Procédures modérées

Ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour implanter des cellules ou un fragment de tumeur sur le côlon ou le pancréas, ablation de la rate après injection de cellules tumorales pour les métastases du foie, ou injection de cellules dans le péritoine : 400 souris immunodéficientes Swiss Nude reçoivent d'abord ces tumeurs dans un premier établissement. Transférées dans un second, elles reçoivent sous anesthésie une injection dans le péritoine tous les sept jours d'un composé d'imagerie, passent des séances d'imagerie sous isoflurane, puis une ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de leurs tumeurs sous caméra à fluorescence, 30 minutes par souris. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur cite comme effets possibles des chirurgies la souffrance, la perte de poids et l'infection, ainsi que les effets de grosses tumeurs et de métastases. Toutes sont tuées à la fin des procédures, pour vérifier à l'autopsie l'absence de reprise tumorale.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objet même de ce projet consiste à développer ces modèles tumoraux pus à utiliser ces Ac bimodaux pour pouvoir réaliser l’imagerie des tumeurs puis ensuite leur élimination par la chirurgie sous caméra. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou d’enlever la rate ou encore de ligaturer un morceau de tumeur sur le colon. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris ayant un déficit en système immunitaire, leur hébergement sera réalisé dans des cages sous couvercle filtrant et les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines. Ces souris ont déjà été utilisée lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines implantées en sous-cutané. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Les 20 souris de cette étude pilote sont des triples mutantes, issues de croisements de lignées génétiquement modifiées pour qu'on puisse activer, inhiber ou éliminer, de façon sélective et inductible, une classe de neurones de la peau poilue qui détectent les stimulations mécaniques faibles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, le porteur écrivant que "leur mise en liberté est inconcevable". Chacune reçoit du tamoxifène par une injection dans le péritoine puis trois gavages espacés de trois jours, un cathéter dans la veine de la queue sous anesthésie, et passe sous anesthésie une séance d'IRM de moins d'une heure trente, avant et après l'injection de sérum physiologique ou de clozapine-N-oxyde, un composé qui active ces neurones. L'étude doit vérifier qu'une IRM détecte la réponse du cerveau à cette activation, et ses résultats "conditionneront la mise en œuvre" d'un projet plus large d'IRM fonctionnelle sur les réseaux cérébraux de la douleur.

Objectifs

Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulations mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et la transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur post-lésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude pilote sont la prise en charge de la douleur qui est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra une série d'administrations de tamoxifène : une injection intra-péritonéale (I.P.) à P42 suivie de 3 gavages espacés de 3 jours, 3 jours après l’injection I.P. Un cathéter sera implanté sous anesthésie dans la veine caudale, pour l'injection d'un agent de contraste spécifique de la technique d'IRM. Une session d'imagerie (d'une durée inférieure à 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie) à l’état basal (avant injection) et après injection d'un composé appelé Clozapine-N-Oxyde (CNO), activant ces neurones somatosensoriels.

Impact sur les animaux

Les animaux seront examinés une seule fois par IRM avant et après administration de NaCl ou d’une solution de CNO. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses de tamoxifène, d'agent de contraste et de CNO utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie, ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les animaux seront tous euthansiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisée que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico car elles ne sont pas adaptées au suivi de cette étude. En effet, les organs-on-chips ou les organoïdes ne permettent pas de reconstituer les connexions neuronales complexes impliquant différents structures du système nerveux et ne reflètent donc pas la physiologie et le fonctionnement du cerveau dans son entièreté. Quant aux modèles informatiques pour la transduction d'un stimulus sensitif de la peau vers le cerveau, leur design nécessiterait des données in vivo, que nous n'avons pas mais espérons que cette étude nous en fournira.

Réduction

L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale au CNO), nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les animaux seront leur propre contrôle. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique non paramétrique pour mesures répétées adaptée aux petits échantillons.

Raffinement

Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels. Suite à l'injection de tamoxifène et de CNO, les animaux seront suivis régulièrement et l'évaluation de la douleur sera monitorée par une grille de score fournie en annexe : recours à l'utilisation d'analgésiques pour réduire la douleur et euthanasie de l'animal en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Chez la souris, la population des neurones somato-sensoriels ciblée dans ce projet est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.

150 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang à la queue, quatre injections sous-cutanées et un test de mémoire en piscine répété huit jours, avec un hébergement individuel de seize jours, pour étudier les différences de déclin cognitif au cours du vieillissement. Le porteur reconnaît que la contention destinée à étudier la réponse au stress est "forcément" génératrice de stress et signale un risque d'infection aux sites d'injection. Il conclut qu'une telle approche intégrée ne peut être menée in vitro ni in silico.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus de mémoire. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables alors que d’autres individus sont dits résilients car ils conservent une bonne mémoire au cours du vieillissement. La compréhension de ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles de mémoire liés à l'âge. Toutes les études menées ou en cours dans notre laboratoire se sont limitées au rat mâle du fait de l’impact du cycle hormonal sur cette formation de nouveaux neurones au cours de la vie. L’objectif de ce projet est d’étudier l’apparition chez la femelle de déficits de mémoire au cours du vieillissement avec deux populations dites vulnérable (mauvaise mémoire) et résiliente (bonne mémoire) et de voir si cela apparaît au même âge que le rat mâle.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santéle plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs quiaccompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre étude permettra d’étudier l’apparition de différences inter-individuelles chez la femelle au cours du vieillissement, de comparer les résultats à ceux obtenus chez le mâle et voir si ces différencesapparaissent dans une même fenêtre de temps.

Procédures

3 gestes techniques seront réalisés : *Prélèvement de sang à la queue : Le sang est prélevé à l’extrémité de la queue sur animal vigile (2 min). L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard (4x2 = 8min). *Injections sous-cutanées : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 4 injections (durée préhension de l’animal + injection = 3 min, durée totale par animal 4x3 = 12 min). *Test de comportement : il s’agit d’un test de mémoire. Les rats font chaque jour 4 essais, pendant 8 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans le test (temps maximum passé dans le test au cours d’une session = 4 x 90s = 360s = 6 min, temps total maximum passé dans le test = 8j x 6min= 48min). Généralement la durée totale moyenne passée dans la piscine est de 21min 20s (8j x160s en moyenne = 1280s = 21min20s).

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions et des injections (prélèvement de sang, injections sous-cutanées), il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention afin d’étudier la réactivité de l’axe corticotrope en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection (sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales (incision de la queue) s’infectent ou deviennent douloureux. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant 16 jours mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses réalisées sur leur cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’apparition de différences inter-individuelles mnésiques chez les femelles au cours du vieillissement. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des problèmes de santé inhérents au vieillissement : les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus. Une analyse préalable des données sera réalisée afin de vérifier la possibilité de poursuivre l’analyse. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les différences inter-individuelles apparaissent dès les premiers âges étudiés.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives enrichies (sizzle pad : lanières de papier kraft vierge) afin de réduire l’ennui et le stress. Une semaine avant le début du test comportemental, les animaux passeront en hébergement individuel enrichi (lanières de papier kraft vierge). Le contact visuel, olfactif et sonore entre les animaux sera maintenu. Les femelles seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect général et aspect du pelage) et manipulés mensuellement jusqu’à leur sacrifice. Elles seront stabulées dans une animalerie avec une température maintenue constante, une hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera illimité et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : en cas d’apparition d’une zone de dépilation et d’irritation au niveau du site d’injection sous-cutanée, nous appliquerons une pommade désinfectante et cicatrisante et ce jusqu’à disparition des symptômes et évaluerons la douleur de l’animal le cas échéant, avec des grilles. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’au sacrifice des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogenèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections sous-cutanées. Les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après ces injections. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement :1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent d’étudier les différences inter-individuelles et le recrutement des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises à jeun hydrique et isolées, elles passent dix-sept tests de double choix entre deux boissons pour mesurer leur préférence pour des "faux lipides", avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'isolement pendant les tests peut être source de stress et prévoit un enrichissement supplémentaire. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer la souris pour l'évaluation orosensorielle liée à l'obésité.

Objectifs

Des études récentes chez l’Homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) que les saveurs sont détectées. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Ainsi ces deux lipido-récepteurs pourraient représenter la cible pour développer de nouvelles molécules (agoniste / antagoniste) permettant de moduler le comportement alimentaire lipidique chez les obèses. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras, nous avons synthétisé de faux lipides (agonistes de lipido-récepteurs), à partir de d’acides gras naturels, capables d’interagir avec les lipido-récepteurs mimant le goût du gras sans apporter de calories car ils ne sont pas métabolisables. Nous avons démontré l’absence d’effets génotoxiques et tératogènes de ces faux lipides. Cette demande représente l’extension de la précédente autorisation accordée concernant les faux lipides A et faux lipides B et qui sont brevetés L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouvelles molécules biosourcées « faux lipides » sur la préférence des aliments gras, et portera essentiellement sur l’évaluation orosensorielle vis-à-vis de ces faux lipides chez souris C57/BL6. Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules réduisent l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules modifient la préférence pour les molécules lipidiques et réduisent à long terme l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Les animaux, seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel (test de double choix entre deux boissons) afin de déterminer si les souris présentent une certaine préférence pour les molécules d'intérêt. Pour ce faire, Les animaux seront soumis à une mise à jeun hydrique de 4h avant les tests et pendant le test orosensoriel (durée 4h) les souris seront individualisées, les croquettes seront retirées et auront à leur disposition une bouteille d’eau et une bouteille de solution « test » pendant le test. Chaque lot de 15 souris subira 17 tests de double choix, avec une pause de deux ou trois jours entre les tests. A la fin de l’étude Les animaux seront mis à jeun pendant 4h et soumis à un prélèvement de sang terminal en intra-cardiaque sous anesthésie à l’Isoflurane (3%). Enfin, après mise à mort de l’animal, des prélèvements d’organes auront lieu. Aucun autre prélèvement sur animal vigile n’est envisagé.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact chez les souris puisqu’on est amené à les mettre en cages individuelles (pendant 12 h) lors des tests de double choix. Les animaux peuvent subir un stress suite à l’individualisation pendant la durée des tests. Pour minimiser l'effet de ce stress, un enrichissement supplémentaire (igloo en cellulose en plus des sizzle pad) sera apporté.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal (souris) s’impose dans ce projet d’une part du fait que nos molécules « faux lipides » sont nouvelles et par conséquent il n’existe aucun outil pharmacologique qui aurait pu permettre la mise en place d’une étude clinique et d’autre part par le besoin d’analyser les mécanismes multifactoriels impliqués dans la perception gustative. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En effet, malgré les résultats obtenus, in vitro, utilisant des cellules gustatives, Il n’est pas possible de se limiter à des approches in vitro pour des évaluations orosensorielles de faux lipides

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux

Raffinement

Les animaux seront parfois isolés pendant la durée du teste double choix (4 h), cependant en dehors des périodes de tests Les animaux seront hébergés en groupes (3-4 souris par cage) dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose en plus des sizzle pad). L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière et dès l’apparition de signes précoces de souffrance (des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix lors de l’étude des évaluations orosensorielles et les investigations de la modulation du comportement alimentaire par les faux lipides et son incidence à long terme sur l’obésité. A la suite de ce projet nous envisageons dans une seconde étape de tester les molécules les plus préférées par les souris sur l’incidence de l’obésité dans le même modèle de souris. La souris est le modèle de l’obésité qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel.

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie induisant un modèle de maladie de Parkinson, jusqu'à 168 administrations d'un composé selon les voies et jusqu'à 49 tests comportementaux neuropsychologiques. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, inflammation, infection et perte de poids, et que les troubles induits altèrent la locomotion et la démarche. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible et que les animaux ne peuvent être réutilisés du fait de substances aux effets inconnus à long terme.

Objectifs

La maladie de Parkinson touche 1% de la population âgée de plus de 60 ans et 4% de la population des personnes de plus de 80 ans. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui progressivement entraine des troubles moteurs (tremblements, rigidité musculaire, impossibilité ou ralentissement des mouvements). Comme d’autres maladies neurodégénératives, il n’y a pas de traitement capable de stopper ou de guérir la maladie. Les traitements qui existent sont purement symptomatiques. Toutefois, les traitements existants entrainent des effets secondaires sérieux tels que dyskinésie (mouvements anormaux involontaires), désorientation et confusion. Plusieurs voies de recherche sont en cours pour le traitement de la maladie de Parkinson et incluent par exemple la thérapie génique, la greffe de neurones et le traitement par des molécules neuroprotectrices. Un des modèles animaux le plus utilisé dans la recherche sur la maladie de Parkinson est basé sur une lésion unilatérale et sélective par injection d’une neurotoxine dans le cerveau. Cette injection affecte chez le rat la même zone cérébrale que celle endommagée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et permet ainsi de mimer certains de leurs symptômes. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de diverses molécules sur le modèle de rat hémi-parkinsonien afin de sélectionner de nouveaux composés pour les essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui n’ont pas d’effets secondaires sur les animaux et qui permettraient de palier en partie ou totalement aux troubles moteurs et cognitifs de la maladie de Parkinson. Nous testerons aussi sur ce modèle des molécules en phase clinique pour la maladie de Parkinson, afin de mieux appréhender sa prédictivité.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration, du composé à tester sur animal vigile (sauf pour l’administration intraveineuse qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 12 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 49 tests de comportement neuropsychologiques (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 168 fois par voie per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou 84 fois par administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore 10 fois par intraveineuse. A savoir une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations, la durée est de moins de 30 second en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 12 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang dure 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. De plus les troubles induits peuvent gêner les animaux dans leur vie quotidienne : locomotion réduite et démarche altérée. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration et/ou un phénomène de mâchonnement ou une fausse route (pour le gavage). Un stress lié aux différentes manipulations et tests comportementaux peut également apparaitre.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Le développement de la maladie de Parkinson et ses symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (différentes zones cérébrales, muscle, …) et différents processus, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 à 20 animaux. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, en présence de traitements antalgiques avec une aide au maintien de la température corporelle de l’animal (tapis chauffant) et en garantissant la stérilité de l’intervention. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé, les animaux recevront un antalgique pour prendre en charge leur douleur. De plus les animaux reçoivent de la nourriture en gel pour faciliter leur récupération post-chirurgicale et de la nourriture en granulé est déposée sur la litière. Le poids corporel des animaux sera suivi. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. A côté de cela, il faut noter que nous avons une longue expertise de l’utilisation des rats dans ce modèle de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.

8 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sensibilisées à un allergène puis soumises à un déclenchement provoquant une réaction allergique pouvant devenir systémique, elles reçoivent des composés dont la voie et la fréquence d'administration sont fixées "selon le choix du sponsor", avec prélèvements de sang et de fèces. Le projet, mené pour des partenaires commerciaux, vise à évaluer des candidats médicaments contre le choc anaphylactique. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire les mécanismes de l'allergie alimentaire.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement curatif de l'allergie alimentaire, seuls les symptômes sont pris en charge. Cette pathologie peut affecter la qualité́ de vie des patients mais également avoir des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke. Le choc anaphylactique est un réaction immunitaire allergique grave en réponse à l’exposition à un allergène. Cet allergène peut venir des aliments, de certains médicaments, d’une piqûre d’insecte, du contact avec du latex, voire d’un effort physique intense après ingestion d’un aliment légèrement allergène. Si le risque de décès par suite du choc anaphylactique existe, il demeure rare, de l’ordre de 0,3 %. Cette réaction peut atteindre le système cardiaque, respiratoire, cutané, gastro-intestinal, entrainant notamment des difficultés respiratoires, des réactions cutanées, des nausées/diarrhées, une baisse de la tension artérielle et possiblement la mort. La recherche menée ici a pour objectif de tester de futurs candidats médicaments ou substituts alimentaires qui pourront permettre de mieux prendre en charge cette pathologie et de la traiter de façon durable. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles expérimentaux permettant une meilleure compréhension et analyse des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de ces maladies inflammatoires ainsi que l'efficacité́ de nouvelles molécules thérapeutiques visant à̀ améliorer la santé des patients. Pour cela nous proposons plusieurs modèles de sensibilisation présentant comme allergène : l'ovalbumine, la bétalactoglobuline bovine (BLG), des extraits contenant de l’arachide, du gluten, du blé, du sésame, des fruits à coques, du sésame, des coquillages, des crustacés, des poissons (liste non exhaustive). La molécule à tester sera administrée par différentes voies recréant les diverses possibilités d’administration médicamenteuses chez l’Homme et selon la voie d'administration conseillée pour ce composé.

Bénéfices attendus

Les modèles animaux d'allergie alimentaire utilisés dans cette étude sont pertinents pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de l'allergie alimentaire afin de répondre à un besoin important de santé, celui des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke pouvant porter atteinte à la vie des patients souffrants d'allergies alimentaires.

Procédures

Dans le but de réaliser une réaction allergique plus importante un jeûne de 4 heures pourra être réalisé avant chaque sensibilisation et/ou lors du challenge final. La molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injection intra péritonéale, intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire selon le choix du sponsor. La fréquence de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires. Les animaux seront pesés quotidiennement. Au cours de l'étude, le sang sera prélevé en respectant un volume maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pour une période de récupération de 7 jours. Les fécès pourront également être prélevés maximum 1 fois par semaine au cours de l’étude. D'autres prélèvements seront possibles en fonction des demandes du sponsor. Des relevés de température rectale ainsi qu'un scoring clinique pourront être effectués quotidiennement pour surveiller l’inconfort des animaux. Les animaux sont ensuite anesthésiés sans réveil et le sang total est prélevé au niveau de l'aorte abdominale ainsi que d'autres organes.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est le développement d'une réaction inflammatoire à un niveau local et possiblement systémique en fin d'étude, lors du challenge.

Devenir

Tous les animaux du protocole sont euthanasiés à la fin et des prélèvements sont réalisés pour l'analyse.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude des allergies alimentaires. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - réduire le nombre des animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 6 animaux nécessaire à une étude statistique. Basé sur la bibliographie et notre précédente expérience du modèle le nombre de 10 animaux permet de répondre à la fois à l’hétérogénéité et la variabilité individuelle tout en respectant la puissance statistique et la nécessité de réduire les animaux.

Raffinement

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - raffiner en apportant du soin et une observance accrue aux animaux en souffrance ou en angoisse suite à l'induction des maladies. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à̀ réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué́ quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé́ dans le paragraphe. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63/UE en unités individuelles ventilées de type III ou IV avec enrichissement de l’environnement (composants de nidification et igloo). L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'allergie alimentaire sont complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. La souris est largement décrite dans la littérature pour être une espèce de choix dans ce modèle. Les allergies alimentaires pouvant survenir à tout moment de la vie d'un individu, les souris seront préférentiellement utilisées à l'âge adulte (8-12 semaines) au début des investigations, car elles présentent un système immunitaire mature. Cependant selon la population ciblée, l’âge pourra être laissé à l’appréciation du sponsor, les animaux pourront être plus jeune ou plus âgés. L'âge minimal étant de 3 semaines et l'âge maximal sera déterminé par l'âge de la population ciblé et peut être de 3 ans.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, génétiquement modifiées pour surexprimer la protéine ABI1, reçoivent une injection intrapéritonéale et jusqu'à cinq échocardiographies sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'elles pourraient développer une insuffisance cardiaque avec oedèmes pulmonaires, des troubles du rythme et des morts subites, et que l'anesthésie sur un cœur défaillant accroît le risque de mort. Il précise avoir d'abord étudié des cardiomyocytes issus de cellules souches de patients mais conclut qu'un "modèle in vivo" est requis pour analyser la fonction cardiaque globale.

Objectifs

Les cardiomyopathies hypertrophiques (CMH) sont des atteintes du muscle cardiaque conduisant à des insuffisances cardiaques d’apparition progressive. Dans certains cas, les CMH augmentent le risque de trouble du rythme cardiaque et de mort subite. Les CMH peuvent avoir une originie génétique. Le plus souvent, ce sont des gènes codant pour des protéines musculaires. Nous avons identifié une mutation conférant à phénotype dominant négatif de la protéine ABI1 chez les patients présentant une CMH. Notre projet a pour objectif d’étudier deux modèles de surexpression de ABI1 pour comprendre la physiopathologie de ces CMH et identifier d’éventuelles voies pour développer des approches thérapeutiques ciblées.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des cardiomyopathies hypertrophiques associées aux mutations de ABI1 et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

Les animaux vont être soumis à: - une injection intrapéritonéale unique (environ 1 minute) - entre 1 et 5 échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes chacune). Ils peuvent être amenés à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites.

Impact sur les animaux

Les animaux devraient développer une cardiomyopathie hypertrophique dont nous ne connaissons pas les vitesses d’évolution ou l’impact sur le bien-être. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer) , des troubles du rythme et des morts subites. Les points limites mis en place permettront de limiter au strict miminum la durée de ces effets. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique par voie intra péritonéale. L'injection sera faite par une personne expérimentée et la principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du coeur et analyse histologique et moléculaire.

Remplacement

Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier les cellules souches induites des patients porteurs de la mutation ABI1 et de les redériver en cardiomyocytes pour analyser la morphologie et la electrophysiologie des cellules du muscle cardiaque. Malheureusement, le développement de l’insuffisance cardiaque ne peut être modélisé avec des cultures cellulaires car le fonctionnement cardiaque est dépendant de nombreux facteurs autres que la contraction des cellules musculaires cardiaques (flux et pression sanguine, système nerveux autonome...). Afin de comprendre l'impact du dysfonctionnement des cellules cardiaques sur la fonction cardiaque globale, nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons différentes approches : - approche séquentielle : nous étudierons les animaux à différents temps de développement et âges croissants. Si nous constatons un phénotype trop sévère aux plus jeunes âges, nous ne produirons pas les animaux les plus âgés. - étude longitudinale : nous avons prévu de réaliser un suivi par échocardiographie des animaux afin d’analyser leur phénotype et son évolution au fil du temps sans sacrifier les animaux pour lesquels ce n’est pas nécessaire. - approche statistique : nous analyserons les données (morphologie et fonction) en utilisant des tests statistiques adaptés. En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe (jusqu’à 5 dans une cage). L’environnement sera enrichi en fonction des préférence des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batonnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels). Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractériser d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussée des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure Chargée du Bien Etre Animal (SBEA). Au cours du projet, des échocardiographies seront réalisées sur les souris. Bien que cette technique d’imagerie soit indolore, elle nécessite que l’animal soit immobilisé. Afin de réduire le stress et limiter la contention des souris, l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des maladies cardiaques (cardiopathies), de leurs conséquences hémodynamiques (sur le flux sanguin) et de leurs causes génétiques. Dans la première partie de l'étude, les souris auront une surexpression de ABI1 dès les stades précoces du développement cardiaque. Afin de réaliser un suivi au cours du temps de l'apparition de la cardiomyopathie, l'atteinte cardiaque sera analysée dès que le cœur à 4 cavités sera bien formé (13.5 jours post fécondation), juste avant la naissance (18,5 jours post fécondation) ainsi qu’à différents stades en post natal (30 ; 60 ; 90 ; 120 ; 150 ; 180 jours après la naissance). Pour la seconde partie de l'étude, la surexpression de ABI1 sera induite dans le muscle cardiaque chez des souris âgées de 8 semaines et la cinétique sera réalisée jusqu’à l’âge de 6 mois.

Pour tester un peptide censé franchir la barrière qui protège le cerveau et freiner l'accumulation d'alpha-synucléine en cause dans la maladie de Parkinson, 40 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie de 30 à 40 minutes pour provoquer cette accumulation dans son cerveau, puis des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux ou quatre semaines, et une ouverture du thorax lors de sa mise à mort, pour perfuser le cœur et fixer les tissus. Le porteur cite une douleur "modérée et transitoire" après la chirurgie et le stress de la contention lors des injections, et prévoit des "points d'alerte en amont des points limites" sans en donner les seuils. Sur le remplacement, il affirme qu'il "n'existe pas à ce jour d'alternatives à l'expérimentation animale" pour prouver l'efficacité et la sécurité du peptide, la démonstration de son "innocuité" exigeant selon lui un système immunitaire fonctionnel.

Objectifs

La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.

Procédures

Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.

Choix des espèces

Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.