Procédures modérées

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques par cinq injections de streptozotocine, elles reçoivent des îlots humains encapsulés par chirurgie abdominale, puis sont suivies trois mois avec prises de sang par section de la queue et tests de tolérance au glucose avant une seconde chirurgie et la mise à mort. Le porteur liste parmi les effets une perte de poids, une hyperglycémie et une possible nécrose de l'extrémité de la queue. Il juge le recours à l'animal "indispensable" et choisit la souris pour consommer moins d'îlots humains, "tissu rare", que le rat.

Objectifs

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tenté de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de souris rendues diabétiques par injection intra-péritonéale de streptozotocine. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.

Procédures

L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par 1 injection par jour sur 5 jours. La durée de l’intervention (et la contention) durera quelques secondes pour chaque injection. 24 h après la dernière injection, une mesure de glycémie sera effectuée à l’aide d’un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier si l’animal est bien diabétique (durée de l’acte quelques secondes). Chez les souris devenus diabétiques, 2 modules d’encapsulation seront implantés dans l’abdomen. Ceci nécessitera une incision de l’abdomen de 1 cm. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée et durera environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie au maximum pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, tous les 15 jours la prise de poids (quelques secondes), la glycémie capillaire (lecteur de glycémie, quelques secondes) seront mesurées, une prise de sang par incision de l’extrémité de la queue sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (durée 5 minutes par souris) et un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l'eau ad libitum). Une mesure de la glycémie sera effectuée à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose (durée par mesure de quelque seconde). 84 jours après implantation, les implants seront retirés (même méthodologie dispositions prises et durée d’intervention que pour l’implantation). Enfin, 7 jours plus tard les animaux seront mis à mort pour prélèvement final des organes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids en lien avec l’induction du diabète - Douleurs post-opératoires faisant suite à la chirurgie réalisée pour la mise en place des hydrogels (Laparotomie) - Risque d’infection suite aux implantations des hydrogels - Stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques -Hémorragie post section de la queue - Périodes de mise à jeun.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours de la réalisation de nombreuses études métaboliques réalisées sur animaux rendus diabétiques par injection de STZ. Cette étude nécessitera 360 souris. Enfin, la succession des interventions sur les mêmes animaux permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à nos hypothèses.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages collectives ventilées et enrichies. En cas de procédure invasive une anesthésie et une analgésie adaptées seront mise en place. De plus, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux demeurant diabétique recevront une insulinothérapie. Les souris immunodéficientes seront maintenues et manipulées dans des conditions permettant de garantir leur état de santé.

Choix des espèces

Pour répondre à nos objectifs, nous avons choisi le modèle de la souris pour recevoir les îlots encapsulés car celui-ci a l’avantage d’avoir des caractéristiques physiologiques proches de l’Homme. De plus, dans un implant nous souhaitons encapsuler 10000 îlots/kg de poids corporel (quantité utilisée dans le cadre de la transplantation d’îlots chez l’homme nécessaire pour rétablir un équilibre glycémique). Ainsi, nous utiliserons moins d’îlots humain (tissus rare) que si nous utilisions le modèle du rat qui est 10 fois plus gros que la souris. La souche C57BL/6 nous permettra d’évaluer la capacité immuno protectrice de nos hydrogels sur les îlots pancréatiques humains. La souris de souche NSG nous permettra de contrôler la survie et la fonction de nos îlots humains encapsulés et implantés dans un environnement immunodéficient (Contrôle). Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle et possédant un système immunitaire mature.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies, l'une cérébrale l'autre sur la moelle épinière, une stimulation par lumière, un entraînement comportemental dont la nature n'est pas précisée et une mesure du retrait de la patte par un faisceau infrarouge pouvant provoquer une rougeur. Le projet étudie la transmission de la douleur dans un modèle de la maladie de Parkinson. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces réseaux nerveux et que les études in vivo sont "indispensables".

Objectifs

En plus du système dopaminergique, les autres systèmes monoaminergiques notamment sérotonergiques sont aussi affectés dans la maladie de parkinson. La sérotonine (5HT) exerce une action analgésique au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière. Dans cette étude, nous proposons d'étudier la transmission nociceptive spinale sur un modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez la souris. Nous utiliserons des souris transgéniques qui permettront de cibler les neurones à sérotonine par des approches d'optogénétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle des neurones à sérotonine dans le contrôle de la transmission nociceptive et son altération dans un modèle de douleur induit par la maladie de parkinson. L’identification des réseaux impliquant les neurones à sérotonine permettra de mettre au jour de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourront ensuite amener de nouveaux traitements pour améliorer le bien-être des patients parkinsoniens. Associés aux traitements des symptômes moteurs, ils apporteront un réel bénéfice aux patients dont la qualité de vie tendra à s’approcher de celle des sujets sains.

Procédures

Dans cette étude, 312 animaux recevront : -Une chirurgie stéréotaxique cérébrale (environ 1h30) et une spinale (environ 45min), -Une stimulation optogénétique d'une durée de 3 min également de l'entrainement comportemental de 10 min. -Electrophysiologie : 2h

Impact sur les animaux

Les animaux subiront deux interventions chirurgicales par stéréotaxie au niveau cérébral et spinal qui présentent des risques potentiels d'infection, d'hypothermie et de douleur. La stimulation thermique à l'aide d'un faisceau infrarouge utilisée pour mesurer le seuil du retrait de la patte arrière peut provoquer une rougeur cutanée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour l'analyse histologique

Remplacement

Il n'existe aucun modèle in vitro sur culture cellulaire pouvant reproduire la physiopathologie étudiée dans ce projet. En effet, nous travaillons sur les relations entre réseaux nerveux matures et interconnectés dans le système nerveux. Ces connexions sont impossibles à reproduire in vitro. Les études in vivo sont donc indispensables.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum en tenant compte des contraintes expérimentales pour obtenir des résultats statistiquement cohérents et significatifs. La taille des cohortes par groupe a été ajustée aussi pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle comportementale et du taux de succès des différentes procédures réalisées chez l’animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe au sein de l’animalerie dans un environnement enrichi comprenant des tubes en carton et matériel de nidification. Leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique. Les chirurgies seront réalisées par des experts et optimisés pour soulager le stress et la douleur post-op et des analgésiques seront adaptés. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long de l’étude. Après la chirurgie, les animaux seront surveillés avec une attention renforcée pour limiter la perte du poids (cage de stabulation 24h sur 24 sur un tapis chauffant, réhydratation, injection bi quotidienne sous-cutanée de saline 0,9% et saline-glucose 5%, nourriture humidifiée sera déposée dans la cage). En cas de problème, une intervention immédiate et selon les points limites spécifiques une conduite à tenir en fonction des points limites généraux et spécifiques. En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée car ce modèle d'espèce génétiquement modifiée permet de cibler des populations de neurones identifiées. D'autre part, le modèle inflammatoire a été largement utilisé chez la souris. Il s'agit d'un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. L’étude doit être réalisée à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes âgées de 8 à 12 semaines.

1 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale, une irradiation puis l'injection d'un produit radioactif au lutétium-177, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur n'attend qu'une "perte de poids légère" et décrit peu d'effets, tout en fixant la gravité à modérée. Il justifie le choix de la souris par sa "petite taille", sa "grande fécondité" et son "coût de production peu élevé", et affirme que l'in vitro ne simule pas la complexité de l'organisme.

Objectifs

Nous proposons dans cette étude de développer, dans une première étape, un nouveau vecteur de TRT (radiomarqué avec le lutétium-177 - 177Lu) ciblant des protéines cibles radioinduites par une radiothérapie (RT) externe de 8 Gy. La RT va ainsi réchauffer la tumeur et induire l’augmentation des antigènes cibles mais aussi l’infiltration de la tumeur par des cellules immunitaires. Dans la seconde étape, nous évaluerons cette réponse immunitaire intra-tumorale et systémique induite par la combinaison de RT et TRT pour deux modèles syngéniques de cancer colorectal de souris

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer un nouveau radiopharmaceutique (candidat-médicament) de TRT marqué au 177Lu qui pourra être administré en combinaison avec une fraction de RT externe +/- une immunothérapie

Procédures

- Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prends 10 jours à partir de la date d'injection. - Ensuite le radiopharmaceutique est injecté par voie intra-veineuse (une seule injection sera faite sur les souris, durée d'injection =1h à 2h dépendament du nombre de souris à injecter) - Prélèvement d’organes en fin de manip ou à des temps d’étude bien définis (durée = environs 3 h).

Impact sur les animaux

Une perte de poids légère pourra être observée chez les souris traitées avec la radioactivité durant les trois premiers jours qui suivent l’injection. Aucun autre effet secondaire ou nuisance n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Les animaux dont la greffe n’aura pas prise - Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de biodistribution « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie par SPECT (Single photon emission computed tomography), nous permet de suivre la biodistribution/pharmacocinétique de la molécule sur une longue période (7 jours) chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées en vigile en IP ou en per os. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires.[1] De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature. [1]- Schuc et al., “Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice" Toxicol Pathol (2004)

56 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de fibrilles dans une structure cérébrale liée à la mémoire, puis sont gardées deux mois avant d'être tuées pour analyse. Le projet compare des souris porteuses de la forme APOE3 ou APOE4 pour comprendre comment ce facteur de risque aggrave une maladie du cerveau. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que la souris reste un outil "unique" pour étudier ces mécanismes.

Objectifs

L’apolipoprotéine de forme APOE4 est un facteur de risque génétique dans plusieurs maladies du cerveau, contrairement à son homologue neutre APOE3. L’objectif de cette étude est de comprendre comment la présence de ce facteur de risque aggrave ces maladies du cerveau. Nous testerons par exemple si la présence de APOE4 accélère la progression de la pathologie par rapport à la présence de APOE3. Nos premiers travaux montrent que des voies de signalisations spécifiques sont altérées par la présence de APOE4 et l’objectif de ce projet est de valider ces données à l’aide de différentes techniques et sur un plus grand nombre d’individus. Cette étude permettra de mieux comprendre le mode d’action du facteur de risque pour pouvoir ensuite mieux diagnostiquer et/ou prévenir ces maladies.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux exprimant un facteur de risque (tel que APOE4), nous pouvons étudier la manière dont il aggrave une pathologie. La mise en évidence d’un lien de cause à effet entre APOE4 et un marqueur de la maladie pourrait permettre de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme car le facteur APOE4 est un facteur de risque associés à certaines maladies du cerveau seulement. En élucidant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine en permettant par exemple d’adapter de nouvelles thérapeutiques. Une validation de nouvelles cibles altérées par le facteur de risque dans la maladie ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques, et pourraient également aider à un meilleur diagnostic de cette maladie. En effet, avec le vieillissement, il est parfois difficile de diagnostiquer certaines maladies du cerveau qui présentent des symptômes similaires, malgré la présence de marques pathologiques différentes. La validation de nos cibles est importante à ce niveau car elles pourraient servir de biomarqueurs pour mieux diagnostiquer les patients.

Procédures

Procédure chirurgicale : chirurgie stéréotaxique pour injections de fibrilles aSyn dans une structure cérébrale liée à la formation de la mémoire sur 56 animaux. Le délai post-chirurgical avant la mise à mort de l’animal est de 2 mois. Les souris transgéniques exprimant le facteur neutre humain APOE3 (28 animaux) ou APOE4 (28 animaux) sous la forme KI (en lieu et place du gène murin) seront élevées pendant 5 mois. Elles ne présentent à cet âge aucun signe de dysfonctionnement connu (Jackson laboratories).

Impact sur les animaux

Douleurs sur la zone d’incision chirurgicale prévenue par l’application d’un analgésique local. Douleurs post-opératoires minorés par des antalgiques. Potentielle inflammation évitée par une injection d’anti-inflammatoire non stéroidien. Stress ou un comportement anormal peuvant survenir suite aux chirurgies surveillés quotidiennement pendant une semaine complète de récupération.

Devenir

Tous les animaux (56) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La propagation de protéines mal conformée dans différentes structures du cerveau est une caractéristique majeure des maladies du cerveau. Nous utilisons un modèle animal, la souris, pour mimer cette propagation (dans ce projet des fibrilles de synucléine) afin d’étudier les mécanismes moléculaire et cellulaires que cela provoque. Une fois injectées, ces fibrilles de synucléine induisent des altérations mesurables dans différentes structures cérébrales grâce aux connections qu’elles ont entre elles. Il n’est donc pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur les groupes expérimentaux selon les techniques utilisées (approches moléculaires et analyses immunohistologiques). Les calculs faits tiennent compte de la variabilité inter-individuelle qui sera réduite compte tenu que nous utiliserons seulement des animaux mâles dans nos expériences, mais augmentée selon l’efficacité des injections de fibrilles aSyn. Ces dernières seront évaluées à l’aide de tests statistiques adaptés après analyse par immunohistologie.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux avant et après la chirurgie. Des mesures de raffinement sont prises lors de la chirurgie : anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale, pommade d’anesthésique au niveau des oreilles (barres d’oreille du cadre stéréotaxique), injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien, pommade à base de vitamine A contre le dessèchement occulaire, tapis chauffant thermostaté préservant la température de l’animal et cage placée en zone réchauffée apr ès l’opération. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après la chirurgie : la surveillance des souris se fait 1X par semaine de façon détaillée (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture, pesées) permettant de s’assurer du bien-être des souris. Un personnel autorisé et expérimenté pratiquera la chirurgie (formation à la pratique des actes chirurgicaux sur les animaux utilisés à des fins scientifiques) et la mise à mort si un point limite est atteint.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris. Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau car il possède des structures neuro-anatomiques comparables à celle du cerveau humain. En particulier l’hippocampe, le cortex frontal, et les connections nerveuses qui leur sont associées, sont des structures affectées de façon primaire dans ces maladies qui touchent la mémoire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (3-5 mois) pour avoir des informations sur les interactions entre le facteur de risque génétique étudié dans un cerveau mature et non en formation/développement. Cet âge nous permet également de nous affranchir des effets du vieillissement, pour éviter les facteurs confondants, le vieillissement étant également un facteur de risque des maladies du cerveau en général.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie abdominale avec ligature de l'uretère ou l'injection d'un composé, puis des prélèvements de sang et d'urine avant d'être tuées à sept ou vingt et un jours pour analyser les reins. Le porteur signale une douleur possible à la cicatrice et une perte de poids, et prévoit un analgésique si la douleur est avérée. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de travailler sur un animal vivant.

Objectifs

Un développement anormal de tissu, ou fibrose, dans le rein est fréquent dans de nombreuses pathologies rénales. Le rôle des plaquettes sanguines dans ce processus a été montré dans différents modèles mais dépend des tissus et des lésions. Ainsi, nous avons découvert un rôle critique de deux facteurs plaquettaires dans des pathologies présentant une fibrose dans le poumon et dans le coeur. Cependant, rien n'a été étudié dans le rein. Notre objectif est donc d'étudier le rôle de ces deux facteurs plaquettaires dans le développement de la fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'étudier l'implication de deux protéines plaquettaires sur le développement de la fibrose rénale et ses conséquences sur le fonctionnement du rein. Il permettra de définir si cibler ces protéines pourrait être pertinent en thérapeutique chez l'homme.

Procédures

Deux modèles seront utilisés. Dans le premier, les animaux subiront une chirurgie (incision abdominale) qui permet la ligature de l'uretère, d'une durée totale de 30 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Dans le deuxième modèle, une injection d'un composé est réalisé en une fois au niveau de l'abdomen (voie intraperitoneale) et dure moins d'une minute. Dans les deux modèles, les animaux auront un à deux prélèvements sanguins intraveineux sous anesthésie et pour le deuxième modèle, deux prelèvements d'urine, émise spontanément en pressant la vessie pour évaluer la fonction rénale. A la fin des procédures, après 7 et 21 jours ,un prélèvement de sang intraveineux sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale, l'urine sera prélevée directement dans la vessie et les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines, et un gonflement du ventre (oedeme rénal) modéré peut apparaitre avec le temps. La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation au niveau de la cicatrice qui seront cependant attenués par les analgésiques. Les animaux sont également anesthésiés une à deux fois pour le prélèvement sanguin qui peut générer une douleur modérée. Ils peuvent également perdre du poids au cours des procédures et être moins actifs.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir analyser les reins.

Remplacement

La fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro en raison de la complexité des mécanismes mis en jeu. Il est donc nécessaire de travailler sur un modèle animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score et l'évaluation de la fonction rénale. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et les prélèvements sanguins seront effectuées sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, les modèles utilisés sont bien établis chez la souris adulte. Les souris de 8-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier les facteurs plaquettaires impliqués, avec de surcroit la disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les facteurs plaquettaires étudiés.

3 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fractions issues de patients, jusqu'à deux chirurgies, puis un traitement administré une à deux fois par jour pendant un maximum de trente semaines, avec prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur décrit une activité préclinique de service destinée à tester des composés, et renvoie le bénéfice à une "meilleure compréhension" et à l'identification de traitements. Il affirme que la souris a un système nerveux "identique" à celui de l'homme et conclut que le recours à l'animal vivant est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies neurologiques se définissent par un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Elles revêtent plusieurs formes et touchent un nombre important de personne dans le monde. L’origine de ces maladies est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux.  Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.  Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de différents modèles murins de maladies neurologiques qui permettent d’en reproduire les symptômes afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action via l'observation de l'activité neuronale en temps réel. Ces modèles sont générés soit par injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fraction protéique purifiée issus de patients soit par un traitement systémique via une neurotoxine. Elles peuvent concerner des souris normales et des souris transgéniques. Aucune de ces lignées transgéniques ne montre de phénotype dommageable. Les approches mises en œuvre sont une chirurgie intracérébrale et l’administration chronique d’un traitement. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d’un traitement chronique à différentes doses sur la composante comportementale et cellulaire. La mesure des effets des traitements se fait par des analyses biochimiques et cellulaires sur les cerveaux et les tissus biologiques prélevés après la mise à mort des animaux. Des prélèvements de sang pourront aussi être réalisés tout au long du traitement.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. La génération de modèle expérimentaux de maladie neurologique chez la souris est donc nécessaire afin de tester différents composés thérapeutiques. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée maximale d'une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 2 semaines. L'administration de traitement (30 secondes) pourra être réalisée une à deux fois par jour pour une durée de 1 jour et au maximum de 30 semaines. Prélèvements sanguins à la queue (1 minute) sur l'animal vigile (1 prélèvement/semaine ou par mois selon la durée de l'étude). Prélèvements de liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière (1 prélèvement à la fin de l'étude, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection de virus entraine peu de nuisances chez l’animal. L’injection de toxines entraine un suivi spécifique. Les injections peuvent entrainer une perte de poids et une diminution de la mobilité. L’implantation nécessite un suivi spécifique, la pose de ciment afin de maintenir l’implant peut être douloureux les premiers jours. Les maladies neurologiques peuvent induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées. Aucune des lignées transgéniques utilisées ne montre de phénotype dommageable. Si l’administration de traitement entraine des effets indésirables, le traitement sera interrompu et l’animal surveillé.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de souris pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire pour reproduire les symptômes de la maladie en vue de tester des nouveaux traitements. D’autre part, l’étude du cerveau sur animal en mouvement, nécessite le recours à l’animal vivant.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum de 14 animaux par groupe soit 70 souris par étude incluant les groupes expérimentaux (4 doses différentes de composé) et leur contrôle. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le LCR (liquide céphalorachidien), le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés. L’analyse de l’activité neuronale in vivo nous permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal étant son propre contrôle. Des analyses statistiques seront effectuées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (3 à 5 par cage). Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée via une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d’analgésique et d’anesthésique local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 5 jours (dépendant de la gravité de la procédure) est mis en place avec une pesée quotidienne et l’observation de critères de bien être. Chaque critère est scoré. Des mesures spécifiques peuvent être prises : si l’animal manque de tonus, une injection intrapéritonéale de solution saline sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort est prise par l’expérimentateur. Si l’animal a bien récupéré, un suivi visuel journalier et une pesée hebdomadaire seront effectués. Administration du traitement : les administrations sont réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Pour le traitement induisant des mouvements involontaires anormaux, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante et plus douce afin d’éviter d’éventuels problèmes d’irritations aux pattes et à la queue. Si le traitement provoque des effets indésirables, le traitement peut être interrompu et l’animal surveillé.  

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est identique à celui de l’homme. Ces modèles ont un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus, l’injection de toxine ou de virus dans le cerveau est bien établie dans notre équipe et les travaux sur la souris sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. L’utilisation de la souris permet également de générer des modèles transgéniques pertinents et bien caractérisés permettant de tester des candidats médicaments pour différentes pathologies. Les maladies neurologiques apparaissent préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 6 semaines jusqu'à l'âge adulte. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.

188 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de tumeur, quatorze injections et plusieurs prélèvements sanguins, plus des séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux types de cellules CAR-T dans un cancer du sang et un cancer du pancréas. Le porteur renvoie les retombées pour les patients, une immunothérapie mieux tolérée, au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de mesurer les effets secondaires chez la souris. Sur le remplacement, il affirme que ses résultats doivent être validés dans un "organisme vivant entier", seul système qui montrerait cette baisse des effets indésirables.

Objectifs

Les cellules CAR-T représentent une avancée majeure en immunothérapie du cancer. Cependant, si ce traitement donne des résultats remarquables dans le contexte des cancers du sang, 30% des patients traités rechutent. De plus, ce type de traitement induit très fréquemment des effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, notamment une tempête cytokinique et une toxicité neurologique. Ces effets secondaires découlent d’une hyperactivation de la réponse innée induite par les cellules CAR-T. L’analyse de ces processus nécessite donc l’utilisation de modèles de souris humanisées, dans lesquelles les cellules CAR-T pourront interagir avec notamment un compartiment myéloïde également humain autologue. Nous avons récemment établi un nouveau protocole permettant de générer des cellules CAR-T ayant un potentiel antitumoral fortement augmenté. Le projet proposé consiste à comparer la survenue de ces effets secondaires après l’injection de cellules CAR-T classiques ou des cellules CAR-T obtenues suivant notre protocole. Nous comparerons la survenue de ces effets secondaires dans deux modèles tumoraux : un modèle de cancer du sang et un modèle de cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre à terme d’établir les bases expérimentales permettant le repositionnement du médicament anti-diabétique en immunothérapie. En effet, initialement décrit dans la prise en charge du diabète, ce traitement pourrait être à la base d’un protocole permettant d’obtenir une nouvelle génération de cellules CAR-T . Ces cellules, en levant les verrous liés à la faible persistance et l’anergie induite par le microenvironnement tumoral mais également en minimisant la survenue d’effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, pourraient induire une nette amélioration de la prise en charge des patients traités par l’immunothérapie basée sur l’utilisation de cellules CAR-T.

Procédures

Suivant les conditions expérimentales, les animaux seront soumis à une irradiation légère (durée 3 minutes), 7 injections (

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress léger consécutif aux manipulations fréquentes (suivi de croissance tumorale, suivis par prises de sang). Les souris subiront des injections sous anesthésie locale engendrant un stress temporaire léger. Les souris subiront une irradiation légère sans effet retardé et des séances d'imagerie sous anesthésie générale ayant un impact léger (préhension, déplacement). Enfin, la croissance tumorale elle-même peut induire une gêne physique légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses sur organes nécessaires à l'étude.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un nouveau protocole d’élaboration de cellules CAR-T que nous avons mis au point, notamment la minimisation de la survenue d’effets secondaires délétères pour la santé du patient. Nous avons, en amont des expériences exposées ici, réalisé un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une diminution de l'activation de certaines cellules en présence de cellules CAR-T obtenues suivant le protocole que nous avons développé par comparaison avec des cellules CAR-T classiquement obtenues. Nous avons notamment pu établir que des monocytes cultivés en présence ces cellules CAR-T produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et présentent un phénotype moins activé que ceux cultivés en présence de cellules CAR-T classiques. A présent, afin d'obtenir des résultats au plus proche d'un essai clinique, nos résultats doivent être validés dans un organisme vivant entier, seul système qui puisse montrer que cette moindre activation du compartiment myéloïde se traduit par une diminution des effets secondaires (perte de poids, fièvre, atteinte neuronale).

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie par bioluminescence afin de réduire le nombre d'animaux utilisés (l'animal est son propre témoin pour certains paramètres, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux) . Les groupes d'études sont mis en oeuvre le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées dans chaque procédure a été établi sur la base de l'experiences acquise au cours de 20 années de travaux antérieurs. Au cours de ce projet, nous utiliserons le nombre de souris minimal requis pour obtenir des résultats statistiquement représentatifs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement constitué de sizzlenests et de maisonnettes en carton. Les interventions seront faites sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal et non invasif de la croissance tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Ceci permettra aussi de détecter au plus tôt les tumeurs pour arrêter le plus tôt possible les procédures. Les souris seront surveillées quotidiennement (examens cliniques) pendant toute la durée de la procédure expérimentale afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Afin de minimiser les douleurs lors des injections sous cutanée et intraveineuse au niveau de la veine caudale ou faciale, les souris seront anesthesiées localement par apllication d'un spray lidocaïne. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle de souris est humanisable ce qui permet de suivre les conséquences d'interactions complexes de nombreux partenaires cellulaires autologues au sein d'un organisme vivant. Il constitue donc le modèle le plus adéquat aux études précliniques. Pour générer les cellules d'intérêt pour l'humanisation, il est indispensable d'utiliser des souris âgées de moins de 2 jours. En effet, des travaux recents montrent que passé cet âge, la reconstitution de la lignée lcellulaire d'intérêt est fortement altérée. Pour les tests sur souris humanisées, les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines en début d'expérience: âge optimal pour obtenir une reconstitutton du système immunitaire inné.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles reçoivent par voie orale de faibles doses de polluants pendant trente-cinq jours, passent un test comportemental, puis sont croisés avec des femelles dont les embryons sont analysés, tous les animaux étant tués pour prélever testicules, cerveau et foie. Le porteur annonce un stress minimal lié à l'administration et surveille le risque de fausse route, avec un point limite de perte de poids de 10 %. Il cherche à évaluer des effets épigénétiques de l'exposition paternelle et affirme que la spermatogenèse et le développement embryonnaire ne sont possibles qu'in vivo.

Objectifs

L'objectif de l'étude est de révéler les effets de l'exposition chronique à faible dose sur le système reproducteur mâle en mettant l'accent sur les mécanismes épigénétiques. 1) Analyser les effets des polluants sur le nombre de spermatozoïdes et la méthylation de l'ADN. 2) Révéler les effets sur la méthylation de l'ADN dans le cerveau, le foie et les testicules embryonnaires. 3) Analyser les modifications du comportement de la descendance des animaux traités.

Bénéfices attendus

Nous répondrons à plusieurs questions. Nous chercherons à savoir si l'exposition à de faibles doses de polluants environnementaux persistants modifie la santé reproductive des souris mâles, le nombre de spermatozoïdes et si elle induit des altérations épigénétiques. Nous nous demanderons si les éventuels effets induits chez les mâles influencent le développement embryonnaire des futurs embryons tels que le cerveau, le foie et les testicules et, enfin, si le comportement des animaux adultes est altéré.

Procédures

Les animaux recoivent, par administration orale (0.1ml), des polluants à faible dose, 1 fois par jour, tous les 2 jours, pendant 35 jours. Cette intervention dure 30 secondes en moyenne. Le test de comportement durera 5 minutes et ne sera pas répété.

Impact sur les animaux

Les concentrations des polluants utilisés sont faibles et les composés seront dissous dans l'eau. Le stress lié à l'administration sera minimal. La fausse-route lors de l'administration est un risque qui sera surveillé. Le test de comportement peut générer une anxiété, un stress qui seront observés mais non répétés.

Devenir

Tous les animuax sont mis à mort à la fin de la procédure: nous analyserons les organes cibles de l'étude (testicules, cerveau et foie).

Remplacement

Le modèle de souris est couramment utilisé dans les études toxicologiques. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire très complexe et qui n’est possible qu’in vivo.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant, pour les trois groupes de composés téstés, un seul groupe d'animaux contrôles. Cependant, l’utilisation de souches non consanguines nécessite 12 animaux par lot en raison de la forte variation entre les animaux, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les composés seront administrés par voie orale, par des personnes formées et compétentes pour ce geste technique. Les souris seront traitées seulement tous les deux jours, ce qui aidera à réduire le stress. Les polluants testés sont dissous dans de l'eau. Application de points limites : perte de poids de 10% maximum, les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lot de 4.

Choix des espèces

La souche Swiss RjOrl, souche non consanguine, est un modèle de choix pour les études. Les souches non consanguines sont utilisées dans de nombreuses études toxicologiques. Pour comprendre comment des facteurs toxiques influencent la gamétogenèse au cours du développement, le modèle de la souris est judicieux car très utilisé dans l’étude du développement chez les mammifères. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets de la pollution. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes. Lorsque le traitement sera terminé, les animaux auront atteint l'âge de deux mois, de sorte que les mâles seront capables de féconder les femelles. Pour l'étude embryonnaire, nous croiserons ces animaux mâles avec des femelles âgées de 8 semaines (à cet âge les femelles sont fertiles) et les embryons de 15 jours seront analysés.