Procédures modérées

5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées vivantes à l'animalerie des clients ou collaborateurs via un transporteur. Elles arrivent porteuses de tumeurs greffées par des tiers et reçoivent une à dix séances de radiothérapie sous anesthésie gazeuse, l'établissement facturant ces irradiations comme une prestation de service à des sociétés privées ou des collaborateurs. Le porteur affirme qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la radiothérapie et que la douleur ne justifie pas d'analgésique, tout en prévoyant la mise à mort des souris qui se dégraderaient. Sur le remplacement, il conclut que l'étude des médicaments ne peut se passer d'un "organisme entier" aux fonctions physiologiques intactes.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie (RT) préclinique est de développer l’association de la RT avec des traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (administrations simultanés ou en décallé, et dans ce cas optimiser l'ordre d'administration) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la RT afin de pouvoir proposer en essai clinique des schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT 3D guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 200km autour de notre établissement. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant ce type de combinaisons, font appel à nos services pour délivrer des traitements de RT sur leur souris. Ce projet concerne donc exclusivement le traitement par radiothérapie qui sera délivré pour nos clients ou collaborateur. Ces éances de radiothérapie sont réalisées sur des souris anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin d'éviter les mouvements durant le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer et optimiser de nouvelles combinaisons et sera une base solide pour le développement d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront traités par Radiothérapie externe (+/- imagerie par scanner pour des technique complexe de radiothérapie), sous anesthésie gazeusev(Isoflurane 2.5%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. Les animaux pourront recevoir de 1 à 10 séances de radiothérapie.

Impact sur les animaux

Les tumeurs formées par certianstypes de cellules peuvent former des nécroses en surface. En cas d’apparition de nécrose rune évaluation de potentielle de douleur sera réalisée par palpation de la tumeur nécrosée. Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront renvoyés à l’animalerie d’origine des collaborateurs / clients à l’issue de la procédure via un transporteur spécialisé.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des immunothérapies nécessites l’étude sur des animaux présentant un système immunitaire efficace. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral composé à la fois de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires, de fibroblastes, collagène et vaisseaux sanguins. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables de l'activité des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Les effectifs des animaux qui seront irradiés seront calculés et justifiés dans les DAPs de nos collaborateurs/clients. Ceux-ci seront calculés en fonctions des souches d’animaux utilisés, modèles tumoraux et des efficacités attendues de leurs combinaisons.

Raffinement

La totalité de la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie isoflurane afin maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Après une séance de RT, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. Si besoin (cas de traitement par plusieurs séances de RT avec un les animaux pourront être hébergés dans notre animalerie afin de limiter le stress induit par les transports. Sinon les animaux, hébergés dans leur cage d'origine, avec les mêmes congénères, retourneront à l'animalerie des collaborateurs via un transporteur spécialisé, garantissant le maintien d'une tempéraure stable. Le trajet dure entre 5 minutes et 15 minutes. Dans le cas d'un hébergement dans notre animalerie, les souris seront maintenues dans des cages de 8-10 individus en présence d’enrichissement. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs syngéniques reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La prise tumorale dans des souris avec un fonds génétique stable et homogène permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à l’âge déterminé par l’équipe qui greffe les tumeurs (âge dépendant du modèle, de la nécessité ou non d’avoir un système immunitaire mature…)

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées et porteuses d'une tumeur greffée, elles reçoivent des injections sous anesthésie, des prélèvements de sang et des séances d'imagerie, pour tester un composé associant anticorps et anticancéreux dit "théranostique". Le porteur indique qu'une gêne liée à la tumeur, jusqu'à un début de nécrose, est possible. Il affirme qu'aucune méthode alternative, "même les plus complexes", ne remplace ce modèle animal, l'efficacité étant déjà validée in vitro.

Objectifs

Certains composés anticancéreux sont très toxiques et peu solubles : ils sont couplés à des anticorps, spécifiques des tumeurs, afin de faciliter leur accumulation principalement dans la tumeur. Ces composés appelés ADCs (antibody- drug conjugates) peuvent être marqués par un fluorophore afin de suivre en temps réel la substance active : ils deviennent alors des composés dits "théranostiques" (Possédant une activité thérapeutique et un marqueur de monitoring). Dans ce projet, nous souhaitons apporter la preuve de concept d'une nouvelle association anticorps-composé anticancéreux (ou ADC). Nous souhaitons tout d'abord étudier la pharmacocinétique et la distribution de nouveaux ADCs, puis en étudier l'efficacité anti-tumorale et la toxicité globale. Nous projetons de travailler avec un maximum de 4 ADCs différents.

Bénéfices attendus

Selon l'anticorps utilisé, plusieurs types de cancers peuvent être ciblés. Aujourd'hui nous démarrons le projet avec un anticorps ciblant les tumeurs du sein et de l'ovaire. Notre principal objectif est de valider la nouvelle construction chez l'animal car les essais sur cellules sont très favorables. Nous souhaitons obtenir un composé théranostique (thérapeutique et diagnostique), avec une forte activité anti-tumorale et une bonne tolérance générale. Il est crucial d'améliorer la thérapie antitumorale en général, et en particulier dans le cadre des cancers qui métastasent rapidement dans le cerveau comme les tumeurs du sein. Un agent théranostique permet en plus de son activité de valider le ciblage de l'ensemble des lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à des préhensions, des anesthésies et des injections (sous cutanée (x1) et intraveineuse (maximum 3)) sous anesthésie gazeuse. 24 animaux seront soumis à 4 prélèvements de 50 uL de sang sous anesthésie gazeuse. Les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse : elles durent quelques secondes. L'ensemble de ces gestes a une durée individuelle inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'immunodéficience des souris pourrait être source de nuisance. Lors des anesthésies, préhensions, injections IV, du stress et/ou des douleurs légères pourraient survenir. Le composé en lui meme pourrait entrainer des nuisances : toutefois la dose choisie sera testée sur un nombre restreint d'animaux (1ere étude d'imagerie), ce qui devrait nous assurer de sa tolérance. Cette dose est, de plus, choisie par rapport à l'état de l'art qui utilise principalement ce dosage (voire des doses supérieures). Une gêne liée à la tumeur en sous cutané pourrait subvenir telle qu'un défaut de marche, ou un début de nécrose, ce qui sera pris en compte dans les points limites.

Devenir

Tous sont anethésiés puis mis à mort en vue du prélèvement et de l'analyse des organes ex vivo.

Remplacement

L'efficacité des composés est déjà validée in vitro sur des cellules qui expriment l'antigène reconnu par l'anticoprs et son inefficacité est démontrée lorsque les cellules n'expriment pas la cible. Pour aller plus proche de la clinique humaine, notre projet étant une investigation thérapeutique et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, et microenvironnement tissulaire, système d'élimination de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.

Réduction

La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 3 animaux par groupe pour obtenir des résultats fiables et permettre une analyse statistique, tout en limitant le nombre d'animaux utilisé. Chaque composé sera testé individuellement afin de maitriser le nombre d'animaux à gérer; lorsqu'un composé sera validé comme "ADC théranostique pertinent", l'étude sera arrêtée ce qui pourrait réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse notamment en mettant en place des points limites (mesures de la taille tumorale, état général de l'animal, suivi du poids de l'animal). De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés par groupe, dans des cages qui comportent des objets permettant de se cacher et de faire des abris (tunels, coton etc). L'ensemble des personnels qui manipulent les animaux ont été formés au respect et au bien être des animaux, ou sont sous surveillance de personnes qui ont été formées. Les souris immunodéprimées étant fragiles, elles sont maintenues dans un environnement protégé (portoir ventilé).

Choix des espèces

Les souris permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Souris de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines.

1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.

Bénéfices attendus

Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.

Procédures

Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.

Devenir

Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.

2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.

Procédures

Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.

Remplacement

La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.

Réduction

Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées

Raffinement

Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.

Une lignée de souris du syndrome de Wolfram, qui perd la vue et l'audition vers un mois et développe un trouble vestibulaire source d'hyperactivité, est exploitée pour tester cinq composés chimiques fournis par des chimistes. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Après un marquage à l'oreille, elles reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine pendant quinze jours, un test de vision éveillées à un mois et deux anesthésies à trois jours d'intervalle pour un test d'audition d'une heure et un test de vision de 30 minutes, des tests que le porteur dit tous "indolores". Le texte justifie des lots de 10 souris par groupe par plus de vingt ans de mesures, sans détailler comment ces groupes aboutissent à 800 souris pour cinq composés.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par gavage, des mesures répétées de la tumeur et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester un composé inhibiteur associé à une immunothérapie. Les bénéfices annoncés pour les patients ne répondant pas à l'immunothérapie restent formulés au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit encore les interactions de l'environnement tumoral et que ce modèle est "nécessaire".

Objectifs

Dans le microenvironnement tumoral, les fibroblastes associés à la tumeur favorisent la malignité en sécrétant des facteurs empêchant le système immunitaire de s'attaquer aux tumeurs fibreuses et favorisant ainsi les métastases. Des immunochemothérapies ont été testées, lors d'un précédent projet collaboratif, pour améliorer la réponse immunitaire naturelle qui reconnaît le cancer comme étranger. Cela n'a produit que peu d'effet dans ces cancers riches en fibroblastes. L'inhibition (par un de nos composés en développement clinique) d'une enzyme spécifique a permis de stopper la migration et invasion de cellules tumorales (métastases) et de cibler l’activation des fibroblastes pour aider le système immunitaire. Inhiber cette enzyme pour des cancers fibreux est alors devenu une voie de traitement envisagée. Le cancer du côlon est connu pour présenter des tumeurs solides présentant une enveloppe fibreuse exprimant fortement cette enzyme. Pour tester l’effet des composés inhibiteurs de cette enzyme spécifique sur les fibroblastes et la réponse de la tumeur à l’immunothérapie dans ce cancer précisément, nous allons utiliser le modèle murin sous-cutané de cancer du colon, qui développe des tumeurs immunogènes répondant à des anticorps inhibiteurs d’un contrôle immunitaire.

Bénéfices attendus

Un composé inhibant cette enzyme spécifique est important à tester dans le contexte de cancers fibreux, dans un objectif de ciblage des fibroblastes associés à la tumeur. Ceci pourra affecter les caractéristiques de la malignité, y compris la prolifération des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases, mais aussi l'effet sur le phénotype du myofibroblaste dans la tumeur et la réponse immunitaire anti-tumorale. Cela peut atténuer la réaction tissulaire stromale entourant les tumeurs solides, permettant la pénétration accrue des molécules de chimiothérapie dans le noyau tumoral pour faciliter la destruction des cellules cancéreuses. Le composé peut également permettre de rompre cette barrière fibreuse construite par les fibroblastes et de permettre à nouveau un environnement immunocompétent, conduisant le système immunitaire à voir les cellules cancéreuses comme étrangères pour augmenter la mortalité de ces cellules chez les patients qui n'ont pas répondu à l'immunothérapie.

Procédures

induction après rasage : une injection sous cutanée dans le bas du dos (moins de 30 secondes), pesées et traitements par gavage (voie orale, 2 maximum par jour, moins de 10 secondes chacun), mesure de la tumeur 2 fois par semaine - 30 secondes / prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse profonde (à J7 pour 4 animaux par groupe et en final pour tous) 3 minutes - et de la tumeur après la mort.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à plusieurs types de contraintes engendrant du stress et douleur légère : injection de cellules tumorales en sous-cutané sous anesthesie gazeuse, traitements par voie orale grâce une sonde oesophagienne, injections intraperitonéales, contention pour la mesure de la tumeur et la pesée des souris.

Devenir

mise à mort pour prélevement de sang et de la tumeur.

Remplacement

Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur le développement tumoral afin de traiter in fine des tumeurs humaines. L'environnement tumoral qui va se développer va interagir avec plusieurs éléments de l'organisme. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs de Nox au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données ADME des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Différents tests statistiques nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les animaux seront monitorés quotidiennement (à chaque traitement) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont une espèce de choix pour l’étude de modèles cancéreux de par les nombreuses études déjà réalisées. Ce modèle de xénogreffe est très bien décrit dans la littérature. Les souris femelles seront utilisées car nous avons une expérience antérieure d’études in vivo sur ce modèle avec des souris femelles. Nous utiliserons des animaux de 8 à 10 semaines. Il est maintenant prouvé que les processus de fibrose sont réversibles dans le jeune âge et les biomarqueurs associés à la fibrose ont un turnover plus faible en vieillissant. Il n’y a pas nécessité d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.