes de profil pharmacocinétique, notamment la durée et le niveau de concentrations circulantes. Ce projet permettra d’évaluer la performance et la sécurité des prototypes de dispositifs intra-utérin à libération prolongée d’un principe actif avant de passer en phase clinique. Le projet est nécessaire pour démontrer le profil pharmacocinétique du principe actif, l’exposition locale utérine, l’exposition systémique ainsi que la tolérance locale du principe actif et du système de libération vis à vis des organes.

Procédures

Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 2h). Puis de 7 à 9 prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile (estimé à 10 min chacun). Le jour de la fin de procédure et donc de mise à mort, les animaux sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d'une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior (durée inférieure à 4h avant sacrifice, toujours sous anesthésie générale). Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 semaines à environ 3 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

En termes d’effets indésirable, le principe actif est approuvé aux Etats-Unis pour une utilisation chronique dans le syndrome de Cushing afin de contrôler l'hyperglycémie chez les patients. Le système de délivrance du médicament testé chez les animaux contiendra une dose beaucoup plus faible que celle usuellement pratiquée par voie orale. Avec une libération prolongée sur 3 mois, le risque d’entraîner des effets indésirables chez l’animal est extrêmement faible. Un stress peut également être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant l'intervention, avant les anesthésies, lors des 4 prises de sang en post opératoire et lors des transports et changements de lieu. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post opératoires sont possibles. Une légère douleur au point de prélèvement des prises de sang est également envisagée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort le dernier jour de suivi. Néanmoins, avant l'euthanasie, l'animal toujours sous analgésie et anesthésie générale, pourra être utilisé à des fins de formation des internes de chirurgie dans le cadre d'un autre projet autorisé (pour une durée inférieure à 4 heures). L'animal est ensuite euthanasié.

Remplacement

Le projet consiste à démontrer l’efficacité d'un système de délivrance d’un principe actif qui a d’ores et déjà été étudié et vérifié via des études in vitro. Avant de passer en phase d'étude clinique, l'étape in vivo est requise et ne peut être remplacée pour valider l’efficacité du système de délivrance. L’efficacité du système de délivrance repose notamment sur des processus biologiques d’absorption, d’accumulation et d’élimination, qui ne peuvent être simulés en intégralité par des modèles non vivants ou par des modèles in-silico. Par ailleurs, nous avons considéré de remplacer les primates utilisés habituellement pour des études de ce genre par des ovins.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au strict minimum (6 animaux par lot : 2 par durée de suivi). Il a été préféré de limiter ce nombre à son minimum et de permettre de renouveler chaque lot une fois en cas de besoin. Dans l'objectif de réduction du nombre d'animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique du site porteur, les animaux lorsqu'ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (au bout d’un mois, de deux mois ou de trois mois de suivi selon le groupe), les animaux ne seront pas directement mis à mort mais utilisés à des fins de formations des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, toujours sous anesthésie générale, avant euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).

Raffinement

La procédure d’implantation du dispositif se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d'analgésique préopératoire et un ajustement des doses en cas d'apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Une analgésie post-opératoire sera également mise en place. Les animaux seront re-transférés sur leur lieu d'approvisionnement (site n°2 agréé à l'expérimentation animale) qui est plus adapté pour les périodes prolongées. Les temps de trajet des animaux sont de courte durée (inférieurs à 30 min). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Une grille de score est établie avec suivi des points limites (grille de scores). La même grille de score sera applicable quel que soit le lieu d'hébergement.

Choix des espèces

Le système de délivrance du médicament est destiné à être implanté dans la cavité utérine des femmes adultes dans l’objectif de diminuer la taille des fibromes utérins. Par conséquent, l’espèce a été choisie en fonction de l’anatomie utérine, de telle sorte que celle-ci soit la plus similaire possible à celle de l’anatomie de la femme. L’utérus de la femme est un utérus simplex, caractéristique des humains et des primates. Le primate n’a pas été sélectionné pour l’étude pour des raisons éthiques et de disponibilités de l’espèce. Les autres espèces possèdent soit un utérus duplex (rat, lapin, cochon d’inde, etc), bipartite (jument) ou bicorne (chienne, truie, vache, brebis). Les espèces pouvant être utilisés pour l’expérimentation animale possèdent donc une anatomie différente de celle de la femme. Afin de sélectionner l’espèce la plus pertinente pour l’étude, la taille de l’utérus a donc été le second critère de choix.L’utérus de l’espèce doit pouvoir recevoir l’implant dans son intégralité pour pouvoir transposer les résultats obtenus vers l’application clinique. La taille des cornes utérines de la brebis et de la truie permettent l’implantation de l’implant dans sa totalité. La brebis représente un meilleur modèle que la truie en raison de sa taille, de l'anatomie pelvienne et de la taille des vaisseaux utérins. La brebis adulte a donc été sélectionnée comme l’espèce la plus pertinente.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome ou de leucémie puis des injections de vésicules liposomales, pour tester un candidat traitement contre ces cancers du sang. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter fatigue, pâleur, difficultés à s'alimenter et signes d'aplasie de la moelle. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà validé les composés in vitro et conclut qu'à ce stade préclinique le recours aux méthodes sans animaux "n'est plus possible".

Objectifs

Les Lymphomes et les leucémies sont des cancers des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules cancéreuses. Près de la moitié des cancers du sang sont des lymphomes. Ce sont des cancers du système lymphatique, avec environ 80 % de lymphomes non hodgkinien (LNH) et 20% de lymphomes hodgkiniens (LH). Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes (B, le plus souvent, ou T) au niveau des ganglions, du foie, de la rate et plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100.000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes et liposomes biologiques) susceptibles d’être utilisés dans le traitement de ces pathologies. Nous les avons validés dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines (lignées cellulaires humaines déjà établies) dans des souris immunodéficientes, ou des greffes de cellules leucémiques humaines et lymphomateuses murines (lignées cellulaires murines déjà établies) dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec les immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémie et de lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques moins intenses et susceptibles d’être utilisées dans le traitement des leucémies et des lymphomes et leurs rechutes.

Procédures

Pour les lymphomes, les animaux seront soumis à des implantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) sur leur flanc sous anesthésie générale. Une seule injection est prévue par souris, (durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections par voie intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (2 injections par souris sont prévues, à J6 et J9, durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes soit au maximum durée de 1 minute) sera réalisé Pour les leucémies, les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intraveineuses (i.v.) (une seule injection d’une suspension tumorale est prévue par souris, durée totale de 5 secondes sur souris vigile). Après la transplantation, des injections par voie intraveineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J15, J20, J25 , durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes, durée de 1 minute) sera réalisé à J35 jours après la transplantation.

Impact sur les animaux

. Dans moins de 1% des cas, une nécrose de la tumeur peut être observée. les souris peuvent présenter un état de fatigue et une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. , elles pourront avoir des difficultés pour s’alimenter , montrer des signes d’aplasie médullaire, Les injections peuvent provoquer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la procédure.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests, nous utiliserons des groupes de de 7 souris afin d’effectuer des tests du Logrank, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests de Student (t test ou ANOVA).

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours à l’approche du J35 ). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées et de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes sans crainte de rejet de greffe. L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (A1, mus musculus) est l’une de celle qui se rapproche le plus de l’homme. L’infiltration des cellules leucémiques dans la moelle osseuse ainsi que dans la rate reproduit la physiopathologie de la maladie. Nous utilisons des souris, car nous possédons des modèles de xénogreffes reproduisant de façon assez fidèle le développement des leucémies humaines. C’est pourquoi l’étude de l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux et des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.

27 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une opération de trois à quatre heures sous anesthésie pour recevoir des implants sous-cutanés, suivie de deux semaines à six mois avant d'être tuée et sa peau prélevée, afin de tester la réaction immunitaire à un substitut vasculaire biologique. Le porteur présente comme une mesure de réduction le fait que le cœur des brebis pourra ensuite être utilisé pour des projets de cardiologie du même institut. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle ne peut suppléer l'animal vu la complexité du système immunitaire et retient la brebis comme seule espèce dont les cellules conviennent.

Objectifs

Contexte : Pour créer un abord vasculaire pour permettre l’hémodialyse, ou pour créer un pontage en remplacement de petits vaisseaux sanguins périphériques ou coronariens obstrués le chirurgien utilise des vaisseaux sanguins du patient lui-même. Malheureusement, ces vaisseaux viennent souvent à manquer lors d’interventions répétées suite à la progression d'une maladie par exemple. Dans cette situation, des prothèses vasculaires synthétiques sont utilisées mais avec de mauvais résultats. Ainsi, de nombreux groupes de recherche ont émis l’hypothèse qu’une prothèse vasculaire entièrement biologique apporterait de meilleurs résultats qu’une prothèse synthétique, c’est pourquoi l’objectif de ce projet est de développer un substitut vasculaire entièrement biologique par ingénierie tissulaire, issu d’une approche par substitut cellulaire. Cette approche repose sur la production de feuillets composés de matrice extracellulaire synthétisée par des cellules maintenues en culture cellulaire. A partir de ces feuillets de substitut cellulaire, des fils sont produits et utilisés afin d’assembler un substitut vasculaire par tissage. C'est à dire que ce procédé a pour objectif final de créer des vaisseaux à partir de cellules qui pourront être implantés. Notre étude a montré que le modèle ovin semblait plus adapté pour produire des feuillets de substitut cellulaire. L’expérimentation envisagée consiste à étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à l’implantation sous-cutanée des fils produits à partir de feuillets ovins.

Bénéfices attendus

Le développement d’un modèle animal va permettre d’appréhender la réaction immunitaire de l’hôte à l’implantation du substitut vasculaire dans un contexte de greffe allogénique (conditions proches des conditions cliniques). Les bénéfices de ce projet permettront de s’assurer de la biocompatibilité du tissu produit avant d’envisager le tissage du substitut vasculaire et son implantation. De plus, la réponse des cellules de l’hôte qui peuvent soit détruire, soit remodeler l’implant ne peuvent être évaluées autrement. L’expérimentation envisagée consiste à étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à l’implantation sous-cutanée des fils produits à partir de feuillets ovins. Cette expérimentation permettra d’évaluer la réponse inflammatoire ainsi que le remodelage des fils à différents temps de suivi (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois) par des analyses histologiques et l’analyse des propriétés mécaniques des fils (avant et après l’implantation). Ces données nous permettront de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des fils les plus adaptés pour tisser le substitut vasculaire.

Procédures

Chaque animal sera opéré une seule fois et l’intervention chirurgicale sera effectuée au bloc opératoire sous anesthésie générale par le personnel formés et habilités (environ 3 à 4 heures d’opérations).. Les fils expérimentaux et contrôles seront implantés en sous-cutanées à l’aide d’aiguille stérile. Suite à la procédure, le suivi, le réveil, les soins per-opératoires et post-opératoires seront effectués par le personnel de l’animalerie. Après leur réveil, les animaux sont remis en stabulation collective dans un objectif de raffinement. Ils sont maintenus sous surveillance pendant 6 à 10 jours où ils reçoivent les soins post- opératoires. Après cette période de surveillance, les animaux sont hébergés soit à l’établissement utilisateur, soit transportés et hébergés dans des conditions de ferme dans les hébergements annexes. Ils seront visités et suivis quotidiennement par le personnel présent et formé et reviendront minimum 72h avant le jour de prélèvement, défini en fonction de leur temps de suivi (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois). Les explantations seront effectués après l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels se situent principalement lors de la réalisation de la procédure chirurgicale sous- anesthésie. Les effets indésirables lors de l'opération peuvent être: troubles du rythme cardiaque et hypothermie. Des effets indésirables post-opératoire peuvent être : infection du site d’implantation sous-cutanées, mauvaise cicatrisation et démangeaisons. Au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement les potentiels effets indésirables peuvent être un stress ou de l’angoisse du au trajet entre l’EU et l’hébergement annexe.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort aux différents temps précédemment décrits (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois). La peau des animaux sera ensuite prélevée après le sacrifice des animaux. Les différents fils expérimentaux seront explantés pour être analysés

Remplacement

Il est nécessaire de s’assurer de la biocompatibilité du tissu produit (les fils de substitut cellulaire) avant d’envisager le tissage du substitut vasculaire et son implantation. De plus, la réponse des cellules de l’hôte qui peuvent soit détruire, soit remodeler l’implant ne peuvent être évaluées autrement. A ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. L’étape d’expérimentation animale est également légalement obligatoire avant l’utilisation de ce type de produit chez l’humain. Nous avons choisi un modèle ovin pour les raisons suivantes. Les modèles animaux immunodéficients ou immunosupprimés notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles animaux ne permettent pas d’étudier le système immunitaire innée et adaptif et représente des conditions d’implantations xénogéniques éloignés des conditions cliniques futures allogéniques.C’est pourquoi ce projet vise le développement d’un modèle de gros animal qui permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative dans un contexte de greffe allogénique (indisponible chez les animaux immunodéficients ou immunosupprimés) simulant les conditions cliniques. D’après nos études menées au laboratoire, le modèle ovin est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de substitut cellulaire qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines et permettront d’étudier la réponse immunitaire dans un contexte allogénique. Le but de ce projet est le développement d’un modèle ovin qui va permettre d’appréhender la réaction immunitaire innée et adaptative de l’hôte à l’implantation des fils de substitut cellulaire dans un contexte de greffe allogénique.

Réduction

Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables avec des tests statistiques de comparaison multiple pour comparer les différentes conditions et les différents temps d’implantation. Nous souhaitons implanter 2 brebis pour chaque temps expérimental classiquement décrits dans la littérature (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois) pour l’étude de la réponse immune innée et adaptative (précoces et tardives). Pour chaque condition expérimentale testée, nous implanterons 8 fils de chaque condition sur chaque animal. Ainsi chaque animal sera son propre contrôle car toutes les conditions expérimentales seront implantées dans chaque individu, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation à 2 par temps de suivi. Le renouvellement de ces expérimentations permettra d’effectuer des modifications et/ou optimisations des conditions expérimentales avec un criblage plus fin pour sélectionner le conditionnement de préparation du fil de substitut cellulaire le plus adapté à la production du substitut vasculaire. Dans un objectif de réduction globale d’utilisation d’animaux vivants à des fins expérimentales, les animaux utilisés dans ce projet pourront être sacrifiés selon les méthodes décrites de prélèvement cardiaque de l’établissement utilisateur afin que leur cœur puisse être utilisé dans les projets de recherche de cardiologie mené au sein de cet institut.

Raffinement

Les animaux seront suivis dans des locaux agréés avec du personnels qualifiés et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Lors des interventions, angoisse, douleur et souffrance seront réduites par une prémédication. Durant l’anesthésie qui sera maintenue par voie gazeuse. l’électrocardiogramme, la pression artérielle, et la saturation en oxygène seront suivis. Des molécules de réanimation et un défibrillateur seront utilisés en cas de besoin selon les signes cliniques et du monitoring des signes vitaux. Le réveil de l’animal est réalisé sous analgésique et oxygène jusqu’à obtention d’une respiration spontanée. Le réveil sera surveillé par le personnel de l’animalerie qui vérifie la température et la posture debout de l’animal et administre des soins si nécessaire. Après leur réveil, les animaux sont remis en stabulation collective (raffinement adéquat à son espèce groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille…) Pour l’hébergement des animaux; Ils sont maintenus sous surveillance à l’établissement utilisateur pendant 6 à 10 jours où ils reçoivent les soins post-opératoires, pour surveiller leur état de santé et soigner les plaies chirurgicales. Les animaux sont ensuite hébergés soit à l’établissement utilisateur, soit transportés vers l’hébergement annexe. Ça offrira à l’animal des conditions quotidiennes maximales d’hébergement durant les périodes intermédiaires entre les différentes étapes du projet. Ils seront visités et suivis quotidiennement par le personnel présent, et reviendront sur le site de l’établissement utilisateur minimum 72h avant le jour de prélèvement, défini en fonction de leur temps de suivi. Des points limites ont été définis. Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. L’observation de l’état des animaux est réalisée quotidiennement au sein de l’établissement où ils seront hébergés. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points limites ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’établissement utilisateur pour définir la conduite à tenir (prescription traitement médical adapté, examens complémentaires). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire. En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de substitut cellulaire qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Grâce à la collaboration mise en place avec, nous avons déjà extrait, purifié et amplifié des cellules issues de biopsies de peau récupérées post-mortem sur des brebis. Nous avons donc sélectionné l’espèce qui nous permettrait d’étudier la réaction immunitaire et le remodelage des fils par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes. Les brebis possèderont un système immunitaire et un système vasculaire mature. Cet âge est aussi compatible avec le suivi des implantations à des temps tardifs (6 mois).

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une brûlure du troisième degré, une greffe de peau humaine puis une infection par une bactérie, pour tester un traitement au plasma froid contre les biofilms, avant d'être tuées pour prélever la peau et le sang. Le porteur reconnaît que la brûlure est un dommage inhérent au projet, avec un stress thermique et une infection attendus, et évoque un risque de diffusion sanguine des bactéries. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle de peau reconstruite ne reproduit la véritable inflammation et conclut qu'il est "indispensable" de tester in vivo.

Objectifs

La peau est une barrière physique essentielle pour le corps humain : elle protège l’organisme contre le milieu extérieur. Cependant, lorsqu’elle subit une grave agression comme une brûlure profonde ou que les mécanismes de cicatrisation sont mis à mal comme dans le cas d’ulcères diabétiques, la fonction barrière de la peau n’est plus efficace et l’organisme entier peut être mis en danger. En effet, dans le cas des brûlures étendues ou des plaies chroniques, les infections sont très fréquentes et peuvent mener à des complications comme des amputations ou des septicémies, premières causes de mortalité des grands brûlés. Les infections les plus fréquentes sont provoquées par la bactérie pathogène opportuniste Staphylococcus (S.) aureus. Hypothèse de travail et contexte scientifique : Le plasma froid (PF) contient des électrons, des ions positifs et négatifs, des radicaux, des molécules excitées, des ultraviolets (UV) et génère un champ électrique transitoire. La température du gaz généré est proche de la température ambiante. Le PF est capable d’initier des réactions variées dans les systèmes biologiques et pourrait être utilisé dans le traitement de désordre cutané comme les brûlures et les plaies chroniques. Le plasma permet un traitement local et non pas systémique et n’induit pas de sous-produits à éliminer. Nos expériences in vitro non publiées ont démontré que le plasma froid active des molécules toxiques pour les bactéries. Projet : Pour donner suite à ces résultats prometteurs, nous souhaitons caractériser les mécanismes antibactériens du PF et son potentiel anti-biofilm in vivo. Notre objectif est de démontrer que l’application directe de PF sur une brûlure du troisième degré infectée par S. aureus permettrait d’empêcher la formation de biofilms ou de les éliminer, ainsi que d’en comprendre le mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet, mené sur un modèle de plaie cutanée par brûlure au troisième degré traitée par une greffe de peau humaine et infectée par des bactéries, permettra de révéler le mécanisme d’un traitement direct par plasma sur la désinfection de ce type de plaie et la prévention de formation de biofilms, une nouvelle piste thérapeutique.

Procédures

Type d'intervention sur animaux vivants : - Anesthésie générale (durée 20 min) - Intervention chirurgicale (durée 20 min) - Injection (durée 1 min, 3 fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie) - Infection sur la peau (durée 1-2 min) - Analyse du signal bioluminescent (10 min) Nuisances attendues : - Stress physique d’origine thermique - Lésions et infection cutanée

Impact sur les animaux

La brûlure cutanée sera un dommage inhérent au projet. Un stress physique d’origine thermique est donc attendu. De même, des lésions et une maladie sont attendues suite à l’infection des greffons. D'autres dommages pourraient se produire suite à la diffusion par voie sanguine des bactéries à partir du foyer initial cutané (endocardite, ostéomyélite, choc septique) bien qu'ils n'aient pas été observés dans notre étude précédente.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure qui permettra d‘étudier la formation des biofilms et leur traitement par le plasma froid. Au cours de l'expérimentation, des animaux seront infectés par Staphylococcus aureus. À la fin de l'expérience, des tissus comprenant de la peau infectée et du sang seront prélevés. Le prélèvement de tissus biologiques nécessite l'euthanasie.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative à l’expérimentation animale pour cette étude. En effet, le plasma, en distribuant des espèces actives, agit non seulement sur les cellules cibles mais aussi sur l’équilibre moléculaire in vivo à la fois localement mais aussi de manière plus diffuse autour de la zone traitée. Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, la précision et la reproductibilité de la technique ont été validés précédemment sur des cellules cutanées isolées in vitro. Des modèles de peau bio-imprimés en 3D et ex vivo sont également utilisés au laboratoire. Mais ceux-ci ne permettent pas de reconstituer la véritable inflammation et ne contiennent que 3 types de cellules différentes. Il est donc indispensable de tester cette technique in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet est réduit au strict minimum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative, à savoir 6 animaux par condition, à raison de 7 conditions, en 3 réplicas et 42 animaux donneurs, soit un total de 168 souris. Une précédente expérimentation avait permis de montrer que ce nombre d’animaux par groupe était suffisant pour conclure de manière significative.

Raffinement

Avant et après la brûlure et la chirurgie une analgésie sera maintenue. Les souris anesthésiées seront réchauffées pour prévenir l'hypothermie. Pendant 48 heures après la brûlure, une réhydratation des animaux par injection de solution de réhydratation sera réalisée. Des gels hydriques seront disposés dans les cages. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. La pose de la greffe de peau sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris anesthésiées seront réchauffées. L’injection d’analgésie sera administrée 30 min avant la pose d'une greffe de peau, puis toutes les 8 heures 3 fois par jours après la greffe. Une solution de réhydratation sera injectée pour éviter la déshydratation. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. L’analgésique sera injecté 3 fois par jour. Toutes les souris seront pesées quotidiennement. Les souris seront surveillées une fois par jour pour les activités naturelles telles que l'exploration, le repos, l'escalade, le toilettage, la recherche de nourriture, la nidification et le comportement social. Les points limites généraux seront : une perte de poids significative, des changements de comportement, tels que l'agressivité, l'isolement dans le groupe, l'agitation et l'automutilation, ainsi que des réactions autonomes telles que des pupilles dilatées, une respiration rapide et la piloérection persistante. Un autre point limite spécifique sera la surinfection non liée à la procédure.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphyloccus (S.) aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus. Il y a une abondante littérature et des modèles expérimentaux bien établis chez la souris de laboratoire. De plus, nous avons l'expérience de l'expérimentation animale sur cette espèce au laboratoire. Cet animal sera bien adapté à notre problématique. En effet, les plaies étudiées sont faiblement étendues limitant la douleur et les dommages : l'utilisation d'une autre espèce mammifère de plus grande taille comme le rat nécessiterait plus de matériel de départ pour un gain nul. Enfin, une précédente étude réalisée chez la souris a donné des résultats très prometteurs. Les souris auront environ 6 semaines à leur livraison. Une phase d’acclimatation d’une semaine minimum sera observée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 8 semaines). A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation et une brûlure aisée de la peau.

840 souris rendues obèses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un gilet plusieurs semaines, subissent rasages et applications cutanées quotidiennes ainsi que des séries de piqûres à la queue pour mesurer la glycémie, pour étudier le passage de médicaments à travers la peau et leur accumulation dans la graisse. Le porteur décrit un régime hypercalorique imposé et des manipulations répétées, tout en jugeant leur impact sur le "bien-être" limité. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte des interactions entre les tissus et qu'il faut prendre en compte "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Notre projet vise à comprendre comment la composition des formulations utilisées pour appliquer des médicaments sur la peau influe sur la manière dont ces molécules pénètrent la peau et s'accumulent dans le tissu adipeux. Nous cherchons à établir une corrélation entre la nature chimique des substances actives et leur accumulation dans le tissu graisseux en fonction des formulations utilisées. En d'autres termes, nous étudions comment différentes molécules médicamenteuses se déplacent à travers la peau en fonction des composants qui les accompagnent. Cela nous permettra de formuler des médicaments de manière à minimiser leur passage dans le système sanguin, favorisant ainsi leur effet local dans les tissus sous-cutanés. L'objectif est de mieux comprendre la biodistribution des médicaments chez les personnes obèses lors d'une application cutanée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de découvrir comment les produits utilisés pour appliquer des médicaments sur la peau peuvent influencer la façon dont ces médicaments se répartissent dans notre corps. Nous voulons comprendre comment ces produits affectent la manière dont les médicaments atteignent et restent dans les cellules graisseuses. Ces données permettront de mieux comprendre comment les médicaments se propagent dans le corps des personnes obèses lorsqu'ils sont appliqués sur la peau

Procédures

• Rasage des poils avec une tondeuse spécifique : cela concerne tous les animaux à la fréquence d’1/10j pendant 30j max • Application des formulations cutanées : cela concerne tous les animaux, tous les jours pendant 10 à 30j (durée du traitement) • Mise en place du gilet protecteur : il va représenter une gêne pour l’animal, il est donc nécessaire de l’habituer au port du gilet qui durera 10 à 30j. • Prélèvement sanguin mandibulaire : cela concerne tous les animaux qu’1 fois et sera réalisé sous anesthésie • Prélèvement d’une goutte de sang par piqure au niveau caudal pour la mesure de glycémie. Ce geste est réalisé sur animal vigile à la fréquence de 5 piqures en 2h qui sera renouvelé 3 fois sur l’expérimentation. Ce geste concernera tous les animaux.

Impact sur les animaux

Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant le démarrage de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux à leur arrivée à l’animalerie. Le régime va engendrer une prise de poids ayant un impact minimal sur leur bien être. Le rasage des poils, l’application des formulations n’induiront pas de nuisances et d’effets indésirables aux doses choisies. En effet, les composés associés à la substance active sont connus pour avoir des propiétées non irritantes. Les doses utilisées pour chaque molècule modèle ne devront pas induire d’effets irritant au niveau cutané ou générer des effets indésirables systémiques. L’apparition d’effets indésirables a été prise en compte dans le cadre des points limites et sera anticipée dans le choix des molécules modèles et des deux doses appliquées. Les souris porteront des gilets aérés afin d’éviter qu’elles lèchent les formulations déposées sur leur peau ou celle de leurs congénères ce qui limite le risque d’effets indésirables ou de modifier les résultats. Par le biais de ce dispositif, l’isolement des individus sera évité. Le gilet sera maintenu en place pendant toute la durée du traitement (10-30 jours) et une acclimatation sera prévue dès le début de l’expérimentation (1h/jour puis une pause d’une journée puis une augmentation du temps pour qu’au bout de deux semaines l’animal soit habitué à le porter pendant 24h. Le dernier mois il portera en permanence le gilet).

Devenir

Mise à mort car un prélèvement de différents organes doit être réalisé

Remplacement

Cette étude consiste à comparer la répartition dans le corps de substances actives en fonction des produits utilisés et des individus (obèses ou non). Nous examinons comment ces substances sont absorbées par la peau, comment elles se déplacent à l'intérieur de celle-ci, et dans quel type de graisses, ils se stockent. D'autres modèles notamment cellulaires ne nous permettent pas de comprendre comment ces deux types de tissus interagissent sur le long terme ni comment ces substances s'accumulent dans les différents types de gras corporel, comme le gras blanc ou brun. C'est pourquoi il est important de prendre en compte l'ensemble de l'organisme dans cette étude.

Réduction

Avant de réaliser des tests sur les animaux, nous allons d'abord vérifier si les substances que nous utilisons pour administrer les médicaments se mélangent bien entre elles en laboratoire. Cela nous aidera à réduire le nombre de combinaisons que nous devrons tester. Ensuite, après avoir fait des tests sur les animaux, nous pourrons éliminer certaines de ces combinaisons. C'est pourquoi nous avons prévu de tester 15 combinaisons différentes, en utilisant 10 médicaments modèles et 5 substances de transport.

Raffinement

Des personnes formées s'occuperont des animaux en veillant à minimiser leur stress. Nous avons veillé à ce que les souris s'habituent à porter les gilets de protection afin de ne pas les stresser. Pendant le traitement, nous veillerons à ce que les souris gardent une interaction sociale durant toute l’expérimentation et un enrichissement de leur environnement. Pour les souris en surpoids, nous tiendrons compte du fait qu'elles peuvent rencontrer des difficultés à bouger, et nous les surveillerons de près afin qu’elles aient accès à la nourriture et à l’eau de boisson. Si elles semblent avoir du mal, nous mettrons la nourriture près d'elles et leur donnerons de l'eau sous forme de gel. Pendant le traitement, nous vérifierons tous les jours si les souris réagissent bien aux médicaments. Si elles semblent avoir mal, nous évaluerons leur niveau de douleur grâce à des critères spécifiques décrits par Lloyd et Wolfensohn (1998).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été défini suite à une étude bibliographique de référence qui a été établie sur cette espèce avec des souris âgées de 6 semaines en début de régime alimentaire adapté afin qu’elles atteignent un poids d’environ 150 g pour celles qui auront le régime hautement énergétique.

229 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une anomalie liée aux leucémies aiguës myéloïdes, elles développent avec l'âge des maladies du sang et subissent des injections et jusqu'à dix prélèvements sanguins, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. Le porteur indique que ces souris peuvent former, rarement, des tumeurs solides de gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux est "incontournable" pour saisir les conséquences de ces anomalies au sein d'un "organisme vivant".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’un des mécanismes à l’origine de l’apparition d’hémopathies malignes chez l’homme. Les hémopathies malignes sont des affections de la moelle osseuse, tissu qui est responsable de la fabrication de l’ensemble des cellules du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes). Les hémopathies malignes regroupent un ensemble hétérogène de cancers des cellules sanguines ; on distingue les leucémies, les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les lymphomes. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent la majorité des leucémies aiguës de l’adulte. Comme toutes les hémopathies, les LAM sont la conséquence de nombreuses anomalies génétiques acquises au cours du temps.

Bénéfices attendus

L'étude de modèles animaux reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine pourrait permettre potentiellement de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la prédisposition au cancer chez les individus présentant des hématopoïèses clonales à potentiel indéterminé (dont les anomalies IDH2). Ceci pourrait permettre également de tester des nouveaux traitements pertinents.

Procédures

Les animaux pourront avoir des injections uniques sous anesthésie locale (durée 1 minute). Des prélèvements de sang sous anesthésie locale seront faits (durée 3 minutes) chez certains animaux, au maximum une fois par semaine quand les animaux développent une hémopathie. Le nombre de ces prélèvements pourra être de 10 au maximum par animal.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang pourront impliquer des contraintes et un stress légers et temporaires. Les animaux pourront développer avec l'âge des syndromes hémopathiques avec (rarement) formation de tumeurs solides de gravité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les conséquences fonctionnelles de ces évènements « fondateurs » du cancer ne peuvent être pleinement appréhendées qu’au sein d’un organisme vivant ; en effet ces anomalies génétiques fondatrices influent sur l’expression de nombreux gènes qui eux-mêmes conditionnent le devenir des cellules en réponse aux multiples signaux extra-cellulaires présents chez un individu et au sein d’un tissu (homones, facteurs de croissance etc…). L’utilisation d’animaux est incontournable pour évaluer l’importance des processus biologiques affectés par ces anomalies fondatrices. Pour ces raisons, nous établissons des lignées de souris génétiquement modifiées reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine.

Réduction

Dans toutes les procédures, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.Les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés par calcul de puissance. Pour les analyses subséquentes, nous utiliserons un test statistique non paramétrique Mann-Whitney-Wilcoxon. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement, en fonction des résultats obtenus. Les nombres indiqués dans ce projet sont des nombres maximaux.

Raffinement

Tout signe de souffrance ou de douleur chez l’animal entrainera la mise en place d’un soin particulier, antalgiques et morphiniques,. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). - Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale ou générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. - Les souris auront un suivi clinique quotidien.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et techniques détaillées essentielles à nos études. C'est donc le modèle animal le plus pertinent pour ces études d'hémato-oncologie. Animaux adultes, ces pathologies se développant progressivement avec l'âge chez l'adulte.