Procédures modérées
Evaluation de l’activité anti-inflammatoire d’une bactérie intestinale dans un modèle murin de psoriasis cutané
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un psoriasis provoqué par une crème appliquée sur les oreilles sous anesthésie, et un gavage répété cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour tester une bactérie intestinale censée atténuer les lésions cutanées. Le porteur indique que le gavage répété peut enflammer la sphère ORL et le haut de l'œsophage et provoquer une perte de poids par défaut d'alimentation. Il affirme qu'aucun test sans animal ne peut intégrer la réaction immunitaire de la peau et conclut que l'étude "ne peut être conduite qu'in vivo".
Objectifs
Le Psoriasis est une maladie cutanée chronique qui touche environ 5% de la population générale. De plus en plus d'études suggèrent un rôle du microbiote intestinal (bactéries intestinales) dans le développement des lésions de psoriasis. Ces découvertes permettent d'envisager le développement de traitements probiotiques, à base de "bonnes" bactéries intestinales, qui viendraient améliorer les lésions cutanées après administration orale. Dans cette étude, nous testerons l'impact d'une "bonne bactérie" administrée par voie orale chez une souris atteinte de psoriasis. Le but est démontrer que ce nouveau type de traitement fonctionne sur un modèle de souris (amélioration du psoriasis) avant d'envisager son développement chez l'homme.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, une étude chez l'homme sera envisagée : nous pourrons dans ce cas étudier si un traitement oral par P. distasonis (une "bonne" bactérie intestinale aux propriétés anti-inflammatoires) permet d'améliorer le psoriasis chez l'homme.
Procédures
Le traitement à base de P. distasonis, une bactérie intestinale bénéfique, sera réalisé par gavage sur animaux vigiles, 5 fois par semaine sur 28 jours (durée 30 sec). Afin de mimer des lésions de psoriasis, une crème (imiquimod) sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois après resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections = 30sec). La mesure de la réponse clinique (mesure de l'épaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le gavage répété 5j/7 sur plusieurs semaines pourrait induire une inflammation de la sphère ORL et de la partie haute de l'oesophage. Cette inflammation pourrait entraîner une perte de poids par défaut d'alimentation. Ce modèle engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gène pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront régulièrement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines, ce qui peut génerer un stress.
Devenir
Après anesthésie, tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récupérer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti-inflammatoires de P. distasonis
Remplacement
L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact d'un candidat médicament sur un modèle d'inflammation cutanée (psoriasis). Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe (3 dosages de P. distasonis et un groupe contrôle non traité) est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Trois dosages de P. distasonis seront testés, celle-ci n'ayant jamais été testée auparavant.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cas où des animaux perdraient du poids, des aliments réhydratés seraient disposés dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisées et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique, telle que l'inflammation cutanée et notamment le psoriasis, en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Discrimination de l’importance de l’immunité adaptative sur une association thérapeutique dans le cancer du côlon chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis plusieurs injections, pour comparer une association de deux traitements anticancéreux chez des souris pourvues ou privées d'un système immunitaire complet. Le porteur indique que la tumeur dans la patte peut réduire la mobilité et l'alimentation, entraîner une perte de poids et parfois des nécroses cutanées. Les retombées pour les patients sont renvoyées au "long terme", l'objectif immédiat restant de décrire la cascade immunitaire qui rend l'association efficace.
Objectifs
Notre intérêt pour l’immunothérapie a explosé ces dernières années grâce à l’apparition de nouveaux types de traitement. Ces traitements sont capables de permettre la mise en place d’une réponse de longue durée contre le cancer mais chez un nombre limité de patients. Un autre traitement appelé anti-VEGFR2 empêche la création de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur, limitant ainsi la croissance tumorale en la privant des nutriments et de l’oxygène apportés par le sang. Plusieurs études ont montré que l’anti VEGFR2 était également capable d’augmenter l’efficacité des traitements d’immunothérapies. Cependant, les mécanismes permettant d’expliquer cette amélioration restent encore à découvrir et plus particulièrement ceux impliquant les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi nous souhaiterions étudier l’efficacité de cette association de traitements dans des souris possédant ou non un système immunitaire complet. Le but de ce travail est de définir la cascade d’événements menant à l’efficacité antitumorale de l’association d’un anti-VEGFR2 avec une immunothérapie. Notre hypothèse est que l’efficacité de cette association thérapeutique repose sur une réponse immunitaire précise. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant un système immunitaire complet ou non afin de comparer l’importance de certaines cellules sur l’efficacité de l’association thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 1 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis au maximum à 1 injection IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute sous anesthésie et 3 injections IP de 1 minute, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre d’analyser les données
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales et les traitements seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.
Implication du canal potassique TREK1 dans les arythmies ventriculaires chez la souris mâle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
165 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent, sous anesthésie, des séances d'imagerie, une mesure de pression par une aiguille insérée jusque dans le ventricule droit, et une stimulation cardiaque destinée à déclencher des arythmies, une partie étant en plus placée trois semaines en atmosphère appauvrie en oxygène. Le porteur indique que cette stimulation peut provoquer une fibrillation ou une tachycardie ventriculaire et le décès de certains animaux, et que l'hypoxie entraîne une baisse d'activité et une perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que l'étude chez l'animal est "essentielle" et "ne peut être remplacée", un seul patient porteur du déficit ayant été identifié.
Objectifs
Les arythmies ventriculaires, correspondant à un défaut de contraction des ventricules, est la forme d’arythmie la plus mortelle. En effet, elle représente la moitié des décès d’origine cardiaque et environ 30 % des décès totaux en France. Ces arythmies résultent principalement d’un dysfonctionnement acquis ou inné de protéines exprimées dans les cellules du cœur appelées canaux ioniques. Des arythmies provenant du ventricule droit hypertrophié/dilaté sont décrites chez les patients souffrant d’hypertension pulmonaire et notamment dans le contexte de maladies hypoxémiantes qui peuvent être liées à la pollution. A travers ce projet, nous proposons d’étudier le rôle que pourrait jouer le canal ionique TREK1 dans ces arythmies, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel son expression a été invalidée. Sa sensibilité à l’étirement en fait une cible particulièrement attractive dans le ventricule droit étiré suite à une hypertension pulmonaire. Une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des canaux ioniques, ici TREK1, permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies ventriculaires et d’adopter des stratégies thérapeutiques plus efficaces dans le contexte des pathologies du ventricule droit.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction contractile, l’activité électrique cardiaque mais surtout dans le déclenchement d’arythmies au niveau du ventricule droit, région du cœur dans laquelle il est fortement exprimé. Ce projet est renforcé par une approche expérimentale multi-niveaux : -Celui de l’animal (ECG/IRM/stimulation transoesophagienne), -Celui de l’organe (cartographie optique), -Celui du tissu (histologie), -Celui de la cellule cardiaque, de la cellule musculaire lisse -Celui de la protéine/de l’ARNm Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du canal TREK1 et par conséquent de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) de déclenchement des arythmies ventriculaires qui peuvent conduire à la mort subite. Des stratégies thérapeutiques visant TREK1 pourraient alors s’avérer efficaces dans le traitement d’arythmies ventriculaires chez l’Homme.
Procédures
Les souris seront soumises à deux types d’interventions non invasives sous anesthésie générale puis une mesure invasive avant euthanasie: • Examens d’imagerie par IRM non invasif (environ 1h30) • Enregistrement ECG non invasif (environ 15 min) • Mesure de pression intraventriculaire droite invasive (20 min) Ces trois expérimentations seront réalisées sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal: 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 (3 semaines). Un autre groupe d’animaux sera aussi soumis à une intervention invasive sous anesthésie générale, la stimulation cardiaque transoesophagienne (environ 15 min). Cette intervention sera réalisée sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1. Les trois procédures seront réalisées une seule fois sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les anesthésies répétées lors des différentes procédures du projet peuvent induire des effets indésirables. Elles seront espacées au minimum de deux jours et une surveillance accrue aura lieu lors du réveil de l'animal (signes de désorientation, apathie). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux et liés aux différentes techniques utilisées sont principalement de classe modérée : • Imagerie à résonance magnétique, Electrocardiogramme et mesure de pression au niveau du ventricule droit: anesthésie générale pouvant entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. •Mesure de pression au niveau du ventricule droit : geste invasif avec une incision de la couche musculaire au niveau de l’abdomen en dessous du diaphragme et insertion d’une aiguille fine reliée à un capteur de pression à travers celui-ci jusque dans le ventricule droit. •L’hypertension pulmonaire n’induit pas de souffrances élevées chez l’homme mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. •Lors de l’exposition à l’hypoxie dans un caisson, un stress est généré aux souris se traduisant par une baisse d’activité et d’appétit dans les premiers jours (perte de poids de 5 à 10%) avant un retour à la normale. •L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation des ventricules pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin des procédures et le cœur sera prélevé pour réaliser la cartographie optique sur cœur isolé, les études histologiques ou les études électrophysiologiques et de biologie moléculaire sur cardiomyocytes isolés.
Remplacement
Il est connu que TREK1 est exprimé dans le cœur et impliqué dans une pathologie cardiaque, la tachycardie ventriculaire. A ce jour, un seul patient avec un déficit en TREK1 au niveau du cœur a été identifié empêchant l’étude du rôle de ce dernier dans l’activité électrique du cœur chez l’Homme. L’utilisation d’animaux sains et déficitaire en TREK1 est donc la seule façon de répondre à cette question et de reproduire la situation pathologique présente chez l’Homme. Cette étude chez l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Le caractère non invasif de l’électrocardiogramme et de l’imagerie à résonance magnétique permettra de réaliser d’autres expériences telles que les mesures de pression au niveau du ventricule droit mais aussi l’étude à l’échelle du cœur entier ou de la cellule cardiaque sur les mêmes animaux. Ce projet permettra d’évaluer avec fiabilité le rôle du canal TREK1 dans l’activité du cœur ainsi que dans les arythmies du ventricule droit. Dans ce projet, 160 souris sont prévues et réparties dans les 2 conditions suivantes (2 groupes avec n=80/groupe): - Normoxie: (milieu avec un taux d’oxygène normal) 40 Wild-type: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit 40 Knock-out: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit -Hypoxie: (milieu appauvti en oxygène). Le nombre d’animaux est répartit comme la condition Normoxie. A ça s’ajoute 5 souris supplémentaires utilisées pour la formation d’un expérimentateur à la stimulation transoesophagienne au début de l’étude. Concernant la partie sur l’animal entier, 5 échecs par groupe sont considérés pour chaque protocole (imagerie à résonance magnétique, électrocardiogramme, stimulation transoesophagienne et pression ventricule droit) pour les motifs suivants : - Arrêt de l’examen pour le bien-être animal - Valeurs aberrantes des données collectées - Mort de l’animal. Concernant la partie sur cœur entier, les animaux sont divisés en 3 : imagerie sur cœur entier (15 animaux par groupe), mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées (50 animaux par groupe) et biologie moléculaire/histologie (15 animaux par groupe). De manière similaire à la partie sur l’ animal entier, des échecs (3 pour l’imagerie optique et la biologie moléculaire/histologie et 5 pour la mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées) sont considérés pour les motifs suivants : - Ischémie du cœur isolé - Mort des cellules cardiaques après isolement - Valeurs aberrantes des données collectées. Une analyse descriptive (moyenne, percentile, écart standard de la moyenne) sera effectuée ainsi que la vérification que chaque groupe suit la loi normale (test de Shapiro-Wilk). Dans le cas attendu que les données collectées ne suivent pas la loi normale (échantillon de n
Raffinement
Les mesures de RAFFINEMENT sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adapté). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. L’atteinte d’un point limite entraîne une ou plusieurs des actions suivantes : • Augmentation des fréquences d’observation des animaux : mise en place d’un suivi deux fois par jour (visites, signes cliniques relevés). • En cas de perte de poids, du gel diet riche en énergie ou des pellets humides seront mis à disposition. Si l’animal est hébergé en groupe, il sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler son alimentation et son hydratation. • En cas de perte de poids continue (entre 10% et 20%), une surveillance accrue sera effectuée et les soins renforcés. En cas de perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal enregistré pour cet animal et pour une durée de 48 heures, l’animal sera mis à mort immédiatement sur décision du responsable du projet et/ou du vétérinaire désigné. • En cas de réduction de la mobilité, des pellets humides seront mis à disposition. • En cas de plaies, des soins seront administrés (désinfection avec un antiseptique, nettoyage de la plaie). • En cas de persistance du pli cutané, une réhydratation sera mise en place (injection intraperitonéale de NaCl 0.9% tiède, gel diet). L’animal sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler sa réhydratation. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum, une décision d’interruption d’expérimentation sera prise.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces classiquement utilisées pour étudier les effets de la suppression d’un gène d’intérêt. Dans ce projet, il s’agit d’un modèle de souris n’exprimant plus le canal ionique TREK1 et qui a l’avantage d’avoir été déjà utilisé à des fins de recherche scientifique. L’activité électrique cardiaque variant en post-natal et jusqu’à l’adolescence, nous travaillerons sur des souris adultes de 15 semaines. Ce modèle de rongeurs va permettre de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction du cœur mais également dans le dysfonctionnement électrique et mécanique du cœur par ECG, IRM et stimulation transoesophagienne (S.T). Les résultats obtenus dans ce projet pourront être transposés chez l’Homme et ainsi permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant directement TREK1.
Réaction inflammatoire lors de la toxoplasmose oculaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection dans chaque œil pour une infection à Toxoplasma gondii, avec un suivi par fond d'œil répété cinq fois sur quatorze jours, pour étudier la réaction inflammatoire de la rétine. Le porteur indique qu'avec les souches virulentes l'inflammation oculaire s'aggrave au-delà du septième jour, et précise ne pas administrer d'analgésique de crainte de fausser la réponse immunitaire. Sur le remplacement, il affirme que seuls des modèles vivants permettent d'étudier les interactions entre le parasite et l'organisme hôte, et retient la souris comme espèce la mieux caractérisée sur le plan immunologique.
Objectifs
L’infection au parasite protozoaire Toxoplasma gondii est la première cause infectieuse d’inflammation rétinienne chez l’Homme. Or, les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont mal connus. Ceci est avant tout dû à la difficulté d’accès aux yeux humains. Ces contraintes rendent difficile de trouver un consensus sur le traitement. Notre recherche vise à trouver des cibles spécifiques pour l’intervention médicale. Pour des raisons évidentes, le modèle humain ne peut pas être étudié en grand détail, même si nous avons réussi à tirer des conclusions importantes de l’analyse des médiateurs inflammatoires dans l’humeur aqueuse des patients. Pour les questions plus détaillées, nous avons établi un modèle de souris, sur lequel nous avons déjà démontré le rôle de plusieurs médiateurs inflammatoires. Nous nous posons maintenant la question comment cette inflammation est contrôlée dans la rétine. L’œil est considéré comme organe où les réactions inflammatoires pourraient provoquer des dommages irréversibles et qui sont donc bien contrôlées. Or, le mécanisme précis de ce contrôle est mal étudié, surtout lors d’une infection toxoplasmique. Les candidats classiques d’une telle réaction anti inflammatoire, sont des récepteurs et d’autres facteurs immunosuppressives. Ces facteurs sont effectivement exprimés ou sécrétés par des cellules de la barrière oculaire. Ils feront donc partie de notre étude. En plus, nous venons de publier une étude in vitro qui décrit pour la première fois les rôles des interférons de type I et III. Comme il n’avait aucune étude sur ces interférons lors d’une toxoplasmose oculaire, l’étude de leurs fonctions sera au centre de nos expériences. Enfin, une infection toxoplasmique peut avoir des conséquences cliniques très variées selon la souche de T. gondii infectante. Cette différence est aussi observée au niveau oculaire. Les raisons physiopathologiques de ces différences n’ont pas été étudiées dans des modèles animaux. Nous envisageons donc de comparer les infections avec quelques souches isolées des patients et ayant provoquées des manifestations cliniques différentes et bien caractérisées.
Bénéfices attendus
Malgré l’importance clinique de la toxoplasmose oculaire, les mécanismes immunologiques de cette pathologie ne sont que peu connus, malgré quelques progrès ces dernières années. Nous regardons spécifiquement la réaction anti-inflammatoire dans l’œil lors de l’infection. La question derrière est : Comment cet organe particulièrement sensible peut-il se défendre contre une infection, sans trop de destruction par une inflammation trop prononcée ? Les retombés et les bénéfices attendus du projet sont multiples. Nous avons récemment publié un article basé sur des expériences in vitro sur le rôle des interférons dans les mécanismes immunologiques de la toxoplasmose oculaire. Ce projet va donc nous permettre de confirmer, de renforcer et de compléter nos résultats obtenus in vitro. Les résultats ainsi obtenus seront ensuite partagés avec la communauté scientifique par la publication d’un article dans un journal international indexé et revue par des paires. Le projet permettra donc de faire évoluer la connaissance générale dans différent domaines : La toxoplasmose oculaire, mais également plus largement de la réponse immunitaire oculaire. D’autres retombés à plus long terme sont également à prévoir. En effet, une meilleure compréhension des mécanismes de réponse immunitaires peut servir à améliorer ou à mettre en place des nouvelles stratégies diagnostique et thérapeutique. L’objectif à long terme, nécessitant une compréhension très détaillée de l’ensemble des mécanismes impliqués est d’avoir un traitement personnalisé et adapté au besoin du patient. Cela nécessite notamment une bonne compréhension des marqueurs souche-dépendants de la toxoplasmose oculaire, étudiés au cours de ce projet. Ensuite, une connaissance approfondie des interactions entre le parasite et l’expression de certains facteurs immunomodulateurs est également très intéressante. En effet, de nombreuses thérapies visant les check-points immunitaires sont déjà sur le marché traitant une multitude d’atteintes allant du cancer ainsi que certaines immuno-pathologies.
Procédures
Toutes les souris dans ce projet sont anesthésiées (générale) pour une durée de 5 minutes. Durant ce temps, elles reçoivent une injection intraoculaire dans chaque œil. Ensuite, une petite partie de souris sont de nouveau soumises à une anesthésie générale, pour une durée de 3 minutes. Durant cette période, les souris reçoivent une injection de traceurs fluorescents. Finalement, en utilisant une technique d’analyse non invasive, certaines souris sont anesthésiées pour une durée de 5 minutes durant laquelle un fond d’œil est réalisé. Cette procédure est réalisée 5 fois sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Les différentes nuisances potentielles pour les animaux sont : L’injection intra-oculaire n’est pas spécifiquement douloureuse, en effet, cette procédure est effectuée sans anesthésie générale chez l’homme. La manipulation de la souris est une source de stress. - L’infection intraoculaire d’une souche toxoplasmique non-virulente Me49. Par expérience, nous savons que le pic de l’inflammation est à 7 jours post-injection, ensuite elle rediminue progressivement pour atteindre un retour à la normale aux alentours du jour 14 post-injection. Sauf cas rare, au pics de l’inflammation, aucune dégradation de l’état générale de la souris n’est observable. Les souris gardent un comportement normal, sont curieuses et explorent leur environnement. Les poils ne sont pas non plus hérissés. Une légère augmentation de la sécrétion lacrymale ainsi que des foyers infectieux de la rétine sont observation en histologie. Ces foyers infectieux ne sont pas douloureux (asymptomatique chez l’Homme) mais peuvent causer une réduction de l’acuité visuelle. - L’infection intraoculaire avec des souches toxoplasmiques virulentes. La principale différence est la cinétique de l’inflammation. Pour la souche non-virulente l’inflammation de la rétine diminue à partir de jour 7. Pour les souches virulentes, l’inflammation devient de plus en plus importante après jour 7.
Devenir
L'étude se termine par la mise à mort des animaux pour prélèvements oculaires.
Remplacement
Nous utilisons en parallèle des modèles in vitro afin d’identifier les mécanismes au niveau cellulaire. Par contre, comme la rétine est un organe complexe, seulement des modèles in vivo peuvent identifier les interactions entre le parasite et l’organisme hôte, d’autant plus que nous étudions la réponse immunitaire. Nous veillons à faire un maximum d’expériences et de mise à point expérimentale sur nos modèles in vitro et d’utiliser le modèle animal pour des études d’interactions au niveau physiologique. Dans l'autre sens, les connaissances obtenues dans notre modèle animal permet de plus en plus d’expériences ciblées in vitro.
Réduction
Nous utilisons, si possible, des techniques multiplexes, pour détecter plusieurs paramètres dans un même échantillon. Nous nous basons sur nos précédentes études chez la souris pour définir nos effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’utilisation des techniques non-invasives, comme le fonds d’œil, nous permet de suivre le cours de l’infection sur une même souris et donc de minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera assuré par l’enrichissement de l’environnement (lanières de carton, coton, tunnels, dôme) et la formation des groupes sociaux. Le protocole d’infection, avec inoculation d’une faible dose de parasites, et la durée limitée des expériences, résultera, par expérience, en une infection peu ou pas douloureuse pour les souris. Cette injection se fait sous anesthésie générale, ce qui diminue très grandement le stresse induit par la procédure. L’injection n’étant pas douloureuse et les foyers infectieux de la rétine ne provoquant pas de douleur, l’utilisation d’analgésique n’est pas nécessaire ici. Chez l’homme c’est une procédure réalisée sous anesthésie locale sans prescription d’analgésique. De plus, l’utilisation d’analgésique pourrait influencer la réaction immunologique, rendant les données non-interprétable. Enfin, pour les procédures de neutralisation de cytokines, l’injection intravitréenne des parasites et des anticorps neutralisants se fait au même temps. Nous avons inclus dans le projet l’utilisation d’une technique de fond d’œil non-invasive afin de faire un suivi de l’infection au cours du temps sur une même souris. Les résultats ainsi obtenue pourrons être utilisé pour perfectionner notre modèle d’infection actuel. Néanmoins, cette procédure sera faite en collaboration avec un spécialiste des pathologies oculaires chez les rongeurs qui apporte son matériel. Nous ne pouvons donc pas employer cette technique pour les autres expériences. Néanmoins, nous avons un protocole de point limite que nous utilisons et perfectionnons depuis longtemps au sein du laboratoire pour diverse projets très similaires. Ce protocole détaillé dans une section dédiée permet une détection précoce de la souffrance chez la souris dans le cadre de nos procédure expérimentale. Pour sa mise en œuvre nous sommes notamment assistés et conseillés par un ophtalmologue faisant partie de notre équipe.
Choix des espèces
La souris est l'animal le mieux caractérisé au niveau immunologique, ce qui facilite l'interprétation des résultats. En plus, l'immense majorité d'études sur la toxoplasmose dans la littérature ont été fait chez la souris, où les cinétiques d’infection sont les mieux connues. Tout cela fait de la souris l'espèce la plus propice de donner des résultats significatifs. Des animaux adultes de 6 à 12 semaines d’âge sont utilisés, pour avoir des souris avec un système immunitaire développé et des groupes homogènes
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 01
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 01 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Caractérisation des circuits neuronaux impliqués dans le signal « glucose-portal » et ses effets sur le métabolisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 64 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 16 un niveau modéré. Elles subissent une injection cérébrale par chirurgie stéréotaxique pour inactiver un noyau, et pour la plupart la pose d'un cathéter dans la veine porte par une seconde chirurgie, avec mesures de glycémie et prélèvements avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si ce noyau cérébral est "nécessaire" à l'effet coupe-faim du glucose produit par l'intestin. Le porteur indique utiliser des animaux de réforme pour la mise au point et affirme que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être remplacée par des cellules ou des organoïdes.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de glucose par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, nos objectifs sont de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables aux effets bénéfiques de la production intestinale de glucose. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, ces mécanismes pourraient représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection (5 secondes) d'un composé destiné à inactiver des neurones spécifiques, suivie de deux mesures de glycémie par prélèvement de sang à la queue (3 secondes chacune) et deux mesures de poids et de prise alimentaire sur 24h, puis 15 jours après, une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une injection intrapéritonéale suivie d’une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (64 souris).
Impact sur les animaux
- L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. - Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-dabiète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. De plus, certaines interventions seront mises en œuvre sur les animaux d'un même lot de façon à ne pas recourir à des animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 16 souris par groupe. De plus, différents tissus (foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux. Au total, ce projet nécessitera au maximum 80 souris mâles.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 02
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 02 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Evaluation des effets de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle et sur le comportement impulsif chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2400
4 800 animaux, 2 400 souris et 2 400 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, puis sont soumis à un test d'évitement passif où ils subissent jusqu'à cinq stimulus aversifs, un stimulus douloureux servant à créer une mémoire de peur. Le porteur teste des molécules ciblant le système nerveux central pour la mémoire et l'impulsivité, et précise que les animaux ne seront pas réutilisés pour ne pas biaiser les résultats. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour un comportement "aussi complexe et intégré que la mémoire".
Objectifs
La mémoire émotionnelle correspond à la mémoire d'un évènement ayant suscité une émotion. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de cette mémoire émotionnelle (schizophrénie, alzheimer, syndrome de stress post traumatique) et il est nécessaire de passer par des modèles animaux afin d'évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques. Chez le rongeur c'est la mémoire de peur qui est classiquement évaluée comme modèle de mémoire émotionnelle humaine, c'est une émotion très conservée entre les espèces car indispensable à la survie. Cette mémoire émotionnelle s'acquière très facilement et souvent en un seul essai chez le rongeur. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouveaux composés ayant pour cible le système nerveux central et des pathologies associées. C'est pourquoi l'objectif de ce projet va être d'évaluer les effets de nouvelles molécules et de molécules de référence sur des animaux dans un dispositif d'évitement passif qui permet de tester la mémoire basée sur l'association entre un environnement et un stimulus aversif. Ce dispositif va permettre également d'évaluer l'impulsivité excessive que peuvent présenter certains modèles animaux. Ainsi le second objectif de ce projet sera de mesurer les effets de nouveaux composés ciblant le système nerveux central sur une impulsivité exacerbée que l'on retrouve dans des pathologies du type trouble de l'hyperactivité et déficit de l'attention.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'identifier et de caractériser de nouvelles molécules afin d'apporter les données précliniques nécessaires avant de passer au stade de développement clinique. A moyen - long terme ces données scientifiques permettront de développer de nouveaux candidats médicaments permettant de traiter certaines pathologies à l'origine de déficits de mémoire (schizophrénie par exemple) ou de troubles de l'impulsivité (syndrome d'hyperactivité et de déficit de l'attention par exemple).
Procédures
Les animaux vont recevoir une administration aigüe par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire de molécules à tester. Lors des tests de comportement les animaux pourront être exposés au plus à 5 stimulus aversifs d'une durée maximale de 3 secondes.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -le stress lié à la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur sur le site de l'injection intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. -la douleur passagère liée aux stimulus aversifs de courte durée (1-3s) et répétés maximum 5 fois.
Devenir
Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets et seront mis à mort à l'issue des 2 procédures. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanisme de mémoire et/ou d'impulsivité, toute réutilisation des animaux dans d'autres études comportementales pourrait être biaisée par les tests précédemment réalisés.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle à court ou long terme ou sur l'impulsivité, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe et intégré que la mémoire mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire afin d'obtenir un traitement statistique des résultats satisfaisant. Ces analyses statistiques, réalisées à l'aide d'un logiciel spécifique (Graphpad Prism) nous permettront de nous assurer de la réalité et de la reproductibilité d'éventuelles différences observées entre plusieurs groupe ayant reçu différentes molécules à tester. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un seul groupe recevant une molécule de référence.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 3 ou 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, igloo, bandes de papier pour nidification, briques de bois à ronger....) et avec accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si plus de trois critères ne sont pas satisfaits sans possibilité d'action correctrice, alors l'animal est exclu du protocole et mis à mort si nécessaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisés et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire émotionnelle, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d'avoir des effectifs suffisants permettant d'obtenir des résultats statistique robustes : conditions d'hébergements en animalerie raisonnables, quantités limités de nouveaux composés à synthétiser par la chimie. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Eventuellement, des animaux plus âgés pourront être utilisés pour tester l'effet de nouveaux composés sur le vieillissement et le déclin de la mémoire associé.
GastroNano-2 : Traitement des métastases péritonéales d’origine gastrique (VX2) par chimiothérapie pédiculée et pressurisée par aérosol sur modèle de lapins
- Recherche appliquée
- Cancers
58 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur greffe des tumeurs dans le péritoine par chirurgie, puis ils reçoivent trois séries de chimiothérapie pressurisée par aérosol sous anesthésie, avant d'être tués pour l'examen des organes. Le porteur décrit une douleur modérée possible, une anorexie, une perte de poids et d'éventuels troubles respiratoires si des métastases pulmonaires apparaissent. Il présente ce test comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain et affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la réponse d'un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’implication de la réponse aux traitements par nanomédicaments de platine/doxorubicine administrés via PIPAC (Chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol) dans un modèle animal immunocompétent. Cette approche validera l’utilisation de l’approche chimiothérapeutique pour traiter les métastases péritonéales d'origine gastrique. L’évolution de la tumeur primaire et des métastases péritonéales (PM) sera étudiée dans un modèle animal lapin. Des lapins présentant des tumeurs (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) implantées à différents sites abdominaux (péritoine pariétal +/- viscéral +- viscères) vont être traités par chimiothérapie pressurisée par voie coelioscopique (groupe test) versus contrôle (injection de sérum physiologique).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement anticancéreux mini-invasif dans un essai comparatif des différents drogues/formulations chimio-thérapeutiques. Il est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacité de traitements chimiothérapeutiques sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.
Procédures
Procédure 1 : les animaux sont soumis à une unique intervention (injection percutanée du muscle) de 5 min environ. Procédure 2 : les animaux sont soumis une unique intervention chirurgicale pour l’injection péritonéale des cellules tumorales de 30 min environ, ainsi qu’un contrôle de la tumeur par imagerie sur animal vigile (échographie et ou scanner), puis les animaux ont 3 séries de traitement par laparoscopie sous anesthésie générale (procédure d’une heure).
Impact sur les animaux
Il est possible que la maladie engendrée (MP) cause une douleur modérée par la suite aux animaux. L’expérience ne se prolongera pas au-delà de 5 semaines après la greffe des tumeurs ce qui limite l'étendue de la maladie et l'effondrement des constantes de l'animal non traité (fonction digestive par exemple). Une attention particulière est portée sur le comportement alimentaire : anorexie, perte de poids supérieure à 20%, sur l'altération de l’apparence physique et celle du comportement (repli dans un coin, prostration, …). Une prise de poids est néanmoins possible en raison de la croissance des MP et de la possible accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé et l'aspect des selles sera surveillé. Des troubles respiratoires peuvent apparaitre si des métastases pulmonaires se développent au cours de l’expérimentation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les organes traités (tumeur, foie, muscle) et pour évaluer par examen nécropsique les éventuelles lésions sur les organes à distance. Les paramètres histologiques évalués sur les prélèvements nécropsiques concernent les réactions tissulaires associées au traitement (nécrose tumorale ou du tissu saine, œdème, fibrose, inflammation…).
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase 3D ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture 2D) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le modèle lapin de carcinose péritonéale présenté permet de mimer le phénomène pathologique et la procédure de traitement observé chez l’Homme.
Réduction
Une implantation de 2 tumeurs par animal donneur sera effectuée pour réduire le nombre total de donneurs. Des études de faisabilité ont été effectuées afin de diminuer le risque d’échec et limiter le nombre total d’animaux à utiliser. Ainsi nous estimons que 5 lapins par groupe permettront d’avoir des résultats qui permettent d’apporter des conclusions. Néanmoins, si les résultats ne sont pas concluants du fait du nombre faible de lapins par groupe, une nouvelle expérimentation pourra être réalisée (permettant de doubler le nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, présence systématique d’enrichissement, vidange et nettoyage régulier du bac de déjection, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur par un système de scoring et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques est mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une attention particulière sera apportée au bac recueillant les crottes et l’urine pour surveiller indirectement l’état l'hydratation et les troubles urinaires et les éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, analgésique per opératoire). Lors de précédentes études, les points limites n’ont pas été atteints et aucun signe clinique d’une occlusion intestinale ou pylorique n’a été observé. Les animaux ont gardé un appétit et un transit intestinal normaux, aucun signe de douleur n’a été signalé. Les lésions péritonéales étaient des tumeurs en évolution localisées à l’endroit de l’implantation, sans envahissement métastatique incontrôlé du péritoine ou des organes de la cavité abdominales. D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les 2-3 premiers jours suivant les procédures chirurgicales.
Choix des espèces
L’utilisation de cellules tumorales chez le lapin comme modèle de tumeur a été développée dans les années 50. Le modèle présente l’avantage d’être reproductible, facilement implantable, à croissance rapide et transplantable dans de nombreux organes. De plus, contrairement aux rongeurs, la taille du lapin permet l’utilisation des mêmes appareillages que chez l’homme. Il n’existe pas de modèle de tumeur reproductible chez le gros animal (cochon, mouton, chèvre). La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans la plupart des procédures cliniques de type PIPAC. Le modèle de tumeur chez le lapin est aujourd’hui largement utilisé pour l’évaluation des thérapies chirurgicales mini-invasives et de radiologie interventionnelle.
Etude de pharmacocinétique, pharmacodynamie chez le chat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Jusqu'à 16 prises de sang par semaine, dont une douzaine en 24 heures suivies d'au moins une semaine de récupération, des administrations par voie intraveineuse, orale, intramusculaire, sous-cutanée ou sur la peau, et des recueils d'urine par sonde ou par ponction de la vessie : 80 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué, tous sont gardés en vie et la déclaration les compte comme réutilisés. Le projet mesure comment leur organisme absorbe, distribue et élimine des principes actifs destinés à de futurs médicaments vétérinaires, et le porteur cite parmi les effets le stress de la contention, l'inconfort et la douleur d'une ponction de vessie. Le texte ne nomme aucun de ces principes actifs, ne dit pas vers quels projets les chats repartiront, et indique qu'il n'y a "pas d'approche statistique prévue" pour fixer leur nombre.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration est étudié chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espece cible).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est necessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations (intraveineuse, orale, intramusculaire, souscutannée ou topique) . Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 12 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire.Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ou par cystocentèse ( contention manuelle légère) Durée de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Toute contention peut engendrer un stress, un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entrainer un stress pour la contention , un inconfort mais également de la douleur (cas d'un prélèvement d'urine par cystocentèse par exemple).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.
Réduction
80 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. Cela représente en moyenne 16 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.
Raffinement
Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.
Choix des espèces
Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Jeune adulte. Stade avec un système immunitaire, métabolique mature
Etude de l’hypoxie chez un modèle de souris mutante
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur et leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix d'entre elles sont privées du gène ELK3 et dix sont des témoins sauvages, et toutes passent deux semaines dans un air appauvri à 10 % d'oxygène, ainsi que trois prises de sang à deux ou trois semaines d'intervalle et une échographie du cœur d'une vingtaine de minutes, sous anesthésie gazeuse. Le porteur dit que l'hypoxie peut entraîner "un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées", et cherche à savoir si ELK3 intervient dans la réponse au manque d'oxygène, pour traiter à terme des pathologies liées à l'hypoxie. Le prélèvement sanguin est limité à 25 % du volume sanguin total de la souris, compensé par l'injection sous la peau d'un volume équivalent de solution saline, sans que le texte précise si ce plafond vaut pour chacune des trois prises.
Objectifs
Nos cellules utilisent l'oxygène pour générer de l'énergie efficacement et, lorsqu'elles manquent soudainement d'oxygène, en cas d'hypoxie, des dommages irréversibles et rapides peuvent survenir aux organes. L'hypoxie chronique a également des conséquences, plus particulièrement dans les tumeurs, qui peuvent contribuer à des métastases et au décès. Il existe des mécanismes qui permettent aux cellules de s'adapter à l'hypoxie, dont l'élément-clé est la voie sensible à l'oxygène qui implique le facteur de transcription HIF-1. Ce mécanisme de base est une découverte fondamentale et un élément central dans la compréhension de la détection de l'oxygène dans le corps. Plusieurs composantes supplémentaires ont été découvertes plus récemment, notamment des modificateurs de la structure de l'ADN, des régulateurs des signaux de dégradation, et des facteurs impliqués dans la détection aiguë de l'oxygène. Cependant, il reste de nombreuses autres composantes qui interviennent dans le traitement des conséquences de l’hypoxie et qui restent à étudier, dont le facteur de transcription ELK3. ELK3 intervient dans des voies de signalisation conduisant à la transcription de l'ADN, et joue un rôle dans la migration cellulaire, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (l'angiogenèse) et l'intégrité vasculaire. De plus, il a été démontré qu'il joue un rôle dans la régulation des gènes sensibles à l'hypoxie, la protéine ELK3 étant elle-même dégradée dans des conditions de faible teneur en oxygène. La plupart des mécanismes de signalisation induits par l'hypoxie impliquant les deux protéines ELK3 et HIF-1 sont distincts, mais liés. On s'attend ainsi à ce que ELK3, tout comme HIF-1, soit impliqué dans l'angiogenèse, des études in vitro en culture cellulaire ayant notamment montré qu'ELK3 est préférentiellement exprimé dans les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins, mais aussi dans le mélanome. Cependant, il reste à élucider si ELK3 est impliqué dans la réponse physiologique à l'hypoxie. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier les conséquences de la perte totale d’ELK3 dans le modèle souris, dans des conditions d’hypoxie, sur la fonction cardio-vasculaire et le remodelage vasculaire pulmonaire.
Bénéfices attendus
L'hypoxie joue un rôle important dans les causes de mortalité, notamment le cancer, l'ischémie myocardique et les maladies métaboliques, du cœur et des reins, ainsi que dans les maladies de la reproduction telles que la prééclampsie et l'endométriose. Il existe de nombreuses preuves provenant de systèmes in vitro selon lesquelles un ou des facteur(s) de transcription, joue(nt) un rôle essentiel dans la réponse hypoxique. Pour utiliser ces connaissances pour comprendre et finalement traiter les pathologies liées à l’hypoxie, nous devons étudier les rôles de ces facteurs dans un modèle animal. Les expériences prévues devraient apporter une preuve convaincante de son importance physiologique dans l’hypoxie, et nous permettre d’exploiter notre boîte à outils, notamment les molécules que nous avons développées ciblant l'un de ces facteurs de transcription, pour traiter à terme les pathologies associées à l’hypoxie.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins, à 2-3 semaines d'intervalle et à une échographie (durée environ 20 minutes). Ils seront soumis par ailleurs à des conditions hypoxiques (10% oxygène) pendant 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, ainsi que l'échographie pour explorer la fonction cardiaque peuvent entrainer un léger stress ou une douleur chez les animaux. Ils seront effectués sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les souris seront exposées à des conditions hypoxiques pouvant également entrainer un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées.
Devenir
A la fin de la procedure, toutes les souris seront mises à mort pour réaliser une nécropsie et prélever des organes (coeur, poumons) en vue des analyses post-mortem
Remplacement
Le rôle de la protéine d'intérêt ELK3 dans le processus d'hypoxie a été étudié par des approches cellulaires dans notre laboratoire, mais pour analyser les effets globaux de cette protéine sur le muscle cardiaque, les vaisseaux sanguins et les poumons, le modèle souris nous semble nécessaire pour nous rapprocher au mieux de la pathologie humaine.
Réduction
Pour chacun de nos tests, nous comparerons le groupe contrôle sauvage et le groupe mutant Homozygotes ELK3. Approche statistique: grâce aux études précédentes et les données collectées sur les animaux contrôles sur plusieurs années, et en tenant compte des tests réalisés au cours de cette étude, nous savons que le nombre de 10 animaux par génotype est suffisant pour détecter des phénotypes spécifiques s’ils existent.
Raffinement
Durant toute l'étude, y compris en cages d'hypoxie, les souris sont hébergées à raison de 3 souris par cage afin d'éviter le stress lié à l'isolement et de maintenir les interactions sociales. Afin de limiter la gêne qui pourrait survenir suite à la baisse de la concentration d’oxygène celle-ci se fera progressivement (en 3 heures). L’exploration cardiaque est indolore, mais une anesthésie sera mise en oeuvre chez la souris afin d'éviter le stress lié à la manipulation, en particulier lors de l'épilation et de l'échographie. L'anesthésie facilitera en outre l'exploration en limitant les mouvements de l'animal. En cas de ralentissement du rythme cardiaque sévère lié à l'anesthésie, la procédure sera arrêtée et les animaux surveillés jusqu'au réveil dans les minutes suivant la procédure Si les animaux présentent une faiblesse trop marquée suite à l'anesthésie, une euthanasie pourra être pratiquée. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sera limité à un volume de 25% du volume sanguin total de l'animal. Pour compenser la perte de volémie, nous injecterons par voie sous-cutanée un volume équivalent de solution saline (NaCl 0.9% chauffé à 37°C) après le prélèvement sanguin.
Choix des espèces
La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette espèce ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt specifiquement. Les souris auront 10-12 semaines environ (stade adulte), où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures.
Effet de l’élévation de température lors de la fièvre sur la réponse du système immunitaire dépendante des anticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans le ventre sous anesthésie, puis elles reçoivent un vaccin, parfois un rappel, six injections d'une molécule faisant baisser la température et des prises de sang répétées, la mise à mort se faisant par prélèvement sanguin important. Le projet mesure l'effet de la fièvre sur la production d'anticorps. Le porteur décrit une douleur possible, une fièvre de un à deux degrés et une perte de poids, et affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier cette réponse chez la souris.
Objectifs
La température du corps des mammifères dont l’homme est régulée, mais peut augmenter notamment dans tout le corps lors de la fièvre induite par une vaccination ou un microbe. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate). La réponse humorale est également caractérisée par sa capacité à mettre en place une mémoire contre la cible vaccinale ou le microbe, qui perdure plusieurs mois à plusieurs années, et dont le maintien nécessite l’interaction avec différents types cellulaires dans différents organes (rate, moelle osseuse). Le développement de la réponse humorale et la mémoire immunologique sont donc difficiles à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet de l’augmentation de la température lors de la fièvre sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Dans un premier temps, nous déterminerons la dose de molécule qui permet de diminuer la température des souris lors d’une fièvre induite par vaccination, sans diminuer l’inflammation. Dans un second temps, nous étudierons l’effet de la baisse de la température induite par cette molécule sur la réponse humorale.
Bénéfices attendus
Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de la température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, cela permettra d’établir si la prise de médicaments faisant baisser la fièvre suite à une vaccination n’empêche pas la mise en place d’une réponse humorale efficace et durable.
Procédures
Les souris seront implantées avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Une semaine plus tard, les souris recevront une injection par voie sous-cutanée de vaccin ou d'une solution contrôle (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris recevront en plus deux mois plus tard un rappel vaccinal au même endroit (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Pour faire baisser la fièvre, les souris recevront des injections sous-cutanées de molécules abaissant leur température (6 injections dans les 2 jours suivant l’immunisation). Du sang sera prélevé à différents temps (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes).
Impact sur les animaux
La vaccination peut induire une douleur au niveau du jarret postérieur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire, associée à une élévation de la température (fièvre) de 1 à 2°C pendant 2 jours. L'implantation des sondes thermiques et les injections de molécules faisant baisser la fièvre peuvent induite une douleur. Ces injections et implantations peuvent également conduire à des saignements ou des infections. La répétition des prélèvements sanguins est une source de stress.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire et de l'inflammation.
Remplacement
Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocyes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo et de devenir des cellules mémoires capables de survivre pendant plusieurs mois. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris.
Réduction
Le nombre de souris a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
L’implantation des sondes thermiques ainsi que la vaccination se fait sous anesthésie générale. Les animaux sont observés tous les jours, et un suivi clinique des souris est réalisé suite aux différentes interventions. Dans ce but, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris, suivant différents critère comme la perte de poids et le comportement des souris. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie sauf la première semaine (étude de la fièvre), soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. L'euthanasie est réalisée par une prélèvement de sang important sous anesthésie générale et traitement analgésique. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson).
Choix des espèces
La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule sa température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte).