Procédures modérées

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections intra-péritonéales par jour pendant dix jours sur animal vigile, puis un prélèvement de sang intra-cardiaque avant l'euthanasie pour récupérer organes, rate et ganglions. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'une protéine, qui font l'objet d'un dépôt de brevet, pour la greffe de poumon. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et "le seul modèle préclinique adapté".

Objectifs

BOB1 est un facteur de transcription exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associée au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. Notre hypothèse est que BOB1 est un déterminant transcriptionnel qui contrôle les réponses immunes allogéniques après greffe de poumons. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de modifier le programme transcriptionnel des lymphocytes activés et fournir un bénéfice thérapeutique pour la prévention et le traitement des dysfonctions chroniques du greffon. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune spécifique d’un alloantigène, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Ces souris développent une réponse immune complète (humorale et cellulaire) spécifique d’un alloantigène que nous pouvons quantifier. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique et innocuité in vivo chez la souris. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une allogreffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 2 minutes, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intrapéritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, des tests statistiques adequats sont utilisés et le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

160 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par gavage avec des parasites intestinaux, ils peuvent développer une inflammation de l'intestin, des diarrhées et une chute de l'hématocrite, portent un harnais de collecte des excréments et subissent un jeûne avant d'être tués. Le projet entretient des souches de parasites, que le porteur nomme "matériel biologique", pour tester des antiparasitaires. Il retient des mâles, plus sensibles à l'infestation, pour "produire plus de parasites avec moins d'animaux", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit le cycle complet du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes et adultes de parasites intestinaux d'intérêt vétérinaire) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique, criblage de molécules). Pour cela, il est nécessaire de conduire des infestations expérimentales pour i) produire le matériel de façon régulière, ii) disposer d'isolat parasitaire et caractériser leurs propriétés de résistance et de virulence, iii) contrôler les doses infestantes et cibler l'espèce d'intérêt (à la différence d'infestation naturelle non contrôlées), iv) maintenir les isolats parasitaires multi-résistants en confinement. Toutes ces contraintes ne rendent pas possible l'utilisation d'animaux en infestation naturelle ou d'animaux d'élevage commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en comprenant i) les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques. Ces bénéfices couvrent des enjeux à court et moyen terme.

Procédures

1) Le déparasitage consiste à traiter les animaux avec un anticoccidien et un anthelminthique. Les deux sont par voie orale ( 1 fois et entre 5 et 10 min). 2) Des prises de sang sur animal vigile pour suivre l'hématocrite (entre 3 et 5 fois et 5 min). 3) Infestation par gavage de parasite en fonction du niveau de résistance de l'isolat (1 fois et entre 5 et 10 min). 4) Transfert des animaux infestés par des isolats résistants dans les parc sur grille et mise en place des harnais (1 fois et environ 30 min). 5) En fonction de la pression sélection, application d'un traitement antiparasitaire (1 fois et en entre 5 et 10 min) 6 ) Récolte des fécès grâce au pot rattaché au harnais (en fonction de besoin scientifique et en continu). 7) Prélèvement rectal pour collecter de petites quantités de parasites (ponctuelle selon les besoins et environ 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de quatre ordres : 1. l'effet de l'infestation : les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en parc avec plateau de récolte des fècés par deux des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux. 3. Les harnais de collecte et le prélèvement rectal peuvent provoquer un léger inconfort. 4. Une mise à jeûn une nuit (< 16h) avant l'euthanasie constitue un stress important pour l'animal. 5) La prise de sang : la contention peut générer du stress ainsi qu’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminés dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro car aucune méthode alternative n'est disponible à l'heure actuelle.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe soit 160 agneaux sur les cinq années à venir au maximum. Aucun test statistique n'est prévu dans le cadre des projets car il s'agit d'assurer une production continue de matériel biologique. Un minimum de deux animaux est considéré pour prévenir un isolement social.

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par deux minimum. Chaque parc avec grille pour la collecte des fèces dispose d’un tapis pour le confort pour le couchage. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte : elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Enfin, des granulés sont donnés après chaque prise de sang. Les animaux sont observés quotidiennement. Dans le cas où l'animal présenterait un état clinique détérioré (apathie, anorexie, diarrhée), une coproscopie de contrôle sera réalisée. Pour l'infestation par H. contortus (parasite hématophage), tout animal présentant une perte d'hématocrite supérieure à 30% de son hématocrite initial sera vermifugé (isolat sensible ou mono-résistant) ou euthanasié (isolat multi-résistant). L'hématocrite sera établi avant puis 30j et 45j après infestation, ainsi qu'après toute coproscopie supérieure à 15000 oeufs/g lors du suivi hebdomadaire. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Les vers gastro-intestinaux, parasites d'intérêt, sont inféodés à cette espèce. Les agneaux auront entre 2.5 à 6 mois. A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.

224 rats prédisposés au syndrome métabolique vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage de la dioxine TCDD, un polluant reconnu cancérigène, sont soumis à un test d'effort sur tapis roulant avec choc électrique et à des imageries, avant une intervention cardiaque terminale qui les tue tous. L'objectif est de voir si une exposition chronique à faible dose aggrave le dysfonctionnement cardiaque. Le porteur affirme que les cultures et modèles ex vivo sont "inadéquats" et que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité".

Objectifs

L'exposition aux polluants organiques persistants (POP) est un problème majeur de santé publique (OMS 2019), notamment en tant que facteur de risque de maladies cardiovasculaires. Les dioxines, et en particulier la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sont parmi les POP les plus toxiques et persistants qui sont rejetés dans les écosystèmes en tant que sous-produits de divers processus de combustion et industriels. Malgré des politiques restrictives de réduction des émissions de POP les populations humaines continuent d'être chroniquement exposées aux dioxines car elles persistent des centaines d'années dans les sols et les sédiments, contaminant ainsi la chaîne alimentaire. Les dioxines sont lipophiles, s'accumulent dans les tissus adipeux et persistent pendant de nombreuses années dans l'organisme. L'exposition aux POP a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques et de décès. Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition subchronique à une forte concentration de TCDD induit une légère hypertrophie cardiaque et une hypertension. Cependant, il est encore inconnu si l'exposition chronique et à faible dose de TCDD exacerbe le dysfonctionnement cardiaque chez l'Homme et les modèles animaux prédisposés aux cardiomyopathies, ainsi que les mécanismes sous-jacent à la cardiotoxicité induite par la TCDD. Ainsi, les objectifs de notre projet sont : 1) de déterminer si la toxicité cardiovasculaire d'une exposition chronique et une faible dose de TCDD est exacerbée dans un modèle murin prédisposé aux cardiomyopathies, 2) d'identifier les voies moléculaires affectées par l'exposition chronique à la TCDD, avec un accent particulier sur Aryl Hydrocarbon Receptor, dont l’activité est modulée par le TCDD et 3) de tester les effets d’antagonistes synthétiques de l'AHR sur les effets cardiotoxiques de la TCDD.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que les résultats de ce travail permettent de démontrer puis de déterminer le rôle du récepteur AHR dans les dysfonctions cardiaques et vasculaires et endothéliale lors d’une intoxication par la dioxine. Ceci permettra ainsi de nouvelles opportunités pour le développement d’approches thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 manipulations interventionnelles de classe légère non invasives : - exposition par gavage à la TCDD et à l'antagoniste des récepteurs AHR pour une durée d'environ une minute par animal par semaine - echocardiographie environ 20 minutes par animal - IRM environ 45 minutes par animal - mesure de pression à la queue environ 10 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 2 manipulations expérimentales de classe modérée : la capacité d'exercice environ 15 minutes par animal, et l'évaluation de la fonction rénale environ 3h par animal. Enfin les animaux seront soumis à une manipulatiob expérimentale de classe sans réveil d'une durée d'environ 20 minutes par animal. Les prélèvements (coeur, reins et aorte) se feront après la mise à mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition à une très forte concentration de TCDD a des effets cancérigènes notamment au niveau hépatique après plusieurs semaines d'exposition. Nous nous attendons également à retrouver un effet délétère au niveau cardiovasculaire après plusieurs semaines d'exposition. Pour la MANIP 1, qui correspond à l'administration de la TCDD par gavage, aucun effet indésirable ou nuisance ne sont attendus. Pour les MANIP 2, 3 et 4 (echocardiographie, IRM et mesure de pression à la queue), la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à une table chauffante. Les animaux retrouveront conscience sur la plaque chauffante et seront ensuite replacés dans leurs cages. Pour la MANIP 5 (évaluation de la capacité d'exercice), lorsque le degré de fatigue est atteint et/ou que l'animal a des difficultés à rester sur le tapis roulant (indépendamment de la délivrance du choc électrique), l'animal sera retiré du tapis de course et le temps de course sera enregistré à la seconde près. Les rats seront habitués à cette mesure en la subissant une fois par jour pendant 3 jours consécutifs avant les mesures d’effort de base.

Devenir

Tous les animaux resteront en vie à l'issue de chaque manipulations expérimentales, excépté pour l'évaluation de l'hémodynamique intracardiaque qui sera une intervention terminale entrainant la mise à mort de tous les animaux à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier, dans le contexte pathologique du syndrome métabolique, les effets cardiovasculaires et rénaux d’une exposition à la dioxine et/ou de l’antagoniste du récepteur AHR dans des conditions de physiopathologies intégrées, autrement dit, chez des rats représentant les caractéristiques observées chez l’Homme : une hypertension artérielle, une insuffisance rénale et un diabète. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Sur la base des données historiques depuis 30 ans obtenues avec des agents pharmacologiques chez des rats atteints d'insuffisance cardiaque chronique sur le remodelage cardiaque et l'hémodynamique, nous avons effectué une simulation satistique pour chaque paramètre obtenu chez les animaux non traités. Sur ces bases nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire est de 224 rats.

Raffinement

Après leur arrivée dans l’animalerie, les rats resteront une semaine en période d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les rats seront hébergés pour groupe de 3 par cage afin de permettre des interactions avec leurs congénères. Le milieu de la cage sera également enrichi de carton pour leur permettre de réaliser des nids. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Différents paramètres seront évalués incluant le comportement (mobilité, activité normales et toilettage) ainsi que l’état physique (état de la peau, de la fourrure et des yeux, vitesse et profondeur de la respiration). Leur prise de poids sera également notée régulièrement. En présence de signes de souffrance légère une administration de buprénorphine 0,03 mg/kg par voie sous cutanée pourra être réalisée. En présence de signes de souffrance sévère ou de détresse constituant un point limite (perte de poids > 10%, paupières fermées, léthargie, comportement de retrait, vocalisations, température corporelle diminuée > 5ᵒC), l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'exposition aux TCDD a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques. Les rats Zucker fa/fa seront donc un modèle idéal pour évaluer les effets de la TCDD sur des individus prédisposés aux cardiomyopathies. Les rats Zucker fa/fa ou Lean (contrôle) utilisés seront des rats matures de 12 semaines ayant au moment de l'inclusion dans l’étude un syndrome métabolique. Ils auront 24 semaines au moment de leur mise à mort. La durée du protocole impliquera soit 3 soit 12 semaines d’exposition à la TCDD avec ou sans antagoniste du récepteur AHR pour pouvoir observer l’impact de la TCDD sur le système cardiovasculaire. Le choix du rat et son âge se justifie par l’expérience du laboratoire obtenue avec les différents modèles de syndrome métabolique au cours des derniers 15 années, utilisés pour évaluer les effets cardiovasculaires des nouveaux traitements pharmacologiques en collaborations avec des industries pharmaceutiques.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former 24 étudiants de Master par an. Chaque animal subit une injection stéréotaxique d'une neurotoxine dans le cerveau pour léser les neurones dopaminergiques, un modèle de la maladie de Parkinson, avec posture anormale et troubles moteurs possibles, avant des tests comportementaux. Le porteur affirme qu'un modèle drosophile n'apporte qu'un "tout petit complément" et que la formation aux gestes "est essentielle" tant que l'expérimentation sur rongeurs reste autorisée. Il présente cette pratique comme une réduction "indirecte" du nombre d'animaux, les gestes étant acquis avant les stages de recherche.

Objectifs

L’objectif du projet est de répondre à des besoins d’enseignement supérieur scientifique dans le domaine des neurosciences développementales s’adressant à des étudiants sélectionnés et de niveau Master 2. Ces approches expérimentales sont importantes pour la suite de leur formation universitaire, en premier lieu dans le cadre de la réalisation de leur master puis pour la plupart de leur thèse de doctorat. Il est à noter qu’en début de cours ; les étudiants reçoivent des informations théoriques sur l’expérimentation animale, les règles éthiques afin de les sensibiliser aux problèmes éthiques et au choix des modèles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Ce projet éducatif représente un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs et en particulier celui de la dopamine et du système dopaminergique dans les comportements locomoteurs. En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Cette intervention ne dure pas plus d’une heure. Ils seront également soumis à des tâches comportementales de courte durée (session unique de 30 à 60 minutes).

Impact sur les animaux

La chirurgie et les expériences de comportement sont des procédures de sévérité modérée. Les nuisances et effets indésirables qui pourraient apparaitre sont des signes de douleur se caractérisant par une posture anormale, une absence de toilettage, des défauts de comportements moteurs du fait de l’injection, des défauts dans le comportement exploratoire. Une perte de poids et une absence de récupération rapide, normalement attendue, en deux semaines maximum sont aussi des effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Dans le cadre du cours, l’analyse du système dopaminergique et de son implication dans des petites tâches comportementales très basiques est réalisée à partir d’un modèle chez la drosophile. Toutefois les informations apportées ne peuvent être qu’un tout petit complément à celles réalisées chez le mammifère et présentées dans ce projet qui couvre une large partie du cours. Le cerveau de la drosophile est petit pour uniquement 100000 neurones au total. Le cerveau de souris en comprend 4 millions, uniquement dans le cortex. La qualité des études comportementales et l’apprentissage ne peut être équivalent. Il est à noter que ce cours s’initie par un enseignement théorique sur l’expérimentation animale par un vétérinaire expert, évoquant en détail tous les problèmes éthiques liés à l’expérimentation animale et chez la souris en particulier. Des enseignements par vidéos sont également utilisés lorsque possible mais sans altérer la qualité d’apprentissage. Tant que l’expérimentation sur rongeurs sera autorisée en recherche développementale, la formation des étudiants aux gestes réalisés eux-mêmesest essentielle. Ceci s’appliquera dans le contexte du stage qu’il vont ensuite entreprendre permettant également une réduction « indirecte » d’animaux, les gestes et la manipulation ayant été déjà été acquis et ceci dans d’excellentes conditions avec un encadrement très soutenu pour la vérification de tous les gestes. Dans le cas contraire, par faute de pratique, ce sont les expériences de recherche qui seront à refaire avec des conséquences importantes de par la nécessité de statistiques pour des résultats à publier. Dans le cadre du cours, les analyses statistiques sont évaluées avec des résultats des sessions des années précédentes.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants qui suivent annuellement le cours. Chaque animal est exploité pour tous les niveaux d’expérience ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés. L’injection unilatérale de neurotoxique permet aussi de pouvoir utiliser le côté du cerveau non lésé comme contrôle et permet de réduire ainsi de moitié le nombre d’animaux utilisés pour les études en histologie. Ce projet pourra utiliser des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage.

Raffinement

Tous les efforts techniques sont mis en œuvre pour minimiser au maximum toute douleur et tout inconfort de l’animal à l’éveil. La qualité des études comportementales en dépend également. Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants qui suivent annuellement le cours. Chaque animal est exploité pour tous les niveaux d’expérience ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés. Des points limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance aux animaux. De la même façon, des analgésiques en pré- et postopératoire sont utilisés pour éviter toute douleur pouvant être associées aux chirurgies.

Choix des espèces

En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté. Le modèle murin est le plus adapté pour illustrer les concepts à enseigner. Les animaux sont utilisés adultes (12 semaines). Ce stade est justifié par la nécessité d’avoir un cerveau mature, et expérimentalement de pouvoir injecter selon des coordonnées stéréotaxiques précises et bien connues.

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés en cage individuelle jusqu'à 48 heures pour recueillir urines et excréments malgré leur nature sociale, subissent des prélèvements sanguins répétés, puis sont tués pour prélever l'intestin et les organes. L'objectif est de mesurer la digestibilité des protéines d'un régime végétarien selon l'âge. Le porteur affirme qu'aucun modèle n'intègre l'ensemble des interactions entre alimentation, intestin et organes, et invoque une recommandation de la FAO sur l'usage du rat.

Objectifs

Les protéines végétales sont généralement de moins bonne qualité que les protéines animales car elles sont notamment moins digestibles, c’est-à-dire que suite à leur ingestion une plus faible partie est assimilée par l’organisme. Cela est dû à la présence dans les végétaux de composés spécifiques diminuant la digestibilité des protéines. Les régimes végétariens ont néanmoins des effets bénéfiques, notamment sur la flore intestinale dont les interactions avec les aliments peuvent influencer le fonctionnement du tube digestif, dont la digestion des nutriments. Cependant les effets à long terme de la consommation d’un régime essentiellement à base de plantes sur la digestion restent en grande partie inexplorés. Dans le contexte de la transition nutritionnelle vers des régimes plus végétalisés, il est important d’étudier si les composants alimentaires végétaux de l’alimentation améliorent ou au contraire altèrent la digestion et la physiologie intestinale. Cela permettra de déterminer si une consommation élevée d’aliments d’origine végétale entraîne une diminution générale de la digestibilité des protéines ou si une adaptation de la capacité digestive a lieu, permettant une optimisation de l’assimilation des protéines végétales. Cela est d’autant plus important pour les populations ayant des besoins spécifiques en protéines et pour qui les capacités digestives peuvent être diminuées, comme les personnes âgées. Ce projet a ainsi pour objectif de comprendre l’influence d'une alimentation riche en aliments végétaux sur l’assimilation par l’organisme des protéines végétales tout au long de la vie adulte. Pour cela, nous évaluerons les effets aigus et chroniques d'un régime riche en aliments végétaux sur la digestibilité des protéines et acides aminés d’une source protéique végétale, le métabolisme des protéines et la physiologie digestive en fonction de l’âge chez le rat.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront de nouvelles connaissances sur la digestibilité des protéines végétales et son évolution avec le vieillissement. L'effet des aliments d'origine végétale sur l’assimilation des acides aminés sera déterminé à l'échelle du repas et du régime alimentaire, aux différents stades de la vie adulte. Cette approche globale permettra de considérer la composition complexe des aliments d'origine végétale et d'explorer l'équilibre entre les effets négatifs et bénéfiques des différents composants sur la santé intestinale et la digestion. Cela permettra de fournir des opportunités uniques pour comprendre comment les régimes à base de plantes ont un impact sur la physiologie de l'intestin et la digestion des protéines. En outre, nos résultats fourniront des données importantes sur la digestibilité des protéines et des acides aminés chez les individus âgés, qui n'est pratiquement pas documentée à l'heure actuelle. Ce projet aidera à comprendre les changements physiologiques de l'intestin impliqués dans la diminution des capacités de digestion liée à l'âge. De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les besoins en protéines et acides aminés et développer des stratégies nutritionnelles pour prévenir une possible inadéquation entre les apports et les besoins dans la population générale et âgée. L’ensemble des résultats de ce projet permettront de soutenir une promotion éclairée d'un régime alimentaire plus sain et durable.

Procédures

Durant l’ensemble du projet, les animaux seront pesés régulièrement (3 à 5 fois/semaine). Des régimes omnivores et végétariens répondant aux besoins des rats seront donnés aux animaux. Trois prélèvements sanguins sur animal vigile sont réalisés lors du projet sur l’ensemble des rats, avec du matériel spécifique afin de limiter la durée et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. L’ensemble des animaux recevra également 30 minutes avant la mise à mort des animaux, une injection réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes. Pour 104 rats, afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés 3 fois pendant le projet pour une durée limitée (48 h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Pour 104 rats, une anesthésie gazeuse brève est réalisée 3 fois au cours du projet afin d’évaluer des paramètres de composition corporelle dans un appareil d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les animaux sont hébergés en cage individuelle en permanence ou ponctuellement selon la procédure. En effet, pour évaluer la digestibilité des protéines et des acides aminés, il est nécessaire de mesurer précisément la prise alimentaire et de collecter les urines et fèces. Les animaux doivent donc être placés dans des cages individuelles et cela peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car la détermination de la digestibilité des protéines ainsi que l’évaluation des effets d’un régime végétarien sur la physiologie digestive nécessitent la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier l’impact d’une alimentation végétarienne sur la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines et la physiologie digestive en fonction de l’âge. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin et les organes associés.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 16 rats (8 mâles et 8 femelles) /groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre eux à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Lorsqu’ils sont hébergés en cage individuelle sur une durée supérieure à 48 h, les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même âge), tous les jours de la semaine (hors week-end) durant 2 h par jour dans des cages collectives (2-5 animaux par cage en fonction de leur âge/poids). Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang sont réalisées par un personnel expérimenté sur cet acte technique avec du matériel spécifique, ce qui permet de limiter le temps et le stress engendré. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l’Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) préconise de spécifiquement utiliser l’être humain, le porc ou le rat pour l’évaluation de la digestibilité des protéines (critère principal du projet). Des rats mâles et femelles jeunes (5 semaines), d’âge moyen (10 mois) et âgés (18 mois) sont inclus car nous étudions l’effet de l’âge.

570 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral modifié est injecté directement sous la rétine des deux yeux sous anesthésie, suivi d'imageries et d'électrorétinogrammes répétés, puis les yeux, le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. L'objectif est de tester si une modification chimique de l'enveloppe du vecteur le dirige mieux vers la rétine. Le porteur affirme que la rétine ne peut être reconstituée "parfaitement in vitro" et retient le rat pour la taille de son œil, plus commode à injecter.

Objectifs

Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les outils les plus performants pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. L’AAV de serotype 2 (AAV2) est capable d’infecter une large gamme de cellules in vivo chez le mammifère comme les cellules musculaires, les hépatocytes ou les neurones ce qui explique en partie sa popularité. Ce sérotype a d’ailleurs été utilisé en clinique pour le transfert de gène dans le foie notamment dans le premier essai clinique sur hémophilie B. Ces propos optimistes sont néanmoins pondérés par des limites : •Le tropisme très large des AAV qui peut être à l’origine d’une expression du transgène dans d’autres tissus que celui ou ceux où l’expression du transgène est souhaitée. •Il reste nécessaire d’injecter des doses importantes qui peuvent entrainer une immuno-toxicité au détriment de l’effet thérapeutique Ces principaux inconvénients sont à l’origine de ce projet de recherche car nous pensons qu’une modification chimique ciblée, pourrait changer l’adressage des vecteurs vers l’organe d’intérêt, ici la rétine. Ce projet consiste à modifier chimiquement la capside (l’enveloppe) des vecteurs dérivés du Virus Adéno-Associé de type 2 et 8 (AAV2 et AAV8). Il repose sur le couplage à la surface des vecteurs de molécules chimiques ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine ce qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées. Des premiers tests seront effectués sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo. Il est également impossible de vérifier la bio-distribution et l’index thérapeutique de ces particules modifiées sur des cellules en culture. L'utilisation du rat est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres in vivo.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de déterminer l’infectiosité des AAV (virus adéno-associé) modifiés en les injectant chez des rats sains par voie sous-rétinienne. Il repose sur le couplage de molécules chimiques à la surface de la capside d’AAV ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrée et donc le risque de réaction immunitaire.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne, des vecteurs chimiquement modifiés dans les 2 yeux ou en intra-veineuse : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et de quelques minutes pour l’intra-veineuse. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, le jour de l’injection et le jour de l’euthanasie. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats. Durée du geste, 5min environ.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne ou intra-veineuse. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie…) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. L’œil du rat étant 5 fois plus gros que l’œil de souris, l’injection sous-rétinienne est plus facile à réaliser chez le rat, avec une distribution du produit plus homogène entre les individus. La taille de l’œil de rat permet également d’avoir suffisamment de matériel pour réaliser les analyses post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses post-mortem et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec une solution saline, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes : marquages immunohistochimiques), des analyses de biologie moléculaire et biochimiques. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression de la GFP, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre le vecteur et une analyse statistique sur les amplitudes en ERG (électrorétinogramme).

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés et une régulation de leur température, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats. L’enrichissement sera renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large permettant une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats non albinos, ayant une acuité visuelle moins impactée par l’âge ce qui nous semble cohérent pour l’analyse de l’impact de vecteur sur l’intégrité et la structure de la rétine. Les rats seront utilisés à l’âge d’un mois pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

50 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un vecteur de thérapie génique, parfois par une chirurgie cérébrale de cinq heures, puis subit des séances répétées d'imagerie sous anesthésie avant l'euthanasie pour analyse des tissus. L'objectif est d'obtenir une "preuve de concept" avant un essai clinique contre la maladie de Parkinson. Le porteur justifie le recours au macaque par la taille de son cerveau et sa proximité immunitaire avec l'humain, et affirme que ni les cultures ni le rongeur ne sont "prédictifs".

Objectifs

La maladie de Parkinson, fait partie d’un groupe de maladies du cerveau dont la signature est l’accumulation anormale d’une protéine l’alpha-synucléine (α-syn). A l’état normal, α-syn régule le trafic et la libération des neurotransmetteurs qui sont essentiels pour la communication entre neurones. Son accumulation excessive et en forme insoluble, contribue à l’apparition d’agrégats multi-protéiques qui encombrent les neurones et empêchent leur bon fonctionnement. Une stratégie thérapeutique contre cette accumulation et agrégation d’α-syn est de réduire sa quantité dans les tissus ou des molécules intermédiaires (ARN messager, ou ARNm) nécessaires à sa production. Des essais cliniques sont déjà en cours sur des patients atteints de la maladie de Parkinson pour évaluer l’efficacité de cette stratégie. Cependant, ces approches laissent la protéine et/ou ARNm s’accumuler jusqu’à qu’ils rencontrent une molécule qui les élimine. Ce processus engorge à terme la machinerie cellulaire et il serait plus efficace de réduire l’expression du gène directement, c’est-à-dire d’agir en amont de la production d’ARNm et de protéines. Grâce à une technologie d’édition du génome qui est inductible et réversible, nous proposons de tester une nouvelle approche pour réduire partiellement la quantité d’α-syn produite de novo. Des résultats obtenus chez le rongeur montrent que l’approche est efficace et bien tolérée. Il s’agit maintenant d’étoffer ces données et de mettre à l’échelle le traitement dans une espèce plus proche de l’humain en termes de taille et organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau, et par rapport au système immunitaire. Les expériences proposées dans un modèle primate non-humain permettront ainsi d’établir si la réduction partielle de l’expression du gène est efficace et bien tolérée. Pour ceci, il faut réaliser la mise à l’échelle du traitement chez le gros animal et étudier différentes voies d’administration, en comparant l’effet de la thérapie génique après injection du vecteur thérapeutique directement dans le cerveau, dans le compartiment de liquide céphalorachidien, ou dans le compartiment sanguin. Toutes les voies d’administration citées sont utilisées chez l’humain et sont donc pertinentes pour le traitement des patients atteints de la maladie de Parkinson. Dans un souci de raffinement, la voie moins invasive donnant une efficacité satisfaisante chez le primate non humain sera privilégiée pour la translation de cette thérapie en clinique.

Bénéfices attendus

Les données déjà obtenues dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson montrent bien que la réduction de la quantité de protéines ou d’ARNm de l’α-syn a un effet bénéfique. Ce projet vise à établir pour la première fois chez le primate non-humain l’effet d’une thérapie qui réduit partiellement l’expression du gène de l’α-syn en vue de son utilisation chez le patient atteint de la maladie de Parkinson. Notre approche devrait éviter d’encombrer et perturber la machinerie cellulaire, et limiter le risque d’engorgement empêchant l’élimination des produits accumulés et causant une inflammation chronique autour des neurones, où ils s’accumulent. Les données acquises pendant le projet permettront d’établir les meilleurs paramètres d’administration chez le patient, ce qui constitue une preuve de concept essentielle avant de démarrer un essai clinique.

Procédures

Le protocole expérimental comporte 4-5 séances de prélèvements sous anesthésie (~30 min) avant et après administration de la thérapie. L’imagerie IRM non-invasive, sera utilisée pour observer l’anatomie du cerveau et la présence d’inflammation (4-5 fois 1-2H). De même, 4-5 séances d’imagerie TEP (4H max) seront délivrées en respectant 3 semaines d’écart entre les examens. Une seule délivrance de thérapie est prévue par animal et sa durée sera de 1H à 6H selon la voie. L’euthanasie en fin de protocole sera nécessaire pour prélever les organes et tissus et les analyser, afin de comparer les résultats aux mesures fonctionnelles et anatomiques acquises par imagerie IRM et TEP, et ainsi valider les résultats d’innocuité et efficacité. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale en prenant en compte l’inconfort, la douleur lors des chirurgies et le suivi de l’état général des animaux comme le poids, la mobilité et la sociabilité avec les congénères.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles suite à la délivrance du traitement par chirurgie sont une infection au niveau de l’incision de la peau (5-7 jours maximum avec prise en charge par un traitement antibiotique), une douleur au niveau de l’incision (2-3 jours post-incision avec prise en charge par un traitement analgésique), perte de poids (2 jours post-chirurgie avec prise en charge par un soutien alimentaire). Toute modification du comportement moteur ou social des animaux hébergés en groupe social sera noté et notifié au vétérinaire.

Devenir

Suite à des données prometteuses obtenues chez le rongeur, et dans l’optique d’obtenir une preuve de concept de l’efficacité et la sureté d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Parkinson chez une espèce fonctionnellement et immunitairement proche de l’Homme, il est nécessaire d’analyser les tissus après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, le cadre règlementaire pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain impose une vérification directe de la distribution dans l’organisme du vecteur viral et une évaluation de sa capacité à induire une réponse immunitaire. Ces données sont inaccessibles chez le patient humain et le recours à l’animal reste nécessaire. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques ou histopathologiques.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permettant aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale du cerveau au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique, ou de comparer cette distribution en fonction des voies d’administration utilisées. Le rongeur, vu la petite taille de son cerveau, n’est pas pertinent pour informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire le nombre d’injections et la concentration de l’agent thérapeutique à utiliser pour couvrir une région du cerveau. La taille et la structure du cerveau du primate non-humain – en rapport avec la résolution intrinsèque des équipements d’imagerie existants – permettent aussi des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients et impossibles chez le rongeur par exemple. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets grâce à des examens d’imagerie et de confirmer ces résultats par analyse immunohistochimique des marqueurs d’inflammation post-mortem. Le protocole expérimental pourra être révisé pour éviter une réaction immunitaire, en modulant des paramètres d’administration comme la concentration et le volume de l’agent thérapeutique, sa répartition par site d’injection et l’administration d’un traitement anti-inflammatoire. Tous ces éléments pourront être utilisés pour mettre au point les protocoles de délivrance et de suivi chez le patient.

Réduction

Une veille de la littérature démontre que ces expériences n’ont pas été déjà réalisées et que le nombre d’animaux choisi, en tenant compte de l’espèce, est pertinent puisqu’il a déjà permis de mettre en évidence des effets thérapeutiques dans d’autres études. De plus, le laboratoire dispose d’une solide expérience dans le design d’expériences d’évaluation thérapeutique chez le primate non-humain et du nombre d’individus nécessaires par groupe expérimental pour conclure sur des effets pertinents et prédictifs chez l’humain. Un suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives comme l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet thérapeutique significatif, en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps.

Raffinement

Une seule séance par individu est prévue pour délivrer les vecteurs viraux. La durée et le caractère invasif de la procédure de délivrance seront variables entre les groupes expérimentaux, selon qu’il s’agira d’une simple injection (~1h) ou une chirurgie pour délivrance dans le cerveau (~5h). Un suivi d’observation journalière sera mis en place les deux premières semaines après administration pour vérifier l’absence de réaction aigue (réaction cutanée locale, gonflement, rougeur, infection). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie locale et systémique le jour de l’intervention et, dans le cas de la chirurgie, dans les deux jours qui suivront. D’après l’expérience du laboratoire, grâce à ces protocoles, les chirurgies ne modifient pas le comportement de l’animal ni sa prise de nourriture, même dans les 48 heures post-intervention. De plus, un suivi du poids sera réalisé toutes les semaines durant toute la durée de l’expérience. Le comportement sera évalué une fois par semaine pendant toute la durée du protocole à l’aide d’une grille prenant en compte différents critères, dont la présence ou absence d’un penchement de la tête, la difficulté de déplacement à cause d’un membre inférieur ou supérieur, les rotations, la prostration, l’apparence du pelage, la prise de nourriture fournie par l’expérimentateur (motricité fine et apathie).

Choix des espèces

Des études préalables chez le rongeur montrent que la réduction de l’expression de la protéine aSyn est suffisante pour modifier ou empêcher le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet vise à réduire partiellement l’α-syn au niveau de l’ADN. Le développement clinique de l’approche demande d’étudier la biodistribution et la sureté de cette thérapie dans un modèle bien connu et proche de l’homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie. Ni les modèles in vitro ni les modèles rongeurs ne sont prédictifs du fait de la petite taille du cerveau et des différences au niveau du système immunitaire, et c’est pourquoi nous avons fait appel au modèle macaque. En effet, des études comparatives entre rats, primates et humains montrent que le nombre de cellules dopaminergiques dans la substance noire est de 12.7x10e3, 203x10e3 et 382x10e3 respectivement ce qui illustre la pertinence de l’espèce de choix. Animaux adultes dans la perspective de l’application clinique chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et dans le but de s'éloigner d'une plasticité trop importante observée chez l'enfant et le jeune adulte et qui pourrait entrainer la mise en jeu de mécanismes adaptatifs de compensation.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, une injection intraveineuse d'un immunostimulant dérivé d'une molécule bactérienne, puis des prélèvements sanguins, sur des lignées immunocompétentes et immunodéficientes. L'étude, exploratoire, vise à décrire la réponse immunitaire innée dite mémoire face à la tumeur. Le porteur affirme que tester ce composé exige un "organisme entier" que les cultures ne reproduisent pas, et renvoie les retombées contre les cancers et les maladies infectieuses au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire, mais sa toxicité ne permet pas son utilisation en clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. La réponse mémoire innée n’a été décrite que récemment, mais pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la progression et de la rechute tumorale. Mais les mécanismes impliqués ainsi que les acteurs de ce contrôle sont en revanche encore peu connus à ce jour. Ce projet aura pour objectif : 1) de décrire le type de réponse immunitaire innée et adaptative induite par cette molécule détoxifiée sur des souris immunocompétentes, préalablement implantées avec des cellules tumorales. Cette évaluation nous permettra d’appréhender les variations des populations immunitaires totales au cours du temps. 2) nous évaluerons ces mêmes critères sur des souris immunodéficientes ne présentant pas tous les aspects de la réponse immunitaire, afin d’estimer l’implication de la seule réponse innée. Cela permettra par la suite d’évaluer si la réponse innée seule permet la mise en place d’une réponse efficace contre la prolifération des cellules cancéreuses, mais également de conclure sur l’efficacité de ce composé détoxifié en tant qu’immunothérapie anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les populations immunitaires impliquées dans la mémoire innée, et promues par ce composé détoxifié prometteur pour la santé humaine. Cette caractérisation aura plusieurs retombées : 1) Suivre la cinétique du système immunitaire complet chez des souris immunocompétentes, 2) Renforcer l’affirmation que le système immunitaire adaptatif n’est pas le seul menant à une réponse mémoire, 3) Mettre en évidence les populations cellulaires responsables de cette mémoire innée, permettant par la suite de comprendre comment favoriser leur induction. A plus long terme, cette réponse mémoire innée pourrait être mise à profit non seulement pour soigner différents types de cancers, mais également dans le cas de maladies infectieuses.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes. - 1 prélèvement sanguin sous vapeurs d’isoflurane (3,5%) - durée < 5 minutes.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, une fois)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la nécessité de prélever les échantillons biologiques

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire et d’une réponse mémoire, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Cette expérience est exploratoire, et a pour but de décrire les populations immunitaires recrutées après traitement ainsi que leur activation dans les différents compartiments testés. Nous avons choisi d’utiliser 12 animaux par groupes afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules dans les organes prélevés pour mener à bien toutes les analyses et obtenir des résultats suffisamment représentatifs. Dans ce cas, nous ne pouvons pas déterminer de tests statistiques appropriés, mais nous nous sommes basés sur le nombre de cellules vivantes à enregistrer, en comparaison avec le nombre de cellules obtenu par prélèvement sanguin, retranché des biais de manipulation connus (mortalité cellulaire, perte des cellules lors des différentes étapes de lavages et de traitement de l’échantillon). Ce nombre permet également de palier au fait que l’implantation de tumeur ne prenne que dans 80% des cas. Nous avons donc dû prévoir une augmentation de l’effectif de souris prévu initialement de 20%. A des fins de réduction, nous avons choisi d’utiliser le groupe de souris contrôle comme point de référence T0.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…) critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels seront annotés sur une fiche de suivi, et comparées à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si score 1, observation quotidienne des animaux par l’expérimentateur, pas d’action particulière. Si score 1 deux jours de suite : action similaire à score 2. Si score 2, animaux suivi matin et soir. Si score 3 ou 4, traitement palliatif mis en place le jour même sur une durée de 24h. Si score 5, animaux mis à morts = Point Limite. Des points limites adaptés seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatif. Des souris femelles âgées entre 12-20 semaines seront choisies car elles sont moins agressives entre elles que le sont les mâles, et ont un système immunitaire compétent et mature. Le modèle immunocompétent est particulièrement utilisé pour l’étude de l’immunité cellulaire. Pour évaluer la réponse immunitaire innée, un modèle animal fortement immunodéprimé ne comportant pas de système immunitaire adaptatif est nécessaire, celui-ci pouvant fausser nos résultats dû aux interactions entre ces deux versants de l’immunité. La souris immunodéficiente est connue pour présenter ces caractéristiques en ne développant pas certaines cellules immunitaires. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins.

1432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen, dont un agent pro-inflammatoire qui peut faire perdre 10 à 15 % du poids, subissent un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par incisions répétées de la queue, avant un prélèvement de sang terminal. L'objectif est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes limitent l'inflammation cérébrale via la microglie et freinent l'obésité. Le porteur renvoie le bénéfice, une "nouvelle possibilité de lutte contre l'obésité", au conditionnel et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris pour ces échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. L’inflammation est un facteur qui favorise l’apparition de l’obésité. L’hypothalamus est la région du cerveau impliquée dans les régulations métaboliques. Les cellules immunitaires responsables de l’inflammation dans le cerveau s’appellent cellules microgliales. In vitro les hormones thyroïdiennes ont un effet anti-inflammatoire dans ces cellules. L’objectif de ce projet est d’abord de verifier qu’in vivo aussi les hormones thyroïdiennes sont capables de limiter l’inflammation provoquée par un agent bactérien ou un régime trop gras, via leur action dans la microglie. Puis nous évaluerons l’importance de ces hormones dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime obésogène.

Bénéfices attendus

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. Cette étude permettra de déterminer si cibler le pouvoir anti-inflammatoire des hormones thyroïdiennes dans l’hypothalamus constitue une nouvelle possibilité de lutte contre l’obésité

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans la première expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Toutes les souris sont ensuite injectées dans l’abdomen (1 fois, 15s) et analysée après 0, 1 ou 5 jours. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans la deuxième expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Puis L’alimentation normale sera remplacé par un régime obésogène pour 3 ou 7 jours) pour certains des animaux. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans une troisième expérience, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1 fois/jr, 15s, 5 jr). Pour certains, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène (2 mois). Toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s)

Impact sur les animaux

Ne travaillant que sur les mâles et les animaux mutants et contrôles issus d’une même portée devant être répartis dans les différents groupes expérimentaux (nourriture), certains peuvent être isolés pendant l’ensemble de la procédure. Une douleur temporaire peut apparaitre suite aux injections quotidiennes d’hormones ou de tamoxifène 5 jours d’affilées. Il y a aussi un risque d’inflammation de la cavité péritonéale suite à ces injections répétées. Les prélèvements à la queue dans les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur plus légère. Après l’injection de LPS (procédure 1), la perte de poids peut être importante (entre 10 et 15% du poids pré-injection) le premier jour pour remonter en suite. Pour la procédure 3, sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de tolérance à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser par histologie ou biologie moléculaire ou pour récupérer des cellules

Remplacement

Nous avons déjà étudié et pu établir l’effet anti-inflammatoire de l’hormone thyroïdienne in vitro. Le but ici est de comprendre l’impact de cet effet anti-inflammatoire dans un contexte physiologique d’inflammation et son impact sur les conséquences métaboliques de cette inflammation L’hypothalamus est une région du cerveau qui présente une grande diversité cellulaire. Les différents types cellulaires interagissent entre eux pour élaborer les réponses physiologiques adaptées. Les outils génétiques nous permettent aujourd’hui d’inhiber sélectivement la signalisation thyroïdienne dans un type cellulaire donné chez la souris, ici la microglie. Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal, pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre différents organes, en réponse à différentes conditions physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 6 animaux (mâles) par condition expérimentale en fin d’expériences sont nécessaires et suffisants. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. Pour certaines expériences, on augmente le nombre d’animaux à 8 par groupe car dans ces expériences des animaux devront peut-être être retirés avant la fin suite à l’atteinte de points limites. Cette étude est aussi séquentielle : l’ensemble des expériences proposées ne seront pas forcément menées à bien. En particulier, nous n’étudierons l’importance des hormones thyroïdiennes dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime riche en gras que si les premières études montrent que les hormones thyroïdiennes régulent l’inflammation dans l’hypothalamus.

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement dans leur cage. Nous veillerons au bien être et la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsque des injections quotidiennes doivent être faites dans l’abdomen nous changeons chaque jour le site d’injection pour minimiser les risques d’inflammation. Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids après injection de l’agent pro-inflammatoire, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois par jours jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins et des derniers traitements avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique et contrôlent la température. La souris est un modèle de choix pour les manipulations génétiques et les expériences de physiologie. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous utilisons des souris adultes car nous ne voulons pas d’interférence entre les processus de croissance et métaboliques.

6 vaches laitières vont être utilisées, puis conservées pour le troupeau et réutilisables, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à deux vagues de chaleur artificielles atteignant 35°C en chambre climatique, avec six prélèvements de sang à la queue et des prélèvements de lait, pour étudier la stabilité thermique du lait. Le porteur indique que le stress thermique entraîne un inconfort, une hausse de la respiration, de la sudation et du besoin de boire, et une baisse possible de la production laitière. Il affirme qu'il est impossible de se passer des vaches puisque l'étude porte sur le lait qu'elles produisent, projet destiné aux éleveurs et à l'interprofession laitière.

Objectifs

Les laits de consommation subissent des traitements thermiques de type UHT pour permettre leur conservation dans le temps ou des ultrafiltrations pour concentrer certains éléments d’intérêt. Certains laits, pour des raisons mal déterminées, ne supportent pas ces traitements et floculent, soit immédiatement, soit lors de leur conservation en briques. Une meilleure compréhension des causes de la variabilité des instabilités du lait entre systèmes d'élevage des vaches laitières pourrait aider à cibler des leviers par lesquels les problèmes d’instabilité des laits pourraient être limités au niveau des élevages. La France subit ou risque de subir de plus en plus de vagues de chaleur extrême associées au changement climatique. Les effets de ces stress thermiques sur l’instabilité des laits ont été peu documentés. Un effet via les perturbations acido-basiques induites au niveau de l’organisme des animaux pourrait être à l'origine d'une instabilité des laits. Pour des températures entre 5 et 28°C, la vache laitière n'a pas de difficulté de régulation de sa température corporelle, du moins si l'humidité relative est modérée. Par contre, avec des températures supérieures à 25°C, on constate des chutes rapides et importantes d’ingestion et de production laitière. L’objectif de l'expérimentation sera de caractériser finement les effets de deux vagues de de chaleur successives, telles qu’on peut les anticiper en France, sur la stabilité thermique des laits (aptitude à supporter les traitements UHT), en lien avec des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Nous allons mieux connaître les mécanismes physiologiques déterminant la stabilité thermique des laits afin de résoudre les problèmes qui se posent sur le terrain. Nous pourrons valoriser ce travail auprès des éleveurs et de l'interprofession laitière. Nous participerons à l'identification de biomarqueurs de stabilité thermique dans le lait afin d'aider les éleveurs à mieux gérer ce problème car la stabilité thermique est un paramètre difficile à mesurer en routine à ce jour, bien que les conséquences de sa chute soient importantes dans les unités de transformation laitière.

Procédures

Les vaches seront exposées à deux périodes de vagues de chaleur modérées reproduites artificiellement en chambres climatiques. Chaque période durera une semaine. Chaque jour, la température s'élèvera graduellement à partir de 7 h du matin pour atteindre 35 °C à 12 h. Elle restera à 35°C jusqu'à 19 h, puis descendra rapidement à 19°C, température qui sera atteinte vers 20 h et qui restera constante toute la nuit. Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue toutes les semaines pendant 6 semaines, soit 6 prises de sang. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache. Le prélèvement de lait consiste à prélever 2 L de lait dans le bidon qui a recueilli la totalité du lait issu de la traite des vaches. La traite va durer un dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température dans les traitements TC de fortes températures ambiantes va induire une adaptation physiologique des vaches à la chaleur. L'ampleur de la hausse de température va être controlée pour mimer deux vagues de chaleur modérées, proches du seuil défini par Météo France pour la température (https://meteofrance.com/changement-climatique/observer/changement-climatique-et-vagues-de-chaleur) et courtes (7 jours). Le stress thermique va par définition entrainer un inconfort et une adaptation physiologique consistant en une hausse de la fréquence respiratoire, de la sudation et un besoin accru d’abreuvement. Il peut aussi entrainer une baisse de la production laitière et une baisse d’ingestion, au moins sur les heures les plus chaudes de la journée. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache.

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci soit effectivement possible.

Remplacement

L'expérimentation concerne directement la qualité du lait. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui produisent ce lait.

Réduction

Le schéma expérimental sera un schéma en double inversion. Les 6 vaches laitières seront réparties dans 2 salles climatisées et elles recevront chacune deux fois les régimes de température décrits. Ce nombre de 6 vaches impliquées est un bon compromis entre la nécessité de maximiser la puissance statistique et nos capacités expérimentales en termes de remplissage de salles climatisées. Les expériences passées avec ce type de schéma montrent qu'un groupe de 6 vaches produira des réponses adaptatives à la hausse des températures envisagées dans ce projet suffisantes pour être mises en évidence à travers une comparaison des périodes entre elles sur les paramètres cibles suivants : production laitière, température corporelle, fréquence respiratoire. Les données seront analysées par analyse de variance.

Raffinement

L'expérimentation est basée sur le lait. Les seuls actes invasifs sont des prises de sang (6 au cours des 6 semaines d'expérimentation). Leur nombre est vraiment faible. Ces prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc sans subir aucun stress lié à ce blocage qui est habituel. Les vaches seront maintenues dans un environnement d’élevage habituel aux conditions de température près. Ces conditions sont adaptées à leurs besoins comportementaux et sanitaires, et elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées. Les points limites pour arrêter l’expérimentation pour certaines vaches qui ne s’adapteraient pas aux hausses de température seront une baisse durable d'ingestion (25% par rapport à la période de référence), un rythme respiratoire supérieur à 120 respirations/min (mesuré par observation) ou une température rectale matinale des vaches avant le démarrage de la phase de montée en température des salles hors de la gamme physiologique (> 39°C).

Choix des espèces

Vache laitière de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre fin août et fin septembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.

6 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, trois injections intramusculaires d'un candidat vaccin et cinq prélèvements sanguins à l'oreille en cage de contention, avant une ponction cardiaque terminale de 30 mL de sang sous anesthésie. Le porteur indique que leur mise à mort est justifiée par la "nécessité" de récupérer une grande quantité de sang pour analyser les anticorps. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de se passer de l'animal pour la production d'anticorps polyclonaux et prévoit un seul groupe de six lapines, sans témoin.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale et ainsi obtenir une quantité suffisante d’anticorps avec la fréquence d’administration choisie. Ce projet en particulier, vient compléter les différents groupes déjà testés en étudiant cette fois l’administration du vaccin seul, sans aucun adjuvant. La quantité d’anticorps produite par les animaux et collectée en fin d’expérience reflètera l’efficacité de la vaccination.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer à évaluer la variabilité de réponse à son administration et à compléter les données obtenues avec le bon protocole d’administration. Les anticorps collectés à la fin de l’expérience seront ensuite administrés chez la souris pour réaliser une vaccination dite passive. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 sur animal vigile - 3 secondes - 3 injections du candidat vaccin (1mL) par voie intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28,J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 - La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en place de la puce. - 2 à 3 injections intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) -Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire directement suivi d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 6 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seul 1 groupe de 6 lapins sera administré par le candidat vaccin (protocole de 3 immunisations) afin de compléter des données (pas de groupe control). Comme ce projet ne comporte qu’un groupe, aucun test statistique de comparaison ne sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.