Procédures modérées
Evaluation de la capacité de souches recombinantes de BCG, pro-autophagie, à mieux protéger contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Vaccinées avec des BCG recombinants, quatre-vingt-quatre d'entre elles sont ensuite infectées par la tuberculose en aérosol, maintenues en chambre de contention pendant quarante minutes, l'infection provoquant une inflammation pulmonaire et des lésions tissulaires. Le porteur les fait toutes tuer, faute de replacement possible en contexte infectieux. Il teste si l'induction de l'autophagie améliore la protection vaccinale et affirme que ce travail ne peut être envisagé que sur un modèle animal.
Objectifs
Le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) est un vaccin utilisé dans la lutte anti-tuberculeuse depuis un siècle. Cependant son efficacité chez l’adulte est modérée et doit être accentuée par l’utilisation de nouvelles stratégies. Une de celles-ci, qui sera évaluée dans cette étude dans un modèle murin, est d’induire l’autophagie, un mécanisme physiologique de défense de l'hôte. L'objectif du projet est donc d’utiliser des BCG produisant un peptide inducteur de l’autophagie (BCG recombinants) et de comparer leur pouvoir immunogène et leur capacité à protéger des souris infectées avec le bacille tuberculeux par rapport au BCG. Une augmentation de la protection antituberculeuse est escomptée. Si tel est le cas, l'innocuité (absence d’effet toxique) des BCG recombinants sera évaluée également chez la souris.
Bénéfices attendus
La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, demeure un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, avec plus d’un million de décès par an. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG chez l’adulte, la co-infection avec le virus de l'immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques. L'amélioration du vaccin et la découverte de nouvelles voies thérapeutiques, notamment celles basées sur l’immunité de l’hôte, demeurent donc une priorité. L'autophagie est un mécanisme fondamental de défense de l'hôte notamment impliqué dans la lutte contre les infections. Des résultats expérimentaux obtenus in vitro et in vivo suggèrent fortement que l’autophagie pourrait augmenter l’efficacité de la vaccination par le BCG. Ainsi si les souches de BCG recombinants, qui vont être utilisées dans ce projet, augmentent l’immunogénicité et/ou la protection des souris contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis, cela démontrera le rôle bénéfique de l’autophagie dans la vaccination. A plus long terme, si l’innocuité de ces souches est démontrée, leur utilisation en vaccination humaine pour la protection anti-tuberculeuse pourra être envisagée et pourrait donc augmenter la protection contre l’infection tuberculeuse.
Procédures
Une seule injection, d’une durée inférieure à 2 minutes, des différentes souches de BCG sera réalisée sur toutes les souris. 84 souris seront infectées par voie aérosol avec 100 bacilles tuberculeux. Cette infection sera réalisée sur animaux vigiles placés dans des chambres de contention pendant 40 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux seront induits à deux niveaux : 1) Lors de la réalisation des procédures 2) Par la pathologie induite par l’infection Lors de la réalisation des procédures, il s’agit d’un stress faible et de courte durée généré par les gestes techniques tels que la contention et les injections lors de la vaccination et l’infection des animaux. La vaccination des souris par le BCG sera effectuée par injection sur animal vigile après une légère contention. Cette opération indolore induit un léger stress de courte durée. Lors de l’infection par les bactéries par aérosol les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération d’une durée d’environ 40 minutes (introduction et sortie des animaux des chambres et temps d’exposition à l’aérosol) induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Pour les animaux immunocompétents, les effets attendus sont une gêne respiratoire modérée et un léger affaiblissement de l’animal se traduisant par des signes cliniques d’aspect (pelage) et de comportement (posture, mobilité). Ces signes cliniques apparaissent tardivement au cours de la procédure, et seront donc de courte durée de l’ordre de quelques jours. Pour les animaux immonodéficients, en plus des nuisances précédemment citées, une perte de poids pourra être enregistrée. La pesée des animaux ne génère pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort car il n’y a pas de possibilité de replacement vu le contexte infectieux.
Remplacement
Ce travail d’investigation ne peut être envisagé que sur un modèle animal. En effet il s’agit de démontrer que l’activation de l’autophagie permet d’accroitre l’effet de la vaccination et ainsi d’aider le système immunitaire à mieux combattre l’infection par une meilleure élimination des bactéries. Or la vaccination est un procédé qui consiste à stimuler le système immunitaire afin qu’il développe une réponse adaptée et spécifique à un agent infectieux. Cette réponse nécessite de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires dont le fonctionnement concerté ne peut se faire qu’in vivo. En amont de cette étude, des expériences in vitro et in vivo suggèrent fortement, mais sans le démontrer clairement, que l’autophagie pourrait avoir un effet bénéfique sur l’efficacité vaccinale du BCG.
Réduction
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont basées sur un nombre de 5 souris par condition. Dans ce modèle expérimental comme dans la plupart des modèles d’investigation in vivo, et bien que l’expérimentation soit réalisée sur des animaux issus d’une lignée, la variabilité inter individuelle en réponse à un stimulus est importante et ne nous permet pas de diminuer le nombre d’animaux par groupe en dessous de cette valeur afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux, deux souches de BCG recombinants, exprimant les peptides les plus efficaces pour activer l’autophagie, parmi ceux décrits dans la littérature, seront testées. De plus cela permettra également de limiter le nombre d’animaux utilisés comme témoin car ainsi toutes les souris peuvent être infectées en même temps limitant ainsi la variabilité.
Raffinement
Dans ces expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances : anesthésie, limitation des temps de contention au minimum, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d’une grille de scoring et de points limites précoces.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux de tuberculose humaine existent mais l’espèce murine est la plus utilisée dans la littérature. Les données préliminaires existantes suggèrent que l’autophagie pourrait être impliquée dans l’accroissement du pouvoir vaccinal du BCG ont été obtenues, in vitro, grâce à l’utilisation de cellules murines et, in vivo, avec des souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés de 8 semaines. Il s’agit donc d’animaux adultes afin que leur système immunitaire soit totalement fonctionnel. En effet le but du projet est d’évaluer l’impact de l’autophagie sur le pouvoir vaccinal du BCG pour lutter contre l’infection tuberculeuse. La vaccination étant un procédé permettant à l’organisme de développer une protection spécifique vis-à-vis d’un agent infectieux grâce à son système immunitaire, les expériences doivent être réalisées avec des animaux ayant un système immunitaire parfaitement développé.
Étude métabolique et fonctionnelle en imagerie in vivo d’un modèle de gliomes chez la souris (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe intracérébrale de cellules humaines de glioblastome lors d'une chirurgie stéréotaxique, suivie de trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur attend une neuroinflammation, un état fébrile temporaire, une perte d'appétit et une léthargie après l'injection. Il caractérise un biomarqueur d'imagerie du gliome et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" pour le caractère translationnel des lignées humaines.
Objectifs
Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquent. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelé IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester et d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie en tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures. Une douleur pendant la chirurgie et post-chirurgicale peut apparaître et sera anticipée, évaluée et traitée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure, afin de permettre des analyses post-mortem in vitro seront réalisées sur les échantillons de cerveaux. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.
Remplacement
Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en sous-groupes expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en sous-groupes (de 5 à 7 souris) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque sous-groupe. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (anti-inflammatoires), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultra-sons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonor est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.
Manipulation pharmacologique de canaux mis en jeu lors d’un challenge hypercapnique chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
698 souris vont être utilisées, une majorité tuée sans réveil, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Des nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie du système nerveux central, tandis que des adultes reçoivent des solutions par aérosol ou par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur souligne que ces souris mutantes, modèles du syndrome d'Ondine, présentent une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque de défaillance respiratoire, l'arrêt cardiorespiratoire figurant parmi les points limites. Il teste des agents pharmacologiques sur des canaux respiratoires et affirme que cette fonction ne peut être étudiée que sur des souris vivantes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré), cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Des cellules du système nerveux sont sensibles à l’hypercapnie, par le biais de canaux présents à la surface de leur membrane. Ces canaux sont sensibles aux variations d’acidité (trop de CO2). Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC et leurs congénères sauvages. L’approche utilisée chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettra d’identifier l’agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité le plus efficace, elle nécessitera une chirurgie permettant d’isoler la partie du système nerveux central comportant la commande respiratoire. Chez les souris adultes, l’approche utilisée est non invasive, elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’un agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment ces canaux sensibles à l’acidité peuvent moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie (chémosensibilité au CO2/H+). A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie, cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. Le blocage des canaux sensibles aux protons pourrait potentiellement 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes, 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des canaux sensibles aux protons au niveau de la commande centrale respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les canaux sensibles aux protons peuvent moduler la commande centrale respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
L’identification par tatouages et les prélèvements de bout de queue pour identification génétique des souris juvéniles mutantes et contrôles sont réalisés par un personnel formé et ne dure que quelques secondes. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes seront exposées via un système d’aérosol à une solution contrôle et une solution contenant un agent bloquant (10 minutes à chaque fois) avant la mesure non invasive des variables ventilatoires. 48h séparent l’administration de la solution contrôle par aérosol de celle de l’agent pharmacologique. Les autres souris adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale de la solution contrôle et de l’agent bloquant (faible volume) sera réalisée. 48 heures séparent les 2 anesthésies. La mesure des variables ventilatoires chez les souris adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 70min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu.
Impact sur les animaux
L’identification et le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale du solvant ou de l’agent bloquant, peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des canaux sensibles aux protons sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par des agents bloquants des canaux sensibles aux protons ne peut être réalisée que sur des souris adultes vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 698 (349 souris mutantes utilisés). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ainsi, 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20 pour cent de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes ; étude de l’influence par les canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude sur des tranches de tissu des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la ventilation chez l’animal adulte vigil et de l’influence de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone appliqués par aérosol ou par administration intranasale.
Physiopathologie, neuromodulation et métabolisme dans des modèles expérimentaux de la maladie d’Alzheimer et de Tauopathies (version3)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
17 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés, de vecteurs viraux ou d'anticorps, parfois par voie intracérébroventriculaire sur animal vigile, subissent un régime obésogène de vingt semaines, des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, des biopsies de queue et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur annonce qu'aucun animal ne sera réutilisé ni adopté. Il étudie des modèles de la maladie d'Alzheimer et des tauopathies et qualifie le recours à l'animal de "stricte nécessité".
Objectifs
L’objectif général des projets de notre laboratoire et de la présente demande vise à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la MA. L’objectif de nos études est d’une part d’appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement de la pathologie Tau dans la MA et les tauopathies ; et d’autre part, de définir des preuves de concepts permettant une translation vers le patient tant sur le plan diagnostic (biomarqueurs) que thérapeutique. Cette stratégie expérimentale a fait ses preuves par le passé avec le développement de start-up, de transfert de nouveaux biomarqueurs vers le CHU ainsi que la mise en place de différents essais thérapeutiques chez patients atteints de maladie d’Alzheimer et de tauopathies. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA mais répond également à des besoins cliniques en terme de diagnostic, pronostic et thérapeutique.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre différentes avancées scientifiques permettant de faire progresser la connaissance de la physiopathologie de la MA et des tauopathies. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement séquentiel de la pathologie Tau dans la MA et les possibilités de les bloquer par des approches à bases d’anticorps et de nanobodies. Ces études se doublent d’approches visant à développer les nanobodies en tant que biomarqueurs en imagerie cérébrale. Le laboratoire a également découvert de nouvelles formes pathogéniques de la protéine Tau qui semblent précocement impliquées dans la maladie d’Alzheimer vs. d’autres tauopathies. Notre projet vise donc à mieux comprendre les mécanismes conduisant aux espèces pathogénique de Tau et à développer des outils immunothérapeutiques permettant leur clairance et des stratégies améliorant ces immunothérapies avec à terme, la possibilité d’initier des essais cliniques. Par ailleurs, notre projet s’intéresse également au rôle de Tau dans la régulation de l’homéostasie glucidique, dont la dérégulation augmente le risque de développer la MA. Enfin, notre projet s’intéresse aux effets de la caféinede mieux comprendre le rôle respectif de ses récepteurs centraux dans ses effets bénéfiques. Là encore l’intérêt clinique est évident. La compréhension de l’impact de drogues approuvées par la FDA sur le développement de la pathologie Tau mais également du passage d’anticorps thérapeutiques dans le cerveau est de nature à implémenter les approches cliniques existantes et de susciter des essais cliniques ultérieurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes injections de composés pharmacologiques, de vecteurs viraux ou d’anticorps réalisées entre 1 à 6 fois pour des durées variant de 1 à 10 minutes. Dans certains protocoles les animaux seront soumis à un régime obésogène pour une durée de 20 semaines et leur caractéristiques métaboliques évalués (glycémie, tolérances au glucose et à l’insuline). Des prélèvements de sang ou de liquide céphalorachidien seront réalisés entre 1 et 4 fois pour des durées de 1 à 30 min); de même que des biopsies de queue, réalisées 1 fois durant moins d’une minute. Le cerveau de certains animaux sera prélevé à des ages précoces afin de réaliser des cultures cellulaires ou de cultiver des tranches de cerveaux, procédure unique durant moins de 5 secondes. Nous réaliserons également des tests de comportement (entre 1 et 2 fois avec des durées variant de 10 min à 8 jours) afin d’évaluer les performances cognitives des animaux ainsi que de l’imagerie cérébrale par IRM (1 fois durant 30 min) et PET (1 fois durant 30 min) pour évaluer la morphologie et l’activité cérébrale.
Impact sur les animaux
Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue -Stress associé aux investigations comportementales et aux injections intracérébroventriculaires d’oligomères réalisées sur animal vigile en contention -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiques/prélèvements de LCR et douleurs/infections post-opératoires -Impact oculaire suite aux injections dans le plexus retro-orbital -Douleur associée aux prélèvements à la veine caudale -Stress métabolique suite au traitement par un régime riche en graisse -Stress hypoglycémique dans le test de tolérance à l’insuline -Douleur lors de la perfusion intracardiaque Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.
Devenir
En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 17480. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront euthanasiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (lésions amyloïdes, pathologie Tau, perte de fonction de Tau…). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’administration de drogues, l’injections de préparations humaines, l’expression cérébrale de différents gènes via différents vecteurs viraux ou le croisement avec d’autres lignées permettant de faire varier les phénotypes pathologiques et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 1 mois à 12 mois. Certaines expérimentations se feront aux stades embryonnaires ou jeune après la naissance.
Maintien de lignées murines mutées pour le gène Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour entretenir une lignée mutée pour le gène Apc qui développe spontanément des tumeurs intestinales. Elles sont identifiées par tatouage et biopsie d'oreille avant sevrage. Le porteur indique que les mâles servent une fois à la reproduction puis sont tués pour éviter la souffrance liée aux tumeurs, que les souris sauvages sont tuées et que les femelles mutées partent vers d'autres protocoles. Il maintient ce modèle pour tester le pouvoir pro-carcinogène de bactéries et affirme que le recours à l'animal reste "nécessaire".
Objectifs
De plus en plus de données de la littérature suggèrent que les bactéries du microbiote intestinal (c’est-à-dire des bactéries hébergées dans notre tractus digestif) pourraient être impliquées dans le développement du cancer colorectal (CCR). En collaboration avec le service hospitalier de chirurgie digestive, le laboratoire a identifié des bactéries retrouvées à haute fréquence au sein des tumeurs colorectales humaines. Des expérimentations menées in vitro nous ont permis de sélectionner des bactéries potentiellement pro-carcinogènes. Nous souhaitons valider ces souches dans un modèle murin. Cependant, les souris ne développent aucun CCR de façon spontanée. Le modèle murin de CCR disponible est le modèle Apc/Min. Ces animaux présentent une mutation génétique induisant le développement spontané d’un cancer intestinal. Le but de cette demande est d'entretenir la lignée Apc/Min de manière à pouvoir tester régulièrement le pouvoir pro-carcinogène de différentes souches bactériennes d'intérêt. Par ailleurs, nous nous intéressons également au rôle de l'autophagie (un processus cellulaire permettant de dégrader entre autres, les bactéries ayant pénétré à l’intérieur de la cellule) dans le développement du CCR lors d'infections bactériennes. En effet, ce processus semble impliqué dans l'initiation/progression de plusieurs cancers dont les CCR. Pour cela, nous devons entretenir une lignée Apc/Min dans laquelle un gène crucial pour la mise en place de l'autophagie a été délété. Ce projet nous permettra de répondre à plusieurs questions : (i) nous déterminerons quelles bactéries sont potentiellement pro-carcinogènes et (ii) nous déterminerons si l'autophagie joue ou non un rôle dans ce processus.
Bénéfices attendus
Notre demande a pour objectif de pouvoir maintenir dans notre animalerie des souris Apc/Min et Apc/Min déficientes pour l'autophagie soit dans les cellules épithéliales intestinales soit dans la lignée myéloïde. Cette demande s'inscrit dans un projet qui a pour but de tester le pouvoir pro-carcinogène de diverses souches bactériennes (cette seconde partie faisant l'objet d'une demande spécifique d'autorisation APAFiS). Nous espérons ainsi identifier quelles sont les souches et éventuellement leurs toxines qui aggraveraient la pathologie et comprendre si l'autophagie est impliquée. Ainsi, sur le long terme, nos travaux pourraient permettre de comprendre comment les bactéries impactent le développement du cancer colorectal mais également d’identifier des bactéries à surveiller plus particulièrement chez les patients susceptibles de développer un cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront identifiés par un tatouage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Une biopsie d'oreille sera prélevée de manière à effectué le génotypage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Ces 2 interventions se feront sur animaux vigiles âgés de 20 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les souris Apc/Min sont des souris mutantes (suite à une exposition à des radiations) qui développent spontanément des tumeurs intestinales. En règle générale, ces animaux développent en moyenne 2 tumeurs colorectales. Ces animaux peuvent vivre 5-6 mois sans être affectés par le développement des tumeurs. Ceci implique néanmoins un taux de renouvellement « élevé » des mâles reproducteurs. Ils serviront 1 fois à la reproduction puis seront mis à mort pour éviter toute souffrance due au développement de la tumeur. D’expérience ce renouvellement permanant des mâles Apc/Min reproducteurs prévient totalement la gêne/souffrance occasionnée par le développement tumoral. Cependant, nous suivrons attentivement les animaux et un système de score a été mis en place de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites (cf annexe).
Devenir
Cette demande vise à maintenir dans notre animalerie le modèle Apc/Min que nous utilisons dans des protocoles expérimentaux. Les mâles Apc/Min seront utilisés pour remplacer les anciens reproducteurs. Les souris sauvages seront mises à mort. Les femelles Apc/Min seront utilisées à des fins expérimentales.
Remplacement
Le but de cette demande s'inscrit dans une démarche visant à déterminer le pouvoir pro-carcinogène de souches bactériennes ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu (notamment l'autophagie). De manière à limiter au maximum l’utilisation d’animaux, les souches bactériennes potentiellement d’intérêt sont testées in vitro. Nous recherchons des signatures pouvant laisser penser à un effet pro-carcinogène et plus précisément les dommages dans l’ADN et/ou des modifications significatives du cycle cellulaire. Uniquement des souches validées pour ces paramètres seront testées chez l’animal. Le recours à l’animal reste nécessaire car il nous permet de valider si effectivement la bactérie favorise le développement du cancer colorectal et d'apprécier l'impact d'une autophagie fonctionnelle ou non sur le développement de la pathologie.
Réduction
Le nombre de cages de reproduction est réduit au maximum de manière à nous assurer le maintien de la lignée.
Raffinement
Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton ou en plastique. Les animaux ne seront jamais isolés et toujours en groupe. Lors des reproductions nous mettrons 1 mâle en présence de 2 femelles. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués à ce modèle sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
L'étude du CCR en modèle animal se fait toujours sur des souris. Cependant, ces animaux ne développent pas spontanément de CCR. Deux grands modèles existent : -modèle génétique : mutation du gène Apc. C'est ce modèle que nous avons choisi car ces animaux présentent une mutation du gène Apc comme les patients, en faisant de ce fait un bon modèle. -modèle inflammatoire : AOM/DSS. Association d'un carcinogène (AOM) et d'un agent induisant une inflammation colique: le DSS. Ce modèle sert surtout pour mimer le développement d'un CCR chez les patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (une population à haut risque de développer un CCR). Pour la reproduction, nous utiliserons des animaux matures sexuellement. Les mâles Apc/Min seront sacrifiés après leur première reproduction de manière a éviter que le développement du cancer n'affecte leur bien être
Formation aux procédures expérimentales
- Formation professionnelle
Rats : 300
Hamsters dorés : 75
Lapins : 30
Poissons zèbres : 210
4 715 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance de sans réveil à modéré. Environ 4 100 souris, 300 rats, 210 poissons zèbres, 75 hamsters dorés et 30 lapins servent à entraîner des expérimentateurs aux prélèvements, injections, gavages et actes chirurgicaux. Le porteur précise que les animaux sont tués pour apprendre aussi la mise à mort et le prélèvement d'organes. Il mobilise des animaux surnuméraires ou réutilisés, commence l'apprentissage sur des peluches et des cadavres, et qualifie le recours aux animaux vivants de "nécessaire" et "essentiel".
Objectifs
Les personnes souhaitant pratiquer des actes techniques ou de chirurgie sur les animaux de laboratoire doivent suivre une formation réglementaire selon l’arrêté du 1 er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques. Cette formation comprend différents modules imposés par la réglementation. Le nombre d’heures de pratique dans les formations réglementaires est insuffisant pour la bonne maitrise de ces gestes. La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française qui impose de : Tenir à jour un tableau de suivi permettant de s’assurer que le personnel dispose d’un niveau d’études, de compétences et d’une formation continue adéquats et vérifier que l’adéquation entre les compétences et les missions est effective lors de la prise de poste afin de définir, le cas échéant, un programme de formation adaptée à la personne et à la fonction exercée. La personne nominativement désignée pour cette tâche par le responsable de l’établissement tient à la disposition des agents de contrôle habilités tous les éléments permettant de vérifier que les compétences des personnels correspondent à la fonction exercée. Notre projet est donc éducatif. Il s’agit d’accompagner et de suivre les expérimentateurs pour des actes techniques et chirurgicaux : - préhension, contention, et manipulation, adaptées aux différentes procédures de routine ; - marquage individuel ; - administration et prélèvements de routine ; - anesthésie fixe et gazeuse ; - asepsie ; - mise à mort ; - actes chirurgicaux : sutures, vagotomie, prélèvement d’organes (thyroïdectomie, splénectomie…), ischémie rénale, cathéterisation…sur des animaux anesthésiés.
Bénéfices attendus
La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer et le suivi des animaux dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française. En matière de 3R, le bon apprentissage de ces techniques permettra de réduire les échecs des futurs expérimentateurs dans leurs projets et par conséquent le nombre d’animaux utilisés. Il permettra également l’amélioration de raffinement pour les différents gestes appliqués sur les animaux.
Procédures
Prise de sang sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-péritonéales, intra-musculaire, sous-cutanée, intra-dermique sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-veineuse sur animaux anesthésiés (rétro-orbitaire) ou vigiles (veine caudale), quelques secondes. Administrations : nasales, intra-trachéales, intrathécales, interosseuses sur animaux anesthésiés, quelques secondes, une fois. Gavage sur animaux vigiles, quelques secondes, une fois. Acte chirurgical, 30 à 60 min selon le geste, une fois
Impact sur les animaux
Ce projet inclut des actes chirurgicaux occasionnant des douleurs et un inconfort modéré. Ces actes seront réalisés sous anesthésie gazeuse/injectable et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire par le vétérinaire formateur afin d’éviter/minimiser la douleur et l’inconfort. Les différents actes d’administrations et de prélèvements n’occasionnent qu’une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée ainsi que celles sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux. Une partie de ces gestes sont réalisés sur des animaux anesthésiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont utilisés pour la formation à la mise à mort et à la réalisation de prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux expérimentateurs le bon apprentissage des techniques appliquées sur les animaux en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants en plus des autres méthodes alternatives. L’apprentissage commence par l’utilisation des peluches et des cadavres.
Réduction
Ce projet utilisera des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage ou des animaux réutilisés d’autres projets. Le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité d’appliquer deux ou 3 gestes légers sur le même animal. Le nombre d’animaux a été déterminé selon le nombre de personnes à former. Plusieurs sessions de travaux pratiques sur souris, rats, poisson zèbres, hamsters et lapins seront organisées par an, chaque session accueille en moyenne 5-10 participants En général, 1 animal est prévu pour la démonstration et 4 souris, 2 rats, 4 poissons zèbres, 1 hamster et 1 lapin par participant sont prévus pour chaque session.
Raffinement
La procédure expérimentale modérée de ce projet implique une anesthésie, une analgésie, un suivi quotidien des animaux, et des points limites précoces et spécifiques liés à l’acte chirurgical ainsi que les actions à mettre en place pour chaque point limite.
Choix des espèces
L’utilisation de souris s’impose pour former à la pratique de procédures expérimentales sur souris qui est l'espèce la plus utilisée dans l'établissement utilisateur. Certaines procédures ne sont applicables que sur les rats, hamsters, lapins et poissons zèbres d’où la nécessité d’utiliser ces espèces. Souriceaux et adultes pour les souris et adultes pour les autres espèces correspondant aux animaux utilisés classiquement lors des procédures expérimentales
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans la sensibilité gustative
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales, sont hébergées isolées pendant quatorze jours et mises à jeun, avant des mesures gustatives au gustomètre et au lickomètre présentées comme non invasives. Le porteur les fait tuer pour prélever le cerveau et en réaliser l'histologie. Il étudie le rôle de l'inflammation cérébrale postprandiale sur le goût et rattache au conditionnel des retombées sur les troubles du comportement alimentaire.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, PIR) systémique est maintenant bien documentée mais, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques après consommation d’un repas gras. Pour démontrer cela, nous avons éteint la PIR cérébrale chez la souris et observer les conséquences de cette extinction, en comparant le comportement alimentaire de souris modifiées génétiquement (sans la PIR) et de souris normales. L’objectif désormais est d’explorer la sensibilité gustative de ces animaux. Il s’agit de déterminer si la PIR agit sur les préférences alimentaires et/ou l’appréciation alimentaire. Pour évaluer cette possibilité, nous allons mesurer les performances gustatives chez des souris dont la PIR cérébrale a été abolie ou non. L’approche de perte de fonction est possible grâce à l’étude d’animaux mutants ne pouvant pas déclencher la PIR au niveau cérébral. Ces performances seront mesurées grâce à des dispositifs appelés gustomètre et lickomètre. Des animaux non mutants seront les témoins de l’expérience. Les animaux seront étudiés sous régime standard ou gras pendant 48 heures. A la fin des études, les animaux seront mis à mort et les cerveaux seront collectés post-mortem pour analyses moléculaires. Au total, 90 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les fonctions de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur les mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété et du métabolisme énergétique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
les animaux seront isolés et des mises à jeun de durée differentes à des temps differents seront réalisées. Certains animaux recevront des injections d'un composé pour induire l'expression de leur gène muté.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances sont liées aux 5 injections IP du composé entrainnant l'expression du gène muté des animaux à 5 semaines (douleur liée à une injection Intrapéritonéale) et aux conditions d’hébergement isolées pendant 14 jours. Ue stress métabolique léger sera induit par la mise en jeun pendant 5 heures. Enfin, la contention des animaux (pour mesurer le poids des animaux) représente aussi des nuisances de faible intensité pour les animaux.
Devenir
Les 90 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses métaboliques et comportementales fines.
Réduction
La procédure décrite (contrôle des conditions nutritionnelles et métaboliques) a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Une étude pilote sera réalisée afin de s’assurer de l’optimisation des procédures. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits.
Raffinement
Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé pour étudier le comportement des animaux pendant leur période nocturne d'activité. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et des carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés de construction du nid et permettent aux animaux de s'exposer au milieu extérieur de leur propre volonté . Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les principaux dispositifs instrumentaux utilisés dans ce projet (gustomètre et lickomètre) permettent des mesures non-invasives.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Endodontie régénérative par l’utilisation d’un cône électrospinné et fonctionnalisé avec de l’acide tannique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris nude subit une chirurgie de trente minutes créant une poche sous-cutanée dans le dos pour y implanter une racine de dent humaine de dix millimètres. Le porteur attend une douleur post-opératoire modérée et une gêne liée à la dent implantée. Il teste un dispositif de régénération de la pulpe dentaire, développe des cultures en bioréacteur mais affirme que le modèle animal reste le "seul" à permettre de vérifier la formation d'une pulpe vascularisée.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester un dispositif médical implantable pour permettre la régénération de la pulpe dentaire. Le dispositif est un cône qui peut être inséré dans la racine d'une dent à la fin d'un traitement de racine lorqu'un saignement aura été provoqué dans le canal par le chirurgien-dentiste pour former un caillot sanguin. Ce cône permettra la prolifération du tissu nouvellement formé, comme lors d'un processus de cicatrisation, sur la longueur totale du canal c'est-à-dire jusqu'à la couronne dentaire. Ce cône permet également la libération d'un agent antibactérien, l'acide tannique, pour assurer la désinfection totale du canal. Le projet a donc également pour objectif de vérifier l'innocuité de l'agent antimicrobien sur la régénération tissulaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est la validation d'une nouvelle approche de traitement des nécroses pulpaires. Le traitement permettrait de ne plus utiliser de matériaux pour une obturation canalaire à la fin d'un traitement de racine qui a encore un taux d'échec de 10%. La régéneration du tissu permettra une réponse biologique à des agressions futures de la dent (carie ou fracture) et favorisera donc le maintien de la dent sur l'arcade sur une période plus prolongée.
Procédures
La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes. Le geste proposé dans cette demande est la création d’une poche sous-cutanée dans le dos de la souris pour l’implantation d’une racine d’une dent humaine. L’idée ici est de permettre la mise en place de phénomènes de vascularisation pour étudier la mise en place d’un néo-tissu pulpaire dans le canal radiculaire de la racine implantée.
Impact sur les animaux
La procédure employée est peu invasive puisqu’il s’agit de réaliser une poche sous-cutanée dans le dos de l’animal. On peut donc s’attendre à une douleur post-chirurgicale d’intensité modérée. L’insertion d’une dent (longueur 10 mm) va générer une gène mais qui ne devrait pas avoir de retentissement sur l’activité de la souris. La procédure peut néanmoins générer un stress au moment de l’acte chirurgical.
Devenir
Les animaux utilisés sont des souris nude qui ont un phénotype dommageable. Ces animaux ne peuvent dont pas être adoptés. Aux vues du type d’expérience menée, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable non plus. L’ensemble des animaux qui seront utilisés seront donc mis à mort. Ceci a été discuté avec le vétérinaire en charge de l’animalerie dans laquelle se passera l’expérimentation.
Remplacement
Nous développons actuellement des dispositifs de culture tridimensionnelle en bioréacteur pour permettre de recréer l’environnement du canal radiculaire d’une dent humaine. Mais les processus de formation du tissu ne peuvent être étudiés jusqu’au bout car le volume du tissu empêche l’oxygénation et l’élimination des déchets de l’activité métabolique cellulaire. Ceci n’est possible que dans un modèle animal. Le modèle choisi ici d’implantation ectopique d’une dent humaine est déjà très couramment utilisé dans le monde et est le seul qui permet à ce jour de vérifier la formation d’une pulpe dentaire vascularisée (Ling Lei et al. Mesenchymal stem cell characteristics of dental pulp and periodontal ligament stem cells after in vivo transplantation, Biomaterials 35(2014) 6332-6343; Qian Li et al. Multifunctional peptide-conjugated nanocarrieres for pulp regeneration in a full-length hman tooth root. Actac Biomaterialia 17 (2021) 252-265).
Réduction
Les premières étapes du projet ont été conçues pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés. Elles doivent permettrent en effet d'affiner la formulation du dispositif médical pour n'avoir à en tester qu'un seul type, avec une dose d'acide tannique (agent antimicrobien) définie comme efficace et non toxique. Les premières phases de la régénération tissulaire (cicatrisation) induites par notre procédure ont été testées in vitro pour s'assurer du potentiel de réussite de cette expérimentation. Etant donné le nombre d'analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques...) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d'animaux a été évalué à 54 souris pour 2 ans. De plus, uniquement l'implant validé in vitro, sera testé en implantataion sous cutanée. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l'infiltration éventuelle de cellules inflammatoires. Le n a été déterminé pour avoir une triplicat par temps d'implantation.
Raffinement
Afin de nous assurer du bien-être des animaux au cours de ce protocole nous avons mis en place les mesures suivantes : - la chirurgie sera réalisée sous anesthésie/analgésie en prenant garde que la température de l'animal soit maintenue tout au long de la procédure. De plus un traitement analgésique pos-opératoire sera mise en place. - L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement en période post-opéraoire puis tous les 3 jours jusqu'à la fin de la procédure. - Des points limites pédictifs ont été mis en place pour interrompre la procédure et soulager les animaux. Enfin comme nous utilisons des animaux immunodéprimés, il est prévu que l'hébergement se fasse en portoirs ventilés permettant de préserver la qualité de l'air de la cage et ainsi d'éviter aux animaux d'être infectés par des pathogènes ambiants potentiels.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris. Le modèle murin d’implantation sous cutanée est lui très simple et favorise donc une diminution drastique de l’inconfort de l’animal (procédure rapide, avec peu de dommage tissulaire associé). De plus cela permet d’utiliser des modèles pour lesquels la réponse immunitaire a été altérée ce qui est essentiel dans notre cas puisque la source d’agent chimiotactique est humaine. Nous utiliserons des souris nude. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.
Etude de l’impact d’une exposition chronique au PFOS sur la réponse immunitaire à la vaccination anti-grippale chez des souris B6C3F1.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.
Objectifs
De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.
Bénéfices attendus
Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Procédures
Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.
Remplacement
La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Réduction
Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.
Raffinement
Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.
Régulation de l’homéostasie et du développement épithéliale par la membrane basale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection pour éteindre un gène, puis des injections destinées à marquer les cellules, y compris des souriceaux nouveau-nés gavés tous les deux jours. Le porteur indique que ces manipulations peuvent entraîner une perte ou une prise de poids, une diarrhée et une déshydratation. Il relève de la recherche fondamentale sur la membrane basale de l'intestin, utilise des organoïdes "dans la mesure du possible" mais affirme qu'ils ne reproduisent pas cette membrane.
Objectifs
L'épithélium intestinal est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile de la lumière intestinale. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours chez la souris. L'épithélium recouvre les villosités, des protubérances en forme de doigts qui s'avancent dans la lumière de l'intestin, et les cryptes, des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif de l’épithélium. Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire, les grands changements morphologiques tel que l'invagination des cryptes, ne se produisent que pendant la période postnatale. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM). Elle est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un support structural à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient le sens des cellules. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme, elle change tout au long de la vie et de la maladie. Le rôle que joue la composition de la membrane basale dans le comportement des cellules épithéliales reste inexploré. Les cellules épithéliales intestinales présentent un cycle de vie étroitement régulé. Les cellules souches se divisent dans les cryptes et se différencient en cellules sécrétrices et absorbantes à la sortie des cryptes. Les cellules migrent ensuite activement vers l'extrémité de la villosité, où elles meurent après s'être détachées de la BM. Nous ne savons pas ce qui détermine les limites des cellules en division dans la crypte, limite la perte des cellules à l'extrémité de la villosité, caractérise les signaux qui guident la migration des cellules et déclenche le commencement de la migration cellulaire au cours de la vie de l'animal. Dans ce projet, nous visons à évaluer le rôle de certaines des protéines qui composent la membrane basale sur le comportement des cellules pendant le développement postnatal et la vie adulte.
Bénéfices attendus
Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général et de la Laminine 5 en particulier dans la régulation de l'homéostasie intestinale peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.
Procédures
Dans la première procédure, l’élimination ciblée du gène d’intérêt sera générée par l’administration de tamoxifène par gavage oral ou par injection IP. Pour la suppression complète, le tamoxifène sera administré une fois par jour pendant 5 jours consécutifs à des souris adultes. Pour l’élimination à long terme des gènes de la membrane basale, nous mettrons également en œuvre un régime d’administration à long terme de tamoxifène à l’aide d’aliments contenant du tamoxifène. La nourriture tamoxifène remplacera la nourriture normale pendant 4 à 12 semaines. Jusqu’à 54 heures avant la mise à mort de l’animal, les souris seront injectées une fois avec un produit non irritant ni toxique pour marquer les cellules proliférantes et suivre leur migration vers le haut des villosités. 2 heures avant de mettre à mort l’animal, les souris seront injectées une fois (selon la première injection) pour marquer les cellules proliférantes. Dans la deuxième procédure, des expériences similaires seront réalisées sur des souris néonatales. Les animaux seront gavés 2 à 3 fois toutes les 48h.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection ou gêne de courte durée dans la gorge lors des gavages. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphatiques, neurones, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L'objectif principal de ce projet étant d'identifier la régulation de la membrane basale sur l'homéostasie et le développement de l'intestin, la réduction du système in vitro pourrait nous empêcher d'identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l'intestin. Nous utiliserons des organoïdes dans la mesure du possible, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n'existe aucun moyen de reproduire la membrane basale in vitro, mais seulement certains de ses composants de base. Pour l'utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d'organoïdes provenant des mêmes souris mutantes et de type sauvage pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour optimiser le nombre d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajustés au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de déterminer les conditions expérimentales optimales. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d'animaux de tous les génotypes d’intérêt. Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris, comme le suivi de la prolifération, de la migration. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Il n’y a pas besoin d’analgésique ou d’anesthésiant puisque l’administration de tamoxifène se fera par voie orale avec l’aide d’une canule souple en plastique non traumatisante. Pour les injections intrapéritonéale, une administration d’analgésique ou d’anesthésiant reviendrait à faire subir l’injection 2 fois. Aucun change de cage ne sera effectué la première semaine après la naissance afin de limiter le stress. De plus, la mère sera manipulée à chaque fois avant les souriceaux, afin d’y incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon par la mère. La bonne prise en charge des souriceaux par la mère sera vérifiée Les procédures décrites ont un faible impact sur le bien-être des animaux. Néanmoins, comme il s'agit d'un nouveau modèle génétique pour l'ablation de gènes, nous ne pouvons pas déterminer si l'ablation du gène entraînera un phénotype nocif. Par conséquent, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant l'administration du tamoxifène. Pour l'effet à long terme, les animaux seront surveillés tous les 3-4 jours. Leurs poids, ainsi que leur comportement général et leur apparence seront notés et les signes d'inconfort selon la grille de score seront évalués. Si des signes de douleur sont identifiés, l'animal sera mis à mort dans les 24 heures.
Choix des espèces
Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen intéressant reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l'Homme, tant au niveau génétique qu'au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l'organe, font qu'il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l'Homme. En outre, la disponibilité d'une variété d'outils génétiques, ainsi qu'un assemblage complet et annoté du génome, de même qu'une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet. Une petite cohorte de 5 animaux nouveau-nés de chaque groupe d'âge : P2, P7, P14, P21 sera utilisée pour tester le rôle de la membrane basale sur le développment de l’intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change considérablement, et nous aimerions tester l’implication de la membrane basale dans ces changements. Pour tester l'effet de la perte de Lama3 pendant l'homéostasie, nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 4 mois. À cet âge, le système intestinal est considéré comme mature et sa fonction est connue, ce qui constitue une bonne base de comparaison lorsque nous modifions la composition de la membrane basale.
Validation biologique chez le rat d’une sonde intracérébrale de détection radioactive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Quinze d'entre eux sont opérés puis tués sans reprise de conscience, les trente autres sont réveillés puis reçoivent des injections de produits radioactifs et des acquisitions répétées. Chaque implantation de sonde intracérébrale dure jusqu'à deux heures, et le porteur indique qu'elle peut provoquer une hémorragie cérébrale, une hypothermie et une douleur, les rats réveillés étant isolés à cause du dispositif fixé sur leur tête. Il cherche à valider une nouvelle sonde de détection radioactive et qualifie le passage in vivo de "nécessaire" après des essais sur des crânes imprimés en 3D.
Objectifs
En neurosciences, la Tomographie par Émissions de Positons (TEP) est une modalité d’imagerie majeure pour étudier les processus cérébraux in vivo, comme les mécanismes de communication des neurones ou l'occupation des récepteurs, grâce aux émissions produites par un produit radioactif injecté au préalable. Par son caractère non invasif, elle permet de réaliser des études longitudinales chez l’animal dans différentes conditions et à différents temps. Cependant, les acquisitions TEP nécessitent une anesthésie ou une contention importante pour maintenir le rongeur dans une position fixe afin d’assurer une bonne qualité d’image. Ainsi, il n’est pas envisageable de combiner cette technique d’imagerie avec des études comportementales sur animaux éveillés. Les sondes intracérébrales apparaissent alors comme un outil complémentaire pour explorer la distribution des produits radioactifs injectés. Elles peuvent être implantées dans des régions cérébrales cibles et permettre l'enregistrement local de cinétiques radioactives. Une fois la sonde implantée, il est alors possible d’étudier l’animal éveillé et de répéter des mesures, sur plusieurs jours, en les associant à des tâches comportementales. Les premiers modèles de sondes étaient très simplifiés, ce qui limitait la qualité de l’information spatiale fournie, et très fins, ce qui les rendait fragiles et difficiles à manipuler. Fort de ces observations, ce nouveau projet a pour objectif de développer, de produire et de tester, in vivo chez le rat, de nouvelles sondes biocompatibles, plus résolues spatialement et plus robustes. Grâce à une liaison sans fil entre la sonde et le dispositif d’enregistrement, les animaux auront une liberté totale de mouvement et donc un stress moindre. L’objectif de ce projet est donc de valider biologiquement cette nouvelle sonde radiosensible avec différents produits radioactifs et cela en deux phases : une phase aiguë en réalisant des enregistrements comparés et simultanés sonde/TEP chez le rat anesthésié et une phase chronique chez le rat éveillé.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de valider une nouvelle sonde intracérébrale radiosensible dédiée à l’imagerie chez le rat. Cet outil de détection permettra des mesures locales de la concentration de molécules radiomarquées chez l’animal éveillé et libre de ses mouvements. Cette technique permettra de coupler des acquisitions de cinétiques radioactives chez l’animal vigile avec des études comportementales ou de répéter des acquisitions dans des conditions expérimentales différentes. Comparée à la TEP, cette sonde offrira une meilleure résolution spatiale (en fournissant des données locales dans la zone cérébrale cible implantée) et une plus haute résolution temporelle.
Procédures
Tous les animaux du projet (45 rats) seront soumis à une chirurgie ayant pour but l'implantation de sondes de détection radioactive dans des régions cibles du cerveau (opération d'une durée de 1h30 à 2h s'il y a réalisation d'un chapeau de protection des cartes électroniques reliées aux sondes, étape nécessaire quand il y a réveil de l'animal). Une partie des animaux (15 rats), aura, dans la foulée, un examen d'imagerie comprenant une acquisition couplée sonde/TEP d'une durée de 1h10 à 1h40 selon le produit radioactif injecté. L'autre partie des animaux (30 rats) sera réveillée à l'issue de la chirurgie et recevra, une semaine plus tard minimum, une injection de produit radioactif en vue d'acquérir des cinétiques et cela en condition vigile (durée : 1h10 à 1h40 selon le produit injecté). Cette acquisition sera répétée une semaine plus tard exactement dans les mêmes conditions.
Impact sur les animaux
Stress physique / thermique : Pour les chirurgies intracérébrales, les nuisances peuvent être l’apparition d’hémorragie intra-cérébrale ou d’une hypothermie. Douleur : À la suite de la chirurgie, les animaux peuvent présenter une douleur, une inflammation ou une mauvaise cicatrisation. Faim : Pour les acquisitions avec le glucose radioactif, les animaux devront être mis à jeun 4h avant l’injection, afin de minimiser les variations de métabolisme glucidique non spécifiques. Isolement : Pour la procédure chez l'animal vigile, un chapeau (poids du dispositif : 2 grammes) sera réalisé sur la tête de l’animal pour protéger les sondes implantées. La présence de ce chapeau, après le réveil de l’animal, représente également des nuisances, non seulement par l’encombrement sur la tête, mais aussi par le fait que cela nous oblige à isoler les rats afin d’éviter qu’ils se détruisent leur chapeau mutuellement. La cicatrisation peut également entraîner des grattages au niveau du scalp. Lors des acquisitions vigiles, les rats porteront un gilet où sera fixé le dispositif d’enregistrement et qui sera relié aux câbles de la sonde.
Devenir
A l’issue des expérimentations, les animaux seront mis à mort par injection d’euthanasiant après anesthésie gazeuse.
Remplacement
Plusieurs étapes préliminaires de validation de la sonde ont été effectuées avant le passage à l’animal. Pour contrôler la sonde, des tests électroniques et l’acquisition de cinétiques dans des solutions contenant de la radioactivité ont été faits en laboratoire. Parallèlement, afin de s’exercer à la chirurgie, des simulations d’implantations stéréotaxiques ont été faites avec des sondes fictives et sur des crânes de rat imprimés en 3D. Maintenant, l’étape suivante est le passage in vivo. Cette étape est nécessaire pour vérifier différents points. Tout d’abord, il faut s’assurer de la biocompatibilité des sondes lorsqu’elles sont implantées dans le tissu cérébral et tester leur résistance quand elles sont fixées et placées dans le chapeau sur la tête d’un rat qui va se déplacer dans sa cage ou lors de tests comportementaux. De plus, ces sondes permettent d’acquérir des cinétiques radioactives, c’est-à-dire la distribution tissulaire du radiotraceur dans l’organisme et nécessite donc une circulation sanguine ainsi que des processus actifs pour avoir une barrière hématoencéphalique active.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. Cependant, ce protocole est très exploratoire et il est donc difficile de définir un nombre d’animaux à partir de tests statistiques. Concernant les premières expérimentations, les acquisitions de cinétiques et de déplacement du produit radioactif i jecté seront réalisées chez le même animal, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Pour les expérimentations chez l’animal vigile, qui ne seront faites que si les cinétiques obtenues lors des premières expérimentations sont satisfaisantes, le nombre d’animaux a été fixé à 10 maximum, ce qui représente un nombre classique d’animaux pour des études d’imagerie.
Raffinement
En amont des chirurgies stéréotaxiques, les animaux recevront une unjection d'analgésique et / ou d'anti inflammatoire selon si l’animal est réveillé ou non en fin de chirurgie ainsi qu'une injection d'anesthésique local avant l’incision du scalp. Durant la chirurgie, les rats seront placés sur un tapis chauffant. Pour les expérimentations vigiles, les animaux seront opérés en début de semaine afin de mettre en place une observation étroite et quotidienne lors du réveil et les jours suivants, jusqu’à complète récupération (utilisation d’une grille de score). Des doses supplémentaires d'analgésique et d'anti inflammatoire seront pratiquées en fin de chirurgie et le lendemain matin. Afin d’éviter tout grattage de la cicatrice, les griffes seront coupées lors de l’anesthésie. La présence du chapeau fixé sur la tête (implant nécessaire pour protéger les cartes électroniques), nécessitera l’isolement des rats. Lors de cette période, l’enrichissement dans les cages sera renforcé et les cages placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact (visuel, olfactif…) avec leurs congénères. Les animaux seront stabulés dans des cages à couvercle plat afin d’éviter qu’ils se heurtent ou s’accrochent avec leur chapeau.
Choix des espèces
Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies du système nerveux central et de nombreuses données précliniques existent pour cette espèce. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes adultes, pesant au moins 250 grammes afin que la taille du cerveau soit compatible avec la résolution de la caméra micro-TEP préclinique (1,5 mm) et assez importante pour permettre l’implantation des sondes.
Rôle du cortex insulaire dans l’effet protecteur d’un traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie, une auto-administration de cocaïne et des injections de cocaïne ou de yohimbine, avant des tests comportementaux de rechute. Le porteur indique que la cocaïne peut provoquer une perte de poids et une hyperactivité transitoires, et que la yohimbine reproduit chez la souris des effets observés chez l'humain. Il vise à établir le rôle des neurones de l'insula portant les récepteurs à la progestérone, et renvoie au long terme les retombées thérapeutiques annoncées contre la rechute à la cocaïne.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les récepteurs à la progestérone sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones de l’insula qui expreiment les récepteurs à la progéstérone est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.
Procédures
Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal quotidien. Les échantillons seront collectés à l'aide d’un coton-tige stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Toutes les procédures chirurgicales, seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.
Impact sur les animaux
La prise de cocaïne peut engendrer plusieurs nuisances expérimentales : 1) une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial 2) une hyperactivité qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme : l'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire. Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.
Raffinement
La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.
Choix des espèces
Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.