Procédures modérées

2 476 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à quatre vaccins ARN administrés dans le poumon sous anesthésie et subissent des séances répétées de tomographie et des prélèvements sanguins. Le porteur affirme sortir les animaux de l'expérimentation avant que les tumeurs n'atteignent leur physiologie, si bien qu'aucune modification du comportement ne serait détectable. Il présente comme espoir de "soigner un nombre important de patients" et revendique l'impossibilité de tester cette preuve de concept ailleurs que sur un système vivant complet.

Objectifs

Les vaccins à ARN messager ont permis de juguler la mortalité liée au SARS-COV2 dans les pays développés. Ces technologies basées sur les ARN ont permis pour la première fois de produire un vaccin efficace en un temps extrêmement court. Cette adaptabilité des technologies ARN les rend très attractives pour la lutte contre le cancer. Ce projet a pour objectif à court terme de prouver qu’il est possible d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique dans le cancer du poumon en utilisant une nouvelle approche vaccinale. Notre stratégie expérimentale doit donc permettre de : 1) Fournir la preuve de concept qu’il est possible de soigner le cancer du poumon en utilisant une stratégie de vaccin ARN. 2) Caractériser précisément les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cette nouvelle stratégie vaccinale pourrait fonctionner de façon optimale.

Bénéfices attendus

Par le développement de cette nouvelle technologie vaccinale, nous pensons être en mesure de soigner un nombre important de patients pour lesquels il n’existe pas de traitement efficaces sur le long terme à ce jour. Ces investigations réalisées chez la souris seront une pierre angulaire dans l’implémentation d’un vaste projet impliquant 7 équipes en Europe et visant à aboutir sur la validation d’une nouvelle stratégie vaccinale. En somme, si comme nous l’espérons, nous fournissons par ce projet la preuve que notre nouvelle formulation vaccinale peut permettre de lutter plus efficacement contre le cancer du poumon, nous serons en mesure de proposer cette technologie aux patients dans un temps très court.

Procédures

La transplantation des lignées tumorales sera effectuée par injection intraveineuses (une fois sur chaque animaux) ou sous-cutanée (une fois par animal). Cette injection nécessite une contention des souris de deux minutes maximum. Une petite proportion des animaux subira un prélèvement de sang par incision de la veine caudale. Ce geste ne sera répété qu’une fois avec un intervalle de deux semaines. Cela nécessite de placer les animaux sous une lampe chauffante durant 5 minute puis une contention de deux minute. La majorité des animaux subiront des tomographies (technique d’imagerie non invasive) permettant de suivre l’évolution de la croissance tumorale nécessitant une anesthésie gazeuse qui aura lieu à une fréquence d’une fois toutes les deux semaines et sera répétée 6 fois maximum. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement. L’administration dans le poumon de notre vaccin sera réalisée sans chirurgie mais demande une anesthésie des animaux. Pour réduire le nombre de d’anesthésies, nous combinerons la vaccination avec la tomographie. Il y aura un maximum de 4 vaccinations par animal espacées de deux semaines. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables pour les animaux sont : - L’initiation et le développement du cancer du poumon. Nous avons adapté nos protocoles et mis en place des techniques de suivi des animaux de sorte que nous considèrerons les animaux seront sortis de l’expérimentation avant que la croissance des tumeurs ne cause une atteinte significative à leur physiologie. Suivant nos procédures, aucune modification du comportement des animaux ni de leur performance physique n’est détectable en lien avec le développement de la maladie car nous arrêtons les protocoles à un stade suffisamment précoce du développement de la maladie. - Une infection au site d’injection ou de prélèvement de sang - Les anesthésies répétées

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour les besoins expérimentaux nécessitant l’accès aux sang, rates, ganglions et au poumons.

Remplacement

Nous développons une approche vaccinale qui a pour objectif de changer les interactions en le l’hôte et la tumeur par le développement d’une réponse immunitaire anti-tumorale. La preuve de concept de notre stratégie ne pourrait donc être réalisée en système in vitro ou par simulation informatique car elle doit être intégrée dans un système physiopathologique complet. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les différentes formulations de vaccins ont été ou sont en cours d’évaluation in vitro. A ce jour nous avons validé 13 formulations et continuons d’en identifier d’autres. Pour des raisons de éthiques et de faisabilité, nous ne dépasserons pas ce nombre de formulation différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 2476 souris sur 5 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos vaccins. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer des tests statistiques relevant pour définir la significativité de nos résultats. Pour réduire le nombre d’animaux, notre projet est conçu de sorte à ce que les premières étapes de validation permettent de réduire le nombre de conditions possibles par l’optimisation des modèles et la sélection d’une seule formulation de vaccin à partir de 13 candidats validés in vitro. Enfin ce projet a pour but de fournir une preuve de concept dans un modèle préclinique justifiant le transfert de notre technologie chez les patients. Hors comme l’utilisation de ce modèle nécessite un parcours expérimental de 6 mois avec les animaux génétiquement modifiés, nous avons défini une construction de notre projet qui repose sur des étapes de validation de nos candidats vaccin sur des temps cours en privilégiant des procédures ne nécessitant pas d’intervention lourde sur les animaux. Ainsi, même si réduit au maximum le nombre d’animaux reste élevé, nous travaillerons à l’optimisation de l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage) en milieux enrichis, la durée d’hébergement des animaux est réduite au minimum. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress et d’agressivité. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique, mise en place par la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être envisagée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation. Néanmoins, un arbre décisionnel basé sur le poids, la prostration, la détection de difficulté respiratoire, l’agressivité et l’isolement décidera de l’arrêt de toute expérimentation de l’utilisation d’analgésique voir de la mise à mort des animaux. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans notre étude est le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets vaccinaux sur le long-terme. Ces souris immunocompétentes sont greffées avec des tumeurs murines de même fond génétique. Les souris que nous utilisons offrent à ce jour le meilleur modèle de cancer du poumon autochtone pour adresser les questions biologiques que nous développons ainsi que pour fournir la preuve de concept de l'efficacité de notre nouvelle thérapie. En effet, dans ce modèle, le développement tumoral à lieux dans des individus présentant un système immunitaire intacte mimant parfaitement la maladie humane, non seulement d’un point de vue immunitaire mais aussi au regard des mutations conduisant à l’apparition des tumeurs.

4 truies et 27 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les truies sont infectées deux fois par un streptocoque puis vaccinées, les porcelets infectés à leur tour, avec des écouvillonnages amygdaliens et vaginaux et des ponctions sanguines répétés tout au long de la reproduction. Le porteur indique que l'infection reste quasi asymptomatique chez les truies mais peut rendre les porcelets malades, ceux qui atteignent les points limites étant alors mis à mort. Il justifie le projet par les pertes économiques en élevage porcin et le "potentiel zoonotique" de la bactérie, et affirme qu'aucun remplacement in vitro n'est possible.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un autovaccin visant un streptocoque administré à des truies en gestation. De précédentes investigations ont mis en évidence une excellente protection des porcelets issus de truies infectées par une bactérie de type streptocoque avant leur mise à la reproduction puis vaccinées contre cette bactérie en cours de gestation. Ces connaissances inédites doivent absolument être consolidées avant d’être diffusées auprès des professionnels de la filière porcine qui sont fréquemment confrontés à cette bactérie responsable de troubles méningés chez le porcelet. L’objet de cette saisine est donc d’apprécier l’efficacité, sur des porcelets, d’un autovaccin administré en gestation à leur mère préalablement infectées par ce streptocoque. Elle comporte une seule procédure expérimentale impliquant un total de 4 truies et de 27 porcelets.

Bénéfices attendus

Les bactéries de type streptoccoque étudiées ici, sont répandues dans les élevages porcins et transmissibles de l’animal à l’homme. Elles sont responsables de graves affections (méningite, septicémie et polysérites) pouvant entraîner des pertes économiques importantes (réduction des performances zootechniques des animaux affectés, détérioration de la qualité des carcasses, élévation du taux de pertes et de saisies à l’abattoir, etc.). Le contrôle de l’infection des animaux par cette bactérie est généralement difficile et les mesures de prévention aléatoires. En élevage, l’antibiothérapie constitue un des éléments de l’arsenal thérapeutique. Cependant, son utilisation doit être limitée en raison de résistances développées par les bactéries vis-à-vis de certains antibiotiques. Une des méthodes alternatives pour lutter contre ce streptocoque repose sur la vaccination et plus précisément, dans la mesure où aucun vaccin commercial n’est disponible, sur l’utilisation d’autovaccins. Ces derniers sont préparés à partir de germes pathogènes isolés d’un sujet malade dans un élevage donné et sont administrés aux animaux de ce même élevage. Les autovaccins sont utilisés pour prévenir les infections à ces streptocoques chez les truies ou les porcelets sans que leurs efficacités ne soient clairement démontrées. Acquérir des connaissances sur les autovaccins visant les infections à ce type de streptocoque apportera des éléments pour aider à mieux gérer ces maladies désastreuses en élevages et à potentiel zoonotique.

Procédures

Prélèvements sur truies vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés chez les 4 truies avant le jour de l’infection soit 5 semaines avant les inséminations artificielles, puis 8 fois au cours du cycle de reproduction (soit 9 interventions). Des ponctions sanguines seront réalisées pour suivre la réponse immunitaire (soit 11 interventions). Des écouvillonnages vaginaux seront également réalisés avant le jour de l’infection puis 4 fois au cours du cycle de reproduction (soit 5 interventions). Les truies seront infectées deux fois par voie veineuse et seront vaccinées deux fois par voie musculaire. Prélèvements sur porcelets vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés sur chacun des porcelets avant le jour de l’infection puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 5 interventions). A chaque jour de prélèvement, un écouvillonnage amygdalien sera effectué sur les porcelets infectés, les porcelets contacts et les porcelets témoins (n=27 animaux). Des ponctions sanguines seront réalisées 24h après la naissance puis une fois par semaine à compter du sevrage jusqu’à la fin de l’expérimentation pour suivre des paramètres immunologiques et deux fois au cours de la première semaine suivant l’infection (suivi de la bactériémie), soit 9 interventions au total. Les porcelets seront infectés une fois par voie veineuse. Afin de limiter la contention des animaux, les écouvillonnages amygdaliens seront réalisés en même temps que les ponctions sanguines. Les durées des interventions sont estimées chez les truies à 30 secondes pour l’infection par voie veineuse, 20 secondes pour la vaccination par voie musculaire, 1 minute et 30 secondes pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine et 10 secondes pour l’écouvillonnage vaginal (sans contention). Pour les porcelets, les durées des interventions sont estimées à 30 secondes pour l'infection par voie veineuse et entre 30 secondes et 1 minute pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine.

Impact sur les animaux

L’infection expérimentale avec le streptocoque étudié est quasiment asymptomatique chez les truies et est généralement symptomatique chez les porcelets de 6 semaines. Cependant, la sévérité clinique peut être limitée lorsque la dose bactérienne injectée est ajustée à la dose minimale infectante. C’est la dose que nous utiliserons dans cette procédure expérimentale. Toutefois, une attention de tous les instants sera apportée au suivi clinique quotidien de chaque porcelet. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction des symptômes cliniques relevés. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris le week-end. Dans les cas où l’infection conduirait à une altération importante de l’état de santé, à une atteinte des points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Cet acte est nécessaire afin d'obtenir des prélèvements de bonne qualité impactant directement les résultats des analyses.

Remplacement

L’expérimentation consistant à évaluer l’efficacité d’un vaccin et étudier les réponses immunologiques induites, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcelets utilisés tout en menant une étude suffisamment puissante pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Nos études antérieures montrent qu’il est indispensable d’avoir au minimum trois porcelets infectés par truie et des groupes de 6 porcelets pour (i) considérer la variabilité inter-individuelle des animaux et (ii) obtenir une pression d’infection suffisante permettant de reproduire une colonisation des amygdales et/ou la maladie. Ce projet impliquera au total 4 truies et 27 porcelets.

Raffinement

Les truies et les porcelets seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique rapproché. Les truies, abreuvées à volonté, seront examinées a minima une fois par jour pendant les deux semaines suivant l’infection. Les porcelets seront nourris et abreuvés à volonté. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection (y compris le week-end). Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction de l’évolution leur état de santé . Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris les week-ends. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Une récompense sous la forme de friandise sera proposée aux truies et aux porcelets une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible de la bactérie de type streptococoque étudiée dans cette saisine. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Les truies et les porcelets impliqués dans l’expérimentation auront, au moment de l’infection, respectivement ente 28 et 34 semaines de vie et entre 6 et 7 semaines de vie . Le modèle expérimental a été précédemment validé à ces âges ce qui permet de s’affranchir d’une étape de validation.

1 800 poissons sauvages, des truites, blageons et chabots, vont être capturés et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants. Chaque individu est anesthésié, mesuré, pesé, puis incisé au ventre pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, en restant hors de l'eau de trente secondes à une minute. L'objectif déclaré est d'évaluer si une passe à poissons aménagée sur un cours d'eau alpin laisse remonter ces espèces vers leurs zones de reproduction. Le porteur affirme que l'étude comportementale in situ est "indispensable" et sans alternative, et prévoit une mortalité post-opératoire faible ainsi que des pertes de marqueurs.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité d’une passe à poissons (rampe à plots) aménagée pour rétablir la migration piscicole dans un cours d’eau alpin. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur passifs dans des poissons sauvages. Les espèces cibles sont la truite et deux espèces accompagnatrices (blageon et chabot). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante. Le projet doit permettre d’évaluer scientifiquement le fonctionnement de cet ouvrage piscicole.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, et des petites espèces accompagnatrices (blageon et chabot), c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer encore davantage la migration piscicole et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles favorables à l’amont, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1800 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des dispositifs de montaison/dévalaison doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le blageon et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. A noter également que peu de données existent quant aux comportements et capacité de montaison du blageon et du chabot. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer une franchissabilité théorique : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Pour le blageon et le chabot, il est difficile de préciser un taux de montaison, ces espèces étant encore trop rarement étudiées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm par exemple). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

Les espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta), le blageon (Telestes souffia) et le chabot (Cottus gobio). La truite est l’espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Le blageon et le chabot sont des espèces accompagnatrices de la truite, régulièrement capturées en pêche de sondage au niveau du site d’étude. Ces espèces sont moins bonnes nageuses que la truite et leur étude permet de nuancer l’évaluation de l’efficacité de la rampe à plots. Autrement dit, le franchissement du seuil par ces espèces confirmera le bon fonctionnement du dispositif de franchissement. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. Pour les blageons et les chabots, les individus seront marqués avec des tags de 13 mm, la taille minimum de marquage étant alors calée à 80 mm. Pour ces espèces, cette taille correspond à des animaux de 2 ans et plus, considérés comme adultes et reproducteurs. Tout comme la truite, les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

14 rats et 7 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent une plaie cutanée au bistouri sur le dos et une injection intradermique, les souris une injection de médicament anticancéreux destinée à provoquer une nécrose de la peau, pour tester un nouvel appareil de mesure de l'élasticité des tissus comparé à deux dispositifs du commerce. Le porteur annonce des douleurs localisées, une perte de poids modérée et un stress lors des manipulations. Il présente l'outil comme plus simple et moins coûteux et renvoie au conditionnel son application clinique chez l'humain.

Objectifs

La caractérisation des propriétés mécaniques des tissus mous, à l’instar de l’élasticité cutanée, présente un intérêt majeur pour de nombreuses spécialités médicales et chirurgicales. Sur une peau cicatricielle (séquelles de brûlures, cicatrices post-opératoires ou post-traumatiques, cicatrices chéloïdes, greffes de peau, etc.) sa mesure répétée au cours du suivi objective l’efficacité d’un traitement et conforte l’examen clinique. Les technologies actuelles sont cependant imprécises, coûteuses et complexes à manipuler et il n’y a pas de protocole fiable utilisé en pratique clinique pour effectuer cette mesure. L’objectif du projet est de valider un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous, indolore et non invasif. Une étude mécanique préalable a été réalisée sur des échantillons inertes mimant des tissus biologiques (Agar Agar de différentes concentrations). Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur tous les échantillons, et de meilleures performances qu'avec les technologiques utilisées actuellement. L'objectif de ce nouveau protocole est de valider ce dispositif sur des tissus biologiques in vivo (modèles murins : la souris et le rat) en le comparant au Cutomètre® et au Myoton®, deux outils permettant la mesure de l’élasticité cutanée et des tissus mous. L’ensemble de ces expérimentations animales permettra d’assurer la cohérence en vue d’un futur essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus après analyses statistiques seront en premier lieu de confirmer l’applicabilité de notre dispositif à l’étude de l’élasticité des tissus mous in vivo sur un modèle murin, ainsi que la simplicité de cette mesure. Nous souhaitons démontrer la précision et la fiabilité de cet outil par comparaison au Cutomètre® et au Myoton®, pour un coût et une complexité de mise en oeuvre moindres. Ces résultats positifs permettront à court terme de développer une étude chez l’homme en pratique clinique usuelle. Notre outil pourrait permettre d’évaluer instantanément et in vivo l’élasticité d’un tissu mou biologique. Il pourra aisément s’intégrer au diagnostic et au suivi thérapeutique de l’ensemble des pathologies nécessitant une évaluation objective de ces propriétés mécaniques, et permettre un gain majeur en qualité de vie pour les patients cibles. Il s’agit d’un dispositif très simple puisqu’il se compose d’une masse équipée d’un ou plusieurs capteurs de force, et est ainsi peu coûteux en comparaison aux technologies déjà présentes sur le marché. A terme, son utilisation pourra s’étendre à d’autres domaines tels que la médecine régénérative, la cosmétologie ou la chirurgie carcinologique, par exemple via la délimitation en temps réel des marges tumorales lorsque celles-ci sont incertaines à l’inspection et à la palpation.

Procédures

Dans le premier protocole, il est effectué sur le dos des rats une perte de substance cutanée rectangulaire (plaie mécanique au bistouri). Elle est réalisée sous sédation chimique, après rasage à la crème dépilatoire et désinfection cutanée. Elle est ensuite recouverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation. Il est également réalisé une injection intradermique ventrale d'un produit volumateur. Dans le second protocole, il est effectué sur le dos des souris une injection intradermique d'un médicament anticancéreux afin d'induire une zone de nécrose cutanée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus et prévisibles, et cibles des stratégies de raffinement sont : - Douleurs localisées au niveau des zones étudiées (perte de substance cervico-thoracique droite et point d'injection ventral droit chez le rat, zone de nécrose dorsale droite chez la souris) - Perte de poids modérée - Stress majoré lors des manipulations initiales et lors des mesures régulières en cours d'étude.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'étude : 14 rats et 7 souris, au terme des 2 mois de l'étude.

Remplacement

Les alternatives non animales pour notre étude ont été exploitées lors de la phase initiale du projet, lors de l'étude mécanique préliminaire in vitro réalisée sur des échantillons d'Agar Agar de différentes concentrations mimant des tissus biologiques. Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur toutes les concentrations en Agar et de meilleures performances qu'avec les méthodes élastométriques. L'objectif est désormais de valider notre outil sur le modèle animal, afin de le valider in vivo au cours d'un processus de cicatrisation complet. Ces résultats, s'ils sont positifs, permettront à terme de développer une étude chez l'homme en pratique clinique usuelle.

Réduction

Le nombre d'animaux requis pour notre étude a été calculé afin d'obtenir des analyses statistiques significatives en ce qui concerne la précision de nos mesures. Il est cohérent avec les protocoles suivis dans les études animales comparables. La durée totale d'étude de 2 mois a été retenue pour permettre un recul suffisant après cicatrisation, et ne pas prolonger inutilement le protocole. Elle est cohérente avec les délais des études comparables compris entre 1 mois 1/2 et 3 mois.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation des animaux avec des conditions de lumière et de température standardisées sera respectée en début d'étude, afin de limiter le stress animal. Une sédation sera réalisée avant chaque geste invasif, adaptée à la douleur. Concernant la perte de substance réalisée pour le protocole n°1, elle sera couverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation à la phase initiale. Passé le délai de 14 jours, et puisque les mesures seront alors plus espacées, un pansement hydrocolloïde transparent sera appliqué entre chaque mesure. En cas de douleur postopératoire, un antalgique sera administré à l'animal selon les bonnes pratiques usuelles. La réaction locale aux points d'injection sera étudiée à chaque temps et des photographies seront réalisées. Le choix d'une perte de substance dorsale a été fait pour éviter le risque de grattage de la lésion par le rongeur. Les cages comporteront des tiges de coton pour nidifier et des maisonnettes en carton.

Choix des espèces

Les modèles murins (souris et rats) sont très adaptés au suivi cicatriciel et permettent des manipulations aisées. Il s'agit des modèles principalement utilisés dans les études comparables de la littérature. Les rats et les souris seront à l'âge adulte. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des animaux plus jeunes, et leur surface corporelle ainsi que leurs capacités de cicatrisation seront optimales à ce stade de développement.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse pour reproduire une obésité, elles subissent des mises à jeun de quatorze heures, dix-sept contentions pour quatorze prélèvements sanguins en quatre jours, des administrations orales et des injections, avant un prélèvement de sang et d'organes terminal. Le porteur décrit comme seuls effets attendus le stress lié à l'identification, à l'anesthésie, à la contention et aux prélèvements. Il revendique l'identification des cellules intestinales de l'action de l'insuline comme "essentiel" pour concevoir des stratégies thérapeutiques, retombée formulée au futur.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité, grâce à l'utilisation de divers modèles de souris soumises à un régime riche en graisse afin de mimer l'obésité nutritionnelle chez l'Homme. L’intestin, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote, assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Cette altération de la barrière intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité, cet état inflammatoire favorisant la prise de poids et certains désordres métaboliques associés. L’insuline contrôlant la fonction barrière de l'intestin chez la souris, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, hyperglycémie) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité. Nous espérons montrer que le dévéloppement d'un diabète (perte d'action de l'insuline) entraine une détérioration de la fonction barrière de l'intestin qui favorise ou accélère la prise de poids et l'augmentation de la glycémie. Notre projet identifiera les cellules intestinales impliquées dans l'action de l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Identification ( 1 contention de 30 secondes pour 1 prélèvement ), Sur animaux vigiles : 1 mise a jeun de 14h, 1 mise à jeun de 4h, 17 contentions de 30 secondes pour 14 prélèvements de sang (en 4 jours), 1 administration orale de 45 secondes de produit et 2 injections de 45 secondes de produit. Sur animaux anesthésiés : un prélèvement sanguin (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Il y a un stress lors de l'identification, de l’anesthésie, de la contention, des prélèvements sanguins et des injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques et inflammatoires (obésité/diabète). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des jeûnes répétés, de nombreuses contentions pour gavages et injections, l'implantation d'une pompe sous la peau et, pour certaines, une infection intestinale provoquant perte de poids, léthargie et saignements rectaux, avant le prélèvement du sang et des organes. L'objectif est de comprendre le rôle d'un facteur du glucose dans la perméabilité de l'intestin liée au diabète. Le porteur affirme que ces dérégulations complexes ne peuvent être résolues par des cultures in vitro, malgré des travaux préalables sur organoïdes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Identification (1 contention de 30 secondes) Sur animaux vigiles : 20 animaux (2 mises à jeun: une de 5h et une de 14h, 11 contentions de 30 secondes pour 6 administrations orales de produit, 3 prélèvements de sang et 2 injections de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 20 animaux (1 mises a jeun de 14h, 10 contentions de 45 secondes pour 6 administrations orales de produit, 3 prélèvements de sang et 2 à 6 injections de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 80 animaux (1 mise a jeun de 14h, 2 mises à jeun de 4h, 10 contentions de 45 secondes pour 8 administrations orales de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 120 animaux (2 mises a jeun: une de 4h et une de 14h, 8 contentions de 45 secondes pour 6 administrations orales de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal); Sur animaux anesthésiés : 20 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)), 220 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention, des injections et des gavages. Concernant les modèles d’infection par un pathogène intestinal, l’apparition de signes généraux de souffrances (tels que poils ébouriffés ou hérissés, perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement, diarrhées et saignements rectaux) est envisageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose. Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. De plus, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

Une chirurgie du cerveau de 20 minutes avec pose d'électrodes pendant une heure, quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré jour et nuit, et des tests de comportement chaque mois pendant une semaine au plus : 918 souris, issues notamment de deux lignées présentées comme reproduisant la maladie d'Alzheimer, vont passer par ces étapes. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue par une dose létale d'anesthésique. L'équipe veut corriger par thérapie génique l'hyperexcitabilité du cerveau associée à la maladie, en faisant exprimer aux souris une protéine altérée chez les patients, et émet l'hypothèse que ce traitement pourra s'appliquer un jour à des personnes à risque, avant les premiers symptômes. Le texte ne nomme ni cette protéine, ni les deux lignées, ni les tests de mémoire, décrits seulement comme des séances d'une dizaine de minutes répétées trois fois, à côté d'une heure de déplacement libre dans une arène.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.