Procédures modérées

22 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, vingt tuées et deux réutilisées. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau, puis deux IRM dont une avec injection d'un marqueur d'hypoxie, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur décrit une gêne liée à la protubérance tumorale au flanc sans entrave à la mobilité, et justifie la mise à mort par le risque infectieux propre à ces animaux immunodéprimés. Il présente l'IRM comme non invasive, ce qui autorise la réutilisation de deux souris, et affirme que la mesure du flux sanguin est impossible sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.

Sur 224 souris, 72 reçoivent dans un muscle de la patte une injection de notexine, une toxine qui déclenche la régénération du muscle, et sont suivies 3, 12 ou 24 jours, 48 reçoivent dans ce même muscle un virus porteur d'un gène, suivies cinq semaines, et toutes sont marquées par tatouage des phalanges et génotypées par un prélèvement de queue. Le projet étudie deux lignées qui reproduisent un dérèglement de lipides en cause dans la myopathie myotubulaire, où les souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour disséquer leurs muscles. Un lot de souriceaux de deux semaines est en outre exploité pour établir des cultures de cellules musculaires. Le porteur écrit que la toxine "pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons)", et précise dans le même passage que le muscle injecté "retrouve sa fonction normale" au bout d'une vingtaine de jours.

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.

Procédures

Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.

Impact sur les animaux

Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.

Devenir

A l'issue des procédures 1 2 et 3, les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.

Remplacement

En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.

Raffinement

L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales, la pose d'un implant biodégradable et selon les groupes une radiothérapie, avec un suivi IRM hebdomadaire et un transport de 95 kilomètres pour l'irradiation externe. Le porteur décrit fatigue, perte de poids et prostration possibles, et fait tuer tous les animaux pour éviter la souffrance liée à la croissance du glioblastome. Il juge le recours à deux modèles de rats "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.

Objectifs

Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".

Objectifs

Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.

Bénéfices attendus

Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.

Procédures

Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.

Impact sur les animaux

Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.

Remplacement

L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.

Réduction

Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.

1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis l'implantation de microcapsules chargées d'un anticancéreux et jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour tester une libération locale prolongée du médicament. Le porteur décrit une gêne modérée liée à la croissance tumorale et une toxicité possible des principes actifs, avec des amaigrissements. Il annonce au conditionnel des bénéfices pour les patients et affirme qu'aucune méthode substitutive ne reproduit le corps entier, jugeant l'usage d'animaux vivants "indispensable".

Objectifs

La plupart des agents anticancéreux sont administrés en intraveineuse : l'agent anticancéreux empreinte donc la circulation sanguine pour atteindre sa cible. Ce mode d’administration est limité entre autres par sa toxicité pour les tissus sains, ces derniers recevant également du sang contenant l'agent anticancéreux injecté. Une solution pour améliorer la réponse des patients et limiter les effets secondaires délétères est d’administrer l'agent anticancéreux localement dans les zones à traiter (dans ou proche de la tumeur). On peut ainsi contrôler précisément les tissus en contact avec l'agent anticancéreux. Notre objectif est de faire la preuve de concept d'une technologie s'inscrivant dans cette approche. Il s'agit de microcapsules remplies d’une substance active d'intérêt, et qui comprennent une ouverture permettant une libération locale prolongée et controlée au niveau de la tumeur. Ces microcapsules seront implantées dans les tissus entourant la tumeur et/ou à l'intérieur de celle-ci. Nous émettons l'hypothése que cette technologie peut s'avérer supérieure à l'injection seule par voie intraveineuse, à la fois en termes d'efficacité antitumorale et de toxicité au niveau du reste de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus chez le patient sont les suivants : - Diminuer les risques de toxicité systémique (cardiaque notamment) liés à une dose trop élévée, en détournant le médicament des organes non-cibles. - Les microcapsules ne demanderaient qu'une seule implantation, ce qui diminue la géne occasionnée par rapport à une chimiothérapie classique nécéssitant plusieurs rendez-vous. Dans le cas de tumeurs profondes, les microcapsules éviteraient également aux patients de devoir subir plusieurs interventions chirugicales potentiellement invasives. Les microcapsules présentent également plusieurs bénefices par rapport à l'administration intraveineuse ou locale : - Une absorption biopharmaceutique de la molécule d'intéret plus élevée. - Une plus grande stabilité biologique (la molécule est "protégée" à l'intérieur de la microcapsule). - Une spécificité et une précision plus élevées dirigées contre les cellules cancéreuses. - Une plus longue demi-vie, une amélioration de l'absorption des molécules cibles et une diminution des doses efficaces.

Procédures

Au démarrage de toutes les procédures, injection de microcapsules, une fois. L'implantation durera environ 15 min par animal. Des prélèvements de sang seront fait sur certains animaux sous anesthésie locale (maximum 3 prélèvements). Chaque prélèvements durera environ 5 min. Certains animaux seront aussi greffés avec des cellules tumorales sous anesthésie locale, une fois, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures impliquent l’injection chez la souris de lignées tumorales ou de microcapsules en sous-cutanée, ainsi que de principes actifs en intraveineux ou intratumoral. L’injection des lignées tumorales va conduire à la croissance de tumeurs. Ces tumeurs peuvent induire une gène modérée. Il existe également une possibilité de toxicité systémique ou locale des principes actifs utilisés (chimiothérapie), avec des amaigrissements possibles.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses et études sur leurs organes et tissus.

Remplacement

Le but de ce projet est de maximiser l'efficacité des microcapusles et des principes actifs en mi,nimisant toutes les formes de toxicité afin d'aboutir à une méthode thérapeutique utilisable chez l'homme plus efficace et moins toxique que les injections locales ou systémiques. Comme il n’est pas possible à ce jour de reproduire toutes les fonctions du corps entier par des méthodes substitutives, l’utilisation d'animaux vivants est indispensable.

Réduction

Nous ne mettrons pas en oeuvre pas les conditions qui ne se justifieraient pas suite aux résultats des premières expériences, ce qui pourra permettre de réduire le nombre de souris indispensables à la réalisation du programme expérimental. Dans toutes les expériences, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le logiciel G*Power a été utilisé pour déterminer combien d'animaux sont strictement nécessaires à la réussite statistique des expériences.Les résultats seont analysés par comparaison entre plusieurs groupes faite par une analyse de variance suivie d’un post-hoc test pour les comparaisons entre 2 groupes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement.

Raffinement

Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). Toutes les injections (sous-cutanées, microcapsules et cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les souris seront suivies 4 à 5 fois par semaine afin de suivre différents signes de douleurs et d’inconfort (perte de poids, hypothermie, voussure du dos, pelage souillé). Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un point de colle chirugicale sera appliqué sur la cicatrice cutanée provoquée par le passage de la seringue contenant les microcapsules, afin d'aider à la cicatrisation et de minimiser la gêne pour l'animal.

Choix des espèces

Le modèle murin (souris), avec son génome similaire au génome humain à 99%, constitue un modèle de référence pour les pathologies humaines. Le choix de cette espèce pour ce projet se base sur 2 arguments : - les principes actifs envisagés dans le projet ont tous été validés et testés dans la littérature sur des souris, nous permettant de minimiser les inconnues (efficacité, doses, toxicité etc), les risques et donc le nombre d'animaux utilisés. - les lignées cellulaires tumorales répondant aux principes actifs envisagés ont été développées dans cette espèce. Les animaux commandés seront des adultes de 5 à 6 semaines, ce qui correspond à des animaux à un stade de développement mature. Cet âge est celui qui est traditionnellement utilisé dans la littérature sur ce type de principes actifs/tumeurs. Ces animaux seront acclimatés durant une semaine avant d'être inclus dans le protocole.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de vancomycine déclenchant une insuffisance rénale aiguë, des prélèvements d'urine par pression abdominale, et pour une partie une incision dorsale pour microscopie in vivo. Le porteur indique que l'atteinte rénale peut provoquer une perte de poids et une déshydratation, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il cherche à comprendre puis à prévenir cette toxicité et affirme que l'étude de la fonction rénale rend l'usage de la souris "indispensable".

Objectifs

L’insuffisance rénale aiguë médicamenteuse est une cause fréquente de morbi-mortalité et d’hospitalisations. La vancomycine est un antibiotique largement utilisé dans la prise en charge des infections bactériennes à germes multirésistants. Malgré le développement de formules purifiées, le risque de toxicité rénale reste élevé et se manifeste par une insuffisance rénale aiguë . Aucune approche thérapeutique de l'insuffisance rénale provoquée par la vancomycine n’a actuellement été mise au point. Le seul mécanisme généralement proposé était la toxicité directe de la vancomycine sur un type particulier de cellules rénales. Or l'action de la vancomycine sur le rein semble plus complexe . Il a été montré un nouveau mécanisme de toxicité médiée par l'accumulation de l’antibiotique et de protéines dans le rein. Un modèle animal de souris a permis de valider la formation après une injection rapide de vancomycine de dépôts dans les cellules rénales et de caractériser ce nouveau mécanisme de toxicité. Cependant, le rôle d'autres protéines dans l'accumulation de la vancomycine reste inconnu. Une meilleure compréhension mécanistique de cette toxicité rénale ainsi que la recherche de stratégies thérapeutiques innovantes visant à la prévenir ou la prendre en charge constitue un enjeu important. Le projet vise à répondre à ces questions en explorant plusieurs hypothèses : 1) Quel est le rôle des protéines dans l'accumulation rénale de vancomycine? 2) La modulation de l'entrée et de la sortie de vancomycine dans les cellules rénales peut elle modifier la toxicité de la vancomycine? 3) La modification de l'acidité urinaire peut elle diminuer l'accumulation de vancomycine et la toxicité rénale en conséquence?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une approche thérapeutique innovante actuellement inexistante dans la néphropathie induite par la vancomycine et avancer dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de cette néphropathie afin d'en réduire les conséquences. Même s’il est résolutif, un épisode d’insuffisance rénale aiguë sévère s’accompagne d’un surrisque d’évolution vers l’insuffisance rénale chronique et constitue un réel problème de santé publique. Une meilleure prise en charge de ces insuffisance rénale aiguë peut également réduire les coûts liés aux hospitalisations prolongées et le nombre de patients évoluant vers l’insuffisance rénale chronique qui est associée à une baisse de la qualité de vie et des coûts élevés de prise en charge. Enfin, ces nouvelles stratégies thérapeutiques obtenues grâce à nos résultats pourront être mises à l’épreuve ultérieurement lors d’études cliniques.

Procédures

1- Injections intra péritonéales de médicaments dilués dans du serum physiologique sur animal vigile : dans une procédure, maximum trois fois par jour pendant un maximum de 2 jours consécutifs plus une dernière injection pour l'anesthésie finale. Ce qui fait un total de 7 injections sur 3 jours. Dans les autres procédures, 3 injections sur 3 jours. l'injection est rapide(quelques secondes). 2- Un prélèvement d'urine par pression abdominale sur animal vigile pendant quelques secondes. Un prélèvement d'urine est prévu à J0 ou J1 et J3, ce qui fait deux prélèvements en tout. 3- Pour la microscopie in vivo (6 animaux par lot de 20) réalisée une seule fois, une incision dorsale est pratiquée après une analgésie et une anesthésie générale. Cette étape est réalisée sur un plateau thermostaté à 37 degrés. La préparation et l'observation durent 20 minutes environ 4- Prélèvement du sang sous anesthésie ( 30 secondes environ), sur un plateau thermostaté; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analsyes necéssaires.

Impact sur les animaux

Le stress généré par les injections intrapéritonéales (contention et douleur au site d'injection) . Stress lié aux traitements dans l'eau de boisson (néophobie du rongeur). L'incision cutanée (pour une partie des animaux) et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - douleur provoquée par l'incision cutanée - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation. - stress induit par des manipulations quotidiennes. Complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

Une partie des expériences concernant la précipation de la vancomycine selon le pH a pu être effectuée in vitro mais pour étudier l'impact des différents traitements proposés sur la fonction rénale, l'utilisation de la souris est indispensable. Il est nécessaire de suivre le comportement de la vancomycine du compartiment sanguin au compartiment rénal qui est un système tissulaire complexe composé de plusieurs types cellulaires.

Réduction

Les expériences précédentes qui ont mis en évidence la précipitation de la vancomycine dans les cellules rénales ont permi d'évaluer l'hétérogénéité de certains paramètres étudiés. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence des différences entre les groupes et s'assurer de la reproductiblité des résultats d'une série à l'autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants chez des mâles. Puis nous confirmerons les résultats sur un troisième lot de 10 souris femelles. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des test statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie au moins une semaine avant le début de la procédure. L’animalerie est agréée par le ministère de l'agriculture. Elle dispose d’un système de ventilation et de traitement de l’air avec une hygrométrie et une température contrôlées quotidiennement. Hygrométrie 55 plus ou moins 10 pour cent et température 20-24 degrés. Cycle d’éclairage rongeurs 12heures par jour. Isolation phonique. Les animaux seront hébergés dans des cages en portoir ventilées (5 souris maximum par cage) avec un enrichissement par litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes tels que des morceaux de bois pour leur permettre de ronger, et des billes de cellulose pour les obliger à les déployer pour faire des nids. Une surveillance quotidienne du bien-être animal (pesée et comportement) sera réalisée par le personnel de l’animalerie et le porteur de projet. Le critère d'arrêt est la perte de poids de plus de 20 pour cent par rapport au poids initial (avant traitement). La durée du traitement par la vancomycine est très court et ne devrait pas engendrer une insuffisance rénale trop sévère et dommageable pour les souris. Pour assurer le bien être des animaux, les étapes les plus délicates que sont l'imagerie in vivo et l'euthanasie seront réalisées sous anesthésie générale avec une antalgie en plus pour l'incision dorsale nécéssaire à l'observation au microscope.

Choix des espèces

Ce modèle animal de souris déja utilisé a permis de valider antérieurement la formation de dépots dans les cellules rénales après un bolus de vancomycine et de caractériser le phénomène obstructif conduisant à l'insuffisance rénale. Afin d'assurer la reproductibilité des résultats, il apparait préférable de poursuivre la recherche sur ce même modèle de souris. Un modèle in vitro ne permet pas de modéliser la néphropathie à la vancomycine du fait de la complexité et diversité cellulaire du rein. 8-12 semaines d'age, période d'acclimatation d'une semaine. Etat adulte de maturation du rein chez la souris et âge avec lequel le modele a été validé.