Procédures modérées
Collectes et transferts d’embryons chez la chèvre 2/2
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
330 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée jusqu'à quatre fois et le reste tué. Les donneuses reçoivent quatorze injections de superovulation sur huit jours puis une incision abdominale sous anesthésie pour prélever les embryons, répétée trois à quatre fois, et les receveuses portant des embryons génétiquement modifiés sont euthanasiées après le sevrage de leurs petits. L'objectif est d'obtenir dix à vingt descendants d'une même chèvre en une seule saison, pour tenir les délais d'un "contrat de recherche". Le porteur affirme qu'"aucune stratégie de remplacement n'est possible" car l'étude porte sur des animaux non-humains génétiquement modifiés.
Objectifs
L’objectif du projet consiste à obtenir, chez des chèvres, plusieurs descendants en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Les embryons des chèvres donneuses sont collectés au jour 7 de gestation. Ces collectes d’embryons impliquent un traitement de superovulation des chèvres donneuses, puis un rinçage des cornes utérines grâce à une petite incision abdominale sous anesthésie générale, afin de récupérer les embryons. Les embryons récupérés sont alors directement transférés dans des chèvres receveuses.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet consiste à obtenir plusieurs descendants à partir de chèvres génétiquement intéressantes en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’une part, d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) et à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Le bénéfice lié à ce protocole est d’arriver à obtenir suffisamment d’animaux d’intérêts dans un temps restreint afin d’atteindre les objectifs d’études de ces animaux dans la durée d’un contrat de recherche. Sans ce protocole, certaines tâches de contrat ne pourraient pas être atteintes.
Procédures
Série d’injections sur animal vigile pour les donneuses d’embryons (14 injections sur 8 jours, répétées 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum) et incision abdominale sous anesthésie générale et analgésie pour le prélèvement des embryons (1 heure, répétée 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum). Série d’injections sur animal vigile pour les receveuses d’embryons (4 injections sur 4 jours) et chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes). Durée de chaque injections : quelques secondes.
Impact sur les animaux
La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons sont des procédures assez classiques et rapides (respectivement 1 heure et 30 minutes maximum d’intervention). Les effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent être l’hypothermie et des douleurs post-opératoires.
Devenir
La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons (procédures successives 1-3) sont des procédures assez classiques, rapides, et qui n'induisent pas d'effet secondaire pour les chèvres donneuses; elles seront donc gardées en vie et pourront être utilisées chacune 3 à 4 fois pour la procédure de collecte d'embryons à J7. Ce qui réduira grandement le nombre de chèvres donneuses nécessaires. Et elles pourront être réutilisées ensuite en élevage (mise en reproduction avec un bouc) ou replacées. Par contre, les chèvres receveuses d'embryons édités/modifiés sont considérées OGM car porteuses d’embryons OGM. Elles ne peuvent pas être replacées, ni utilisées dans d’autres protocoles; elles devront donc être euthanasiées après le sevrage de leurs petits.
Remplacement
Aucune stratégie de remplacement n’est possible sur ce projet, car l’étude d’animaux génétiquement modifiés ne peut pas être réalisée sans animaux.
Réduction
Ce stade de collecte permet la récupération d’embryons par chirurgie, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires au projet. Dès qu’une vingtaine d’animaux descendants de la chèvre donneuse seront obtenus, les expériences seront stoppées dans un but de restreindre le nombre d’animaux engagés. Les chèvres donneuses et les chèvres receveuses peuvent être utilisées jusqu’à 4 fois en respectant un temps de repos d’au moins 9 semaines entre 2 traitements. Ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires et utilisés dans le projet.
Raffinement
Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux engagés dans ce projet nous allons : (i) Réaliser les interventions sous anesthésie générale précédée d'une analgésie adaptée et d'une antalgie post-opératoire chez les donneuses et chez les receveuses ; (ii) Réaliser les interventions avec monitoring de la température, utilisation de tapis chauffant pendant la chirurgie et de lampes infrarouge en post-opératoire. Ce qui permet de limiter l’hypothermie des chèvres ; (iii) Réaliser les transferts d’embryons sous cœlioscopie pour limiter la taille des incisions et le nombre de points de suture. Les chèvres seront hébergées dans un bâtiment fermé. Elles seront en lot afin de conserver leurs relations sociales. Elles auront de l’eau et du fourrage sec à volonté et des compléments alimentaires (granulés) rationnés. Elles bénéficieront d’un milieu enrichi, approprié à l’espèce caprine. Dans le cadre des 4 procédures de ce projet, les animaux seront surveillés quotidiennement par les personnes responsables du bien-être animal. Un traitement antalgique et/ou antibiotique sera réalisé si nécessaire. Le comportement, des chèvres sera surveillé quotidiennement. Si une chèvre montrait des signes de douleur (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire serait consulté et son avis serait suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation qui s’avèrerait extrême). Cependant s’il y avait des complications péri-opératoire (hémorragie incontrôlable, problème au réveil,…) les chèvres concernées seraient euthanasiées.
Choix des espèces
Ce projet concerne l’espèce caprine. Tous les animaux seront au stade adulte car les chèvres utilisées doivent avoir atteint la maturité sexuelle.
Etude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris knockout des différents récepteurs RFamide
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées puis des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau chaude, pression sur la queue, filaments de von Frey et plaque froide, pour mesurer l'effet de molécules ciblant les récepteurs RFamide sur la douleur. Les retombées thérapeutiques annoncées pour les patients sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de préciser le rôle de six récepteurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un "modèle entier" et décrit la souris comme un modèle "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que des récepteurs spécifiques sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré des lignées de souris modifiées génétiquement afin de présenter une déficience pour chacun de ces récepteurs spécifiques. L’étude de ces lignées nous permettra de mieux comprendre l’implication de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi nous pourrons envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 2900, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche pharmacologique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces 6 récepteurs ainsi que des ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones et pouvant s’y fixer), dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x4 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure Test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection composé x 10 (10 secondes) / 15 tests TIT (30 secondes) / 15 tests TPT (30 secondes) PE3 : Injection composé x1 (10 secondes) / 10 tests TIT (30 secondes) / 10 tests TPT (30 secondes) PE4 : Injection composé x1 (10 secondes) / 16 tests TIT (30 secondes) / 16 tests TPT (30 secondes PE5 : Chirurgie (20 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey (20 minutes) / 15 tests de la plaque froide (5 minutes) PE6 : Chirurgie (5 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 10 tests du Von Frey (20 minutes) / 10 tests du plantar (15 minutes) PE7 : Groupe 1 : Injection x1 (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes) Groupe 2 : Injection (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
L’étude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests effectués sont compatibles avec le bien-être de l'animal ce qui permet de réduire l’effectif. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle des récepteurs RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et d'un développement complet du système nociceptif.
Evaluation in vivo de la synergie de traitement par le composé MER-1, le temozolomide et la radiothérapie dans un modèle de greffe orthotopique de cellules de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
128 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome humain, puis six séances de radiothérapie, des traitements répétés et un suivi par bioluminescence sous anesthésies répétées. Le porteur reconnaît que la tumeur cérébrale entraîne des effets délétères "non réversibles" et une accoutumance liée aux anesthésies à la kétamine, et prévoit un test d'évitement d'obstacle pour suivre les animaux. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible", le développement du glioblastome dépendant selon lui de phénomènes complexes liés au statut hormonal.
Objectifs
Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles de rongeurs indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche majeur. Dans une étude préliminaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de glioblastomes et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons montré pour la première fois que l'activation de ce récepteur par une molécule bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison de cette molécule avec le traitement de radio et chimiothérapie actuellement prescrit contre les glioblastomes conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer dans une étude "in vivo" (sur modèle animal), en étudiant les réponses selon le sexe.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour proposer l'utilisation du composé étudié pour le traitement des glioblastomes. En effet, ce projet innovant permettra de mieux comprendre les processus responsables des différences de survenue des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettra d'apporter de nouvelles voies de stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des agonistes (molécules interagissant avec des récepteurs membranaires) de certains récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).
Procédures
- Xenogreffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections itératives IP) : durée 15 min - Traitement par radiothérapie (6 itérations) : durée 10 min pour chaque session - Traitement par le composé +/- combiné au temozolomide (12 itérations) : durée 1 min par traitement. Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min.
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus, non réversibles. Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée. Les administrations quotidiennes du composé étudié conduisent à un dérangement journalier des animaux. Les injections intra-péritonéales répétées pourront conduire à une réaction cutanée modérée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. Ainsi 80 souris seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 40 souris femelles et 40 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser des analyses histologiques et biochimiques pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris mâles ou femelles ...). En l'occurrence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
- Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées de façon prospective, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux « satellites » mâles et femelles de chaque groupe (24 souris mâles et 24 souris femelles avec un effectif de 6 souris par groupe de traitement). Si nos hypothèses concernant l’analyse des signatures moléculaires sont vérifiées (franchissement de la BHE=barrière hémato-encéphalique (barrière agissant comme un filtre protégeant le cerveau)), alors le projet sera secondairement mené sur les souris dédiées à l’étude d’efficacité/survie (de la même façon 40 souris mâles et 40 souris femelles avec un effectif de 10 souris par groupe de traitement). En raison du nombre important de souris dans l’étude, notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Ces dernières seront ainsi constituées de représentants de chaque groupe et de chaque sexe pour éviter un biais expérimental. - Concernant le nombre de souris satellites : il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs histologiques et moléculaires. Ces types d’analyses sont très fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour mettre en lumière un effet, s’il existe. Ainsi on estime - à priori - que même si l’effet des traitements sera faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour révéler une différence significative via des tests statistiques. Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, de la même façon la comparaison se fera indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures (bioluminescence) seront réalisées en suivi de traitement. Après simulation, le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé à n = 10 pour garantir une approche statistique pertinente.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique mélange kétamine/xylazine, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post-opératoire rigoureux) puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de la fenêtre temporelle d'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger, hébergement en portoir ventilé). Quel que soit le groupe, nous ne laisserons en aucun cas les animaux mourir de mort dégradée et anticiperons cette dégradation en réalisant nous-mêmes la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles rongeurs (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
Etude des mécanismes et traitements de l’insuffisance rénale chronique et ses complications vasculaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
1 674 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale leur est induite par néphrectomie subtotale en deux chirurgies ou par un régime enrichi en adénine, avec ensuite des traitements administrés par gavage et par injections répétées. Le porteur décrit des douleurs chirurgicales prises en charge, un stress lié aux gavages et aux injections rétro-orbitaires, et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable", les mécanismes de l'insuffisance rénale étant selon lui "impossibles à reproduire in vitro".
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse. De plus, les patients IRC présentent un fort risque de développer des maladies cardiovasculaires pouvant entrainer la mort avant même la mise sous dialyse. Parmi les atteintes cardiovasculaires observées chez les patients IRC, la calcification des vaisseaux est très fréquente. Notre projet vise à étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les lésions vasculaires associées à l’IRC et tenter d’identifier des cibles moléculaires de potentiels candidats médicaments contre les maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet est de mieux caractériser les mécanismes et traitements impliqués dans les lésions vasculaires associées ou non à l’insuffisance rénale.
Procédures
Les animaux subiront soit une insuffisance rénale induite par chirurgie (néphrectomie subtotale qui se déroule en deux étapes opératoires séparées de 2 semaines sur des souris âgées de 8 semaines lors de la première chirurgie, chaque intervention dure 15 à 20 minutes), ou par régime alimentaire enrichi en adénine 0.2% (souris âgées de 8 semaines alimentées pendant 4 à 8 semaines), soit une calcification vasculaire induite par un régime riche en phosphates (souris âgées de 8 semaines alimentées pendant 4 à 8 semaines). Pour ces deux régimes, la nourriture et l’eau de boisson seront en accès libres. Les animaux seront surveillés quotidiennement pendant la période de régime. Au cours du protocole, les souris subiront des examens permettant d’évaluer la fonction rénale (DFG, cage métabolique) et la fonction cardiaque (par échographie) . Les animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques ou moléculaires pendant 2 à 4 semaines qui pourront être administrés de façon chronique ou aigüe et par différentes voies : orale (gavage à la seringue, 150 à 250 µl/animal), sous-cutanée (aiguille 25G, 200 à 800 µl/animal), intra-péritonéale (aiguille 25G, 200 à 800µl/animal), intra-veineuse (aiguille 30G, 50 à 100 µl/animal). Une à deux semaines avant leur mise à mort, la fonction rénale (DFG, cage métabolique) et la fonction cardiaque (par échographie) seront à nouveau mesurées. Les animaux seront sacrifiés entre 10 et 12 semaines après la mise sous régime.
Impact sur les animaux
1. Lors des interventions chirurgicales : stress et douleur possible cependant pour pallier aux douleurs de l’intervention l’anesthésie gazeuse est associée à un anesthésique local (Lidocaïne) et un traitement analgésique (Buprécare 100g/kg). 2. Par l’introduction d’un nouveau régime : léger stress si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids > 25%, prostration, agressivité, défaut de toilettage…) ils seraient replacés en régime standard et suivi attentivement. Si leur état ne s’améliorait pas après 24h, ces animaux seraient euthanasiés. 3. Suivi régulier de leur poids et l’administration des traitements : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice versa, contention et gavages. 4. Mesure de leur diurèse (1 à 2 fois) : léger stress lié au passage (14h max) dans la cage métabolique. 5. Evaluation du débit de filtration glomérulaire : légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire, et stress léger engendré par le maintien du dispositif (pendant 60min).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter les tissus et procéder à des analyses histologiques, biochimique, biologie moléculaire. Ces études permettront de comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’IRC et la calcification vasculaire mettent en jeu des mécanismes physiologiques complexes qui sont impossibles à reproduire in vitro.
Réduction
Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et pour chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1674 souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère : 4 souris par cage équipée d’éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), et alimentée en eau ad libitum. Les animaux sont observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie, et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie qui se prolongerait au-delà de 24 heures ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions des procédures expérimentales utilisées. De plus, la souris est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et il existe un nombre importants de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt impliquées dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. L’insuffisance rénale et l’apparition des lésions vasculaires sont des processus assez longs à se mettre en place, ce qui justifie l’âge des animaux lors de la mise à mort (16-20 semaines).
Absorption intestinale et homéostasie du phosphate en situation d’insuffisance rénale chronique : étude chez des souris WT et BSP -/-
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de néphrectomie des cinq sixièmes, en deux temps, leur induit une insuffisance rénale chronique, suivie de quinze semaines de régime plus ou moins riche en phosphate, de passages en cage métabolique et de prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la chirurgie, le changement de régime et les prélèvements sont sources de douleur, et prévoit une analgésie post-opératoire. Il affirme que "seul un modèle in vivo" permet d'étudier les liens entre os, rein, intestin et aorte dans le métabolisme du phosphate.
Objectifs
La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique à cause du développement de calcifications vasculaires. En effet, le défaut de fonctionnement des reins entraine des taux élevés de phosphate circulant dans l’organisme. Nous souhaitons évaluer l’impact de la réduction de l’entrée du phosphate (=absorption) dans l’organisme sur le niveau de phosphate circulant lors de la pathologie de l’insuffisance rénale chronique et sur les complications vasculaires. Nous avons récemment découvert que des souris possédant une extinction génique de la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de phosphate réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce paramètre dans le développement des complications vasculaires au cours de l’insuffisance rénale chronique. Ce projet implique des souris contrôles et d’autres modifiées pour la BSP qui subiront une chirurgie de néphro-réduction (procédure visant à induire l’insuffisance rénale chronique). Elles recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 15 semaines avant mise à mort et prélèvements des tissus pour étudier l'impact du défaut d'absorption intestinale sur le niveau de phosphate circulant des souris malades et le développement des calcifications vasculaires.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude nous permettront d’étudier si la réduction de l’absorption intestinale du phosphate via la voie paracellulaire permet de normaliser les taux circulants de phosphate et donc d’empêcher le développement de calcifications vasculaires en condition de maladie rénale chronique.
Procédures
Certains animaux seront soumis à une chirurgie de néphro reduction des 5 /6 (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux sham auront également deux chirurgies de même durée, avec des actes mimant la néphrectomie. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures. La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 15 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 23 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. En cours de protocole, une goutte de sang sera prélevée sur les animaux anesthésiés via la veine caudale. 6 et 2 jours avant la fin du protocole, les animaux recevront une injection de tétracycline (marqueur de formation osseuse). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang va être réaliser (sur des animaux anesthésiés), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique, pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, le passage en cage métabolique, la prise de sang et les injections.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort. L’enjeu du projet est d’étudier le développement des calcifications vasculaires donc l’arche aortique sera prélevée. De plus, d’autres organes comme le cœur, les os et le rein seront prélevés. Le sang sera également collecté en vue d’observer la modification du métabolisme du phosphate et les marqueurs de dysfonctionnement rénal.
Remplacement
Nous souhaitons investiguer la relation entre l’os (lieu d’expression de la BSP), le rein (insuffisance rénale chronique) et l’intestin (absorption du phosphate) et l’arche aortique (développement de calcifications vasculaires). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.
Réduction
Avant cette étude, une étude pilote a été réalisée. Cette dernière nous a permis de déterminer le sexe des animaux utilisés dans cette étude, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. L’étude pilote a indiqué que nos animaux supportaient très bien la néphrectomie (2 décès sur 47 souris). Avec un risque d’erreur de type I choisi de 5% et une puissance souhaitée d’environ 60% ; il faut inclure au moins 10 animaux par groupe. Les données de littératures sur des animaux C57Bl6 indiquent un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie. De ce fait et prenant en compte les possibles décès des animaux suite à la chirurgie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique jugée robuste. Cela est en accord avec les résultats de notre étude pilote. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité.
Raffinement
Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de cette procédure, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections de tétracycline en fin de protocole, elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal anesthésié, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.
Choix des espèces
L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). Nous disposons au laboratoire des souris déficientes en BSP. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
233 souris vont être utilisées, dont des souris d'une lignée qui présente des lésions de la myopathie de Duchenne, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, la déclaration en comptant 143 en souffrance légère et 90 en souffrance modérée. Les souris reçoivent sous anesthésie gazeuse entre 6 et 11 injections intraveineuses de nanoparticules en 21 jours, vides ou chargées de molécules qui peuvent, selon le porteur, altérer le foie ou la rate. Elles sont utilisées entre 2 et 5 mois, avant l'âge de 7 mois où la lignée présente un "phénotype dommageable" marqué par une perte de poids et une atteinte cardiaque. Le but est de cibler les muscles malades tout en limitant l'exposition des autres organes. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et rappelle que "l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie dégénérative mortelle atteignant les garçons, caractérisée par une perte progressive de la fonction des muscles (membres inférieurs, diaphragme, muscle cardiaque). Elle est caractérisée par une grande fragilité des fibres musculaires conduisant à des blessures répétées et une inflammation chronique, aboutissant à de la fibrose. L’espérance de vie des patients atteints de DMD est d’environ 30 ans. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement curatif et le traitement palliatif utilisé, qui consiste en l'administration chronique de glucocorticoïdes, induit de nombreux effets secondaires (atrophie musculaire, obésité, fragilisation des os...). Il existe des modèles de souris pertinents présentant des signes histologiques de la pathologie proches de ce qui est observé chez les patients DMD. Il a été montré que l’administration de molécules régulant l’activité des cellules inflammatoires permet d’améliorer la fonction musculaire des souris modèles de la DMD. Cependant, un des problèmes lors de l’administration d’un traitement est sa possible captation par des organes non désirés comme le rein, le foie ou la rate, nécessitant d’augmenter les doses et pouvant conduire à des effets toxiques. Le projet vise à utiliser des nanoparticules (particules de très petite taille) pour délivrer des molécules actives dans le muscle malade en utilisant un modèle de souris pertinent. Ce projet permettra d'abord d’identifier le type de nanoparticules le plus adapté pour le ciblage des muscles et la fréquence des injections. Puis, il permettra de tester 10 molécules actives, préalablement validées comme étant anti-fibrosantes in vitro, en les couplant aux nanoparticules les plus adaptées afin d’améliorer la fonction musculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de développer de nouveaux traitements permettant d'améliorer la fonction musculaire dans un modèle de souris de la DMD qui seront potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Une biopsie de queue sera réalisé une fois (< 2 mm) pour vérifier le génotype des individus seulement sur la première portée de chaque femelle. Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse (temps d'anesthésie inférieur à 10 minutes). En considérant une durée de vie des nanoparticules dans les muscles de 24 à 72h, nous estimons le nombre total d’injections entre 6 et 11 sur une période de 21 jours.
Impact sur les animaux
Nous utilisons une lignée de souris de phénotype dommageable mais avant l’expression de ce phénotype. En effet, les animaux sont âgés de 2 à 5 mois maximum, alors que le modèle de souris utilisé ne présente un phénotype dommageable qu'à partir de 7 mois, ce qui est caractérisé par une perte de poids et une altération de la fonction cardiaque. Nous n'attendons pas d'effets indésirables sur les animaux de l'injection des nanoparticules vides car le type de nanoparticules utilisé est approuvé par l’agence des médicaments américaine et européenne pour l'injection par voie intraveineuse. En revanche, les molécules actives utilisées étant des régulateurs métaboliques, il est possible qu’elles puissent altérer le fonctionnement de certains organes tels que le foie ou la rate, même si le but de leur couplage aux nanoparticules est de limiter ces effets indésirables. Dans ce cas, nous pouvons envisager une perte de poids des animaux associée à une mobilité réduite, du stress et un comportement anormal. Le cas échéant, ces animaux seront mis à mort dès les premiers signes de souffrance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est indispensable pour ce projet car il vise à développer des stratégies thérapeutiques permettant de cibler plus spécifiquement les tissus musculaires (muscles des membres inférieurs, diaphragme) tout en limitant leur impact sur les autres organes. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l'effet de ce traitement sur des organismes entiers. La pertinence des molécules actives utilisées sera d'abord évaluée in vitro sur des cellules avant d'envisager leur utilisation in vivo. Afin de permettre une potentielle translation vers des applications cliniques, l’évaluation des différentes formes nanoparticulaires développées sur des modèles murins est la dernière étape essentielle de validation de ces nouvelles approches thérapeutiques. En outre, l’acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Pour les procédures qui aboutissent à une analyse histologique et microscopique des tissus musculaires, il a été montré que 6 animaux par point d'analyse est suffisant pour des analyses statistiques. De plus, 2 lots différents de molécules encapsulées dans les nanoparticules seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux contrôles nécessaires injectés par des nanoparticules vides (pour des raisons de manipulation, il ne sera pas possible de tester plus de 2 molécules encapsulées à la fois). Le nombre maximal d'animaux utilisés pour ce projet est de 233 souris.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage et de bien-être afin d'enrichir l'environnement des souris. Un suivi quotidien et des pesées régulières des animaux permettent d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d'un éventuel phénotype dommageable. Des prélèvements multiples sont réalisés après mise à mort sur le même individu pour des tests parallèles. Nous utilisons une lignée de souris de phénotype dommageable mais avant l’expression de ce phénotype dommageable au moment des procédures (les animaux sont âgés de 2 à 5 mois maximum), alors que le modèle pertinent utilisé ne présente un phénotype dommageable qu'à partir de 7 mois.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Le modèle de souris pertinent utilisé présente des signes histologiques de la pathologie proches de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois mais ne présente un phénotype dommageable qu’à partir de 7 mois. Les animaux sont utilisés entre 2 et 5 mois d'âge (âge adulte et évolution de la pathologie pour le muscle dystrophique).
Étude de l’effet du blocage du métabolisme des acides gras par traitement préventif dans un modèle murin d’asthme chronique allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Jusqu'à quarante-quatre instillations d'allergène dans le nez sous anesthésie gazeuse, plus deux injections d'allergène dans l'abdomen : des souris femelles sont ainsi rendues asthmatiques, parmi 144 utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un fragment d'anticorps censé bloquer le métabolisme des acides gras et réduire le remodelage des bronches, puis, sous anesthésie, une trachéotomie permet de mesurer la respiration des souris avant leur mise à mort sans réveil et le prélèvement de leurs organes. Le porteur choisit des femelles parce que l'asthme sévère est plus fréquent chez la femme, et prévoit de traiter par bronchodilatateur l'essoufflement qui peut suivre les instillations. Les points limites se résument à des "critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire", sans aucun seuil chiffré.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique au moment d’installation des caractéristiques de l’asthme est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.
Bénéfices attendus
Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à quarante-quatre (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie, l’opérateur observera les animaux et toute dyspnée sera corrigée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nos expériences ne seront pas répétées. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce aux pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Afin d’analyser l’inflammation broncho-alvéolaire nous utilisons les 6 animaux par groupe.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.
Rôle des protéines tyrosines phosphatases Shp1 et Shp2 dans la myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour leurs prises de sang, des souris anesthésiées ont le bout de la queue sectionné sur moins d'un millimètre, puis la croûte grattée pour les quatre prélèvements suivants. 1 290 souris, dont des souris porteuses de la mutation JAK2V617F associée à la myélofibrose, vont être utilisées puis toutes tuées pour prélever leur sang et leur moelle osseuse, la déclaration en comptant 872 sans réveil, 58 en souffrance légère et 360 en souffrance modérée. Le porteur affirme que les traitements n'ont "aucun impact négatif sur l'animal", et indique que la plupart des souris les reçoivent par voie orale "sur animal vigile". Il écrit aussi que les expériences ont "toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées".
Objectifs
Les mégacaryocytes (MKs) sont de grandes cellules polyploïdes qui résident dans la moelle osseuse et libèrent continuellement les plaquettes dans la circulation sanguine. Une production réduite de plaquettes entraine une thrombopénie et des complications hémorragiques. Alors qu’un nombre élevé de plaquettes résultant d’une prolifération incontrôlée des MKs, conduit à une famille d’affections clonales appelée les néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) et la myélofibrose (MF). Ces pathologies sont causées par une signalisation tonique du récepteur Mpl de la thrombopoiétine (Tpo), le principal régulateur de la prolifération des MKs. De plus, les MKs sont le moteur de la MF et du remodelage destructeur de la moelle osseuse qui accompagne les NMPs, en raison de la libération excessive de cytokines et de facteurs de croissance pro-fibrotiques. Une mutation récurrente de la Janus kinase 2, JAK2V617F, est présente dans plus de 80% des patients atteints de NMPs. JAK2 est une enzyme de la famille des tyrosines kinases et est impliquée dans la transduction du signal de différentes cytokines telles que la Tpo. Cette mutation activatrice JAK2V617F est responsable d’une activation constitutive en absence de cytokines, responsable ainsi d’une prolifération accrue et incontrôlée des MKs responsables de la myélofibrose. A ce jour, les médicaments utilisés en clinique tels que les inhibiteurs de la voie JAK (ruxolitinib), en combinaison avec d’autres inhibiteurs de kinases (selutinimib), ont apporté́ de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Nos études précédentes chez la souris ont permis de mettre en évidence un rôle primordial de deux enzymes cytoplasmiques, les tyrosine phosphatases Shp1 et Shp2, dans la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes (Mazharian et al., Blood 2012 ; Nagy et al., Blood 2019). De plus, il a été proposé que Shp2 est phosphorylée dans les cellules hématopoïétiques des patients atteints de NMPs. Actuellement, un inhibiteur de Shp2 (Shp099) est utilisé en clinique dans le traitement de certains cancers à tumeurs solides. Ainsi, elles représentent des cibles prometteuses dans le traitement des NMPs et la myélofibrose associée.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles cibles importantes impliquées dans le néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des symptômes et de la myélofibrose chez les patients. En effet, à ce jour, les médicaments utilisés en clinique ont apporté́ de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Un deuxième bénéfice important est de cibler certaines cellules spécifiques. Actuellement, les traitements utilisés touchent différentes cellules. Ce projet vise à identifier des cibles bien spécifiques des mégacaryocytes, qui sont les cellules impactées dans ces pathologies. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement.
Procédures
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections, soit en i.p., soit en s.c ou lors des traitements par voie orale. Les traitments ont comme impact de diminuer modérément et transitoirement la production des plaquettes, de sorte qu’ils n’ont aucun impact négatif sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront majoritairement soumis à un traitement par voie oral sur animal vigile. Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang par section de moins de 1 mm à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les 4 autres prélèvements (toujours sur souris anesthésiée).
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous sacrifiés pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse.
Remplacement
La myélofibrose est une pathologie complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire in vitro. Il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Par conséquent, il est déterminant d’utiliser un modèle animal qui récapitule la myélofibrose induite par la mutation JAK2 et de pouvoir tester différents agents pharmacologiques sur l’évolution de la pathologie in vivo.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux sera minimisé : une même souris sera destinée à l’analyse de plusieurs paramètres, et plusieurs champs seront acquis par animal permettant de visualiser le plus d’évènements cellulaires. Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles disponibles au laboratoire. Les tests statistiques seront utilisés pour analyser les données obtenues entre les différents génotypes de souris. Les effectifs sont calculés suivant la loi normale N(μ ; σ). Le critère recherché est la comparaison de moyennes. On aboutit à n=18/d² avec d=|μ1 - μ2|/σ Pour les études in vivo, le nombre d’animaux par lot est n=18. Pour les études in vitro, le nombre d’animaux par lot est n=6, nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’une quantité suffisante de sang par condition. Le sang d’un animal ne pouvant pas être utilisé pour les 5 tests, car en quantité insuffisante par animal. Les groupes sont comparés par un test Anova ou Mann-Whitney.
Raffinement
Raffiner : Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées maintenue au chaud tout au long de l'expérience pour éviter une hypothermie due à l'anesthésie/l’analgésie. Pendant leur hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation et la présence de frisure de papier, de coton et le carré de cellulose pour enrichir l'environnement ainsi que de la nourriture déposée au fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux publiés montrant la génération de souris génétiquement modifiées permettant de modéliser la myélofibrose humaine. C’est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes d’intérêt sont inactivés. Nous nous baserons sur le même modèle : une lignée de souris présentant une mutation constitutive de JAK2V617F (JAK2KI/+) (Marty et al, Blood 2010). Ces animaux seront traités avec différents agents pharmacologiques pour tester leur effet sur la numération plaquettaire et l’évolution de la maladie, afin d’évaluer leur rôle protecteur /curatif sur le compte plaquettaire et la myélofibrose. Sur la base de ce modèle, nous générerons une lignée de souris quadruple mutantes, JAK2KI/+Shp1FL/FLShp2FL/FLGp1bCreKI/+, dans lesquelles les enzymes Shp1/Shp2 sont invalidées dans la lignée mégacaryocytaire. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 6 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise.
Etude du rôle de MKP1 dans le développement des troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Un état de type dépressif leur est imposé par deux modèles de désespoir, dont une induction de "désespoir acquis" par une méthode non précisée, suivie du test d'évitement, de la nage forcée cinq jours de suite, de la suspension par la queue et de la préférence au saccharose. Le porteur décrit ces atteintes de façon succincte et encadre les procédures par des points limites. Il affirme qu'il lui est "impossible" de recourir à des méthodes alternatives, seul l'animal vigile permettant selon lui d'évaluer les conséquences émotionnelles.
Objectifs
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles dépressifs dans le but d'établir des traitements plus adaptés contre la dépression. Nous utiliserons un modèle de dépression induite par de stress aigu (modèle de désespoir acquis) afin d'étudier l'expression de MKP1 par qPCR chez des souris susceptibles et résistantes à ce modèle de dépression en les comparant aux souris contrôles. Dans ce même modèle, nous allons utiliser des souris qui n'expériment pas le gène codant pour la protéine MKP1 ainsi que leurs congénères WT afin de déterminer si la seule absence de MKP1 suffit à empêcher le développement d'un comportement de type dépressif suite à l'induction du désespoir acquis. Avenant: Suite aux résultats obtenus, notre hypothèse principale est que MKP1 semble être nécessaire au développement de troubles de type dépressifs sur le long mais pas sur le court terme. Afin de confirmer ou infirmer notre hypothèse, nous souhaitons étudier le rôle de MKP1 dans un autre modèle de désespoir (MDC), qui est chronique, contrairement au modèle de désespoir acquis qui se base du du stress aigu. Cet avenant servira d'expérience pilote à l'établissement d'une nouvelle saisine utilisant ce modèle, si les résultats sont concluants.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles de type dépressifs. Avenant: Utiliser un modèle de désespoir chronique nous permettra de savoir si MKP1 est nécessaire au développement de troubles dépressifs sur le long terme, alors que cela ne semble pas être le cas sur le court terme.
Procédures
Les animaux du modèle du learned helplessness subiront (objectif 1 et 2 qui correspondent aux procédures 1, 2 et 3): pour les animaux contrôles: environ 10 min de test d'évitement actif ; pour les animaux LH: 2 séances de 50 min d'induction du modèle + environ 10 min de test d'évitement actif. Avenant: Les animaux de l'avenant seront soumis au test de préférence au saccharose en continu, au modèle de nage forcée 10 min/ jour pendant 5 jours consécutifs + 10 min de nage le 32ème jour, une fois à la pulvérisation d'eau sucrée et une fois au test de suspension par la queue.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO. Avenant: Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO.
Devenir
Procédure 1: n=300 animaux max qui sont maintenus en vie et passent en procédure 2 (n=240 max) ou en procédure 3 (n=60 max). Procédure 2: n=240 animaux max qui sont maintenus en vie passent en procédure 3. Procédure 3: n=300 animaux max mis à mort. Procédure 4: n=40 animaux max mis à mort.
Remplacement
Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les effets conséquences émotionnelles sur l’animal vigile. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous génotypons les animaux avant les expériences afin de n'utiliser uniquement ceux dont nous avons besoin (WT et KO). Nous effectuons également les manipulations par petits lots d'animaux afin d'arrêter les expériences lorsque le nombre d'échantillons de bonne qualité est atteint, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés à long terme.
Raffinement
Les expériences menées sont encadrées par des points limites adaptés, et construites de manière à ce que les souris subissent le moins de stress/angoisses/souffrances possible (transport via un tunnel, enrichissement dans la cage...).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. De plus, le modèle de la souris nous permettra de pouvoir utiliser une lignée de souris dont le gène codant pour MKP1 a été inactivé (knock-down) afin d'approfondire notre étude. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Ischémie reperfusion en condition hyperglycémique: cardioprotection par l’exercice et rôle du NO
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie court quarante-cinq minutes de tapis roulant cinq jours sur sept pendant cinq semaines, avant une ischémie-reperfusion cardiaque menée in vivo sous anesthésie avec pose d'une sonde de pression dans le ventricule. Le porteur reconnaît que l'exercice "peut être stressant" et prévoit des points limites et une euthanasie décidée avec le responsable de l'animalerie. Il affirme qu'il "n'existe aucun modèle de substitution in vitro" pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l'exercice en contexte hyperglycémique.
Objectifs
L’hyperglycémie aigue semble pouvoir être à l’origine de dysfonctions mitochondriales notamment caractérisées par une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau cellulaire, conduisant à l’établissement d’une situation de stress oxydant. Cette surproduction de ROS au cours de l’hyperglycémie serait capable d’impacter la dynamique du réseau mitochondrial en favorisant la fission (ou fragmentation) mitochondriale. A l’échelle du muscle cardiaque, ces phénomènes pourraient contribuer à l’établissement d’un phénotype plus sensible au stress et ainsi à une plus grande vulnérabilité du cœur à un syndrome ischémique. Ceci pourrait ainsi permettre d’expliquer que le niveau de glycémie lors de l’admission à l’hôpital de sujets non diabétiques soit un facteur prédictif de la sévérité des lésions d’ischémie-reperfusion. Nos premiers travaux sur le sujet, conduits ex vivo, tendent à confirmer que l’hyperglycémie au moment de l’infarctus du myocarde favorise la production de ROS ainsi que la fragmentation mitochondriale au cours de l’ischémie reperfusion. Parmi les stratégies de cardioprotection efficace à la fois dans les modèles expérimentaux et chez l’homme, l’exercice physique est reconnu comme permettant de diminuer la taille de la zone nécrosée suite à un infarctus du myocarde, notamment via sa capacité à moduler la production de ROS et stimuler le métabolisme du monoxyde d'azote (NO). Les effets de l’exercice physique sur la dynamique mitochondriale restent à ce jour mal décrit. Par ailleurs, à ce jour, l’impact de l’hyperglycémie aigue sur la capacité de l’exercice physique à pré-conditionner l’organe cardiaque et à limiter les lésions au cours de l’infarctus reste mal décrit et les mécanismes sous-jacents non investigués. En résumé les objectifs de cette étude sont: (1) Evaluer l'impact de l'hyperglycémie aigue sur la production de ROS ainsi que sur la fission mitochondriale au cours de l’ischémie-reperfusion myocardique. ; (2) d’évaluer si le pré-conditionnement par l’exercice physique est toujours efficace en condition d’hyperglycémie et enfin (3) évaluer le rôle du NO dans ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental devrait permettre de mieux appréhender les mécanismes cellulaires sous-jacents à la vulnérabilité accrue du cœur à l’ischémie-reperfusion lors de situations transitoires d’hyperglycémie. Ceci pourra peut-être permettre, à plus long terme d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME (50mg/kg, ip) 14h00 avant l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Les animaux seront traités ou non au préalable avec un inhibiteur de l’enzyme responsable de la synthèse de NO. La fonction cardiaque sera mesurée au cours de la reperfusion par l’implantation d’une sonde millar de pression dans la cavité ventriculaire (voie artérielle) et par la pose d’électrodes de surface pour l’électrocardiographe (ECG). Au total 120 rats seront nécessaires durant cette étude afin de disposer de l'effectif minimum permettant de mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Cet acte expérimental peut être stressante pour les animaux. Afin de limiter le stress, les animaux sont acclimatés au tapis de course pendant une semaines, 1h00 par jour. Enfin, les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME, un inhibiteur des NOS, 14h00 avant l'acte exéprimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle de l'état clinique de ces animaux sera réalisé pour différents critères physiologiques et comportementaux. Si nécessaire, la prise de décision d’euthanasie sera réalisée avec le responsable de l’animalerie. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Afin de limiter toute souffrance chez les animaux durant cette procédure sans réveil, une anesthésie chimique sera réalisée (isoflurane 4.5% puis 1.5-2%) associée à une analgésié pré-opératoire (buprénorphine; 0.3mg/kg).
Devenir
A l'issu de l'ischémie reperfusion in vivo" la totalité des animaux sont euthanasiés par injection d'une dose léthale de pentobarbital, afin de permettre le prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l’exercice physique sur la fonction cardio-vasculaire lors d’un stress hyperglycémique. L'animal permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient soumis à une hyperglycémie aigue. Basé sur l’expérience du laboratoire dans le domaine, les programmes d'entrainement modéré des animaux seront basés sur les mêmes paramètres physiologiques que chez le patient pour se rapprocher aux mieux des conditions cliniques et valider ou non cette stratégie de cardioprotection en condition hyperglycémique.
Réduction
Nos travaux préalables conduits ex vivo ont déjà permis de réduire considérablement le nombre d’animaux nécessaires à cette étude et d’identifier des conditions particulières nécessitant l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont soit non invasives (protocole d'entrainement), ou finalement sans réveil (anesthésie létale suivit d’un prélèvement d’organe). Au cours de l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion in vivo, les animaux seront anesthésiés (Isoflurane) puis analgésiées (injection sous cutanée de buprénorphine 0.3mg/kg). Enfin, les rats seront logés dans des cages de 3 individus, avec nourriture ad libitum et accès à de l’eau fraiche. Un enrichissement de l’environnement sera présent et régulièrement renouvelé (tunnels, abris, cube de bois, coton). Un animalier formé contrôlera le bien-être des animaux tous les jours et nettoiera les cages une fois par semaine.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation du même animal in vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade de jeune adulte (rats de 12 semaines)
Evaluation de nouveaux traitements pour le diabète de type 1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Spontanément diabétiques, elles reçoivent chaque semaine pendant quatorze semaines une injection de protéines à tester, subissent un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang répétés, avant une ponction aortique terminale. Le porteur signale le stress lié aux manipulations, au gavage et aux mesures de glycémie, et rappelle que ces souris résistent tardivement à l'acidocétose. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'efficacité des composés dans un modèle proche de la maladie humaine avant tout essai clinique.
Objectifs
En 2021, le nombre de diabétiques de type 1 (DT1) dans le monde était de 8,4 millions dont 20% ont moins de 20 ans. Plus de 500 000 nouveaux cas apparaissent chaque année et ce chiffre est en constante augmentation. A ce jour, le seul traitement des DT1 approuvé à ce jour est l’insuline. Néanmoins, des complications sévères peuvent se développer et l’espérance de vie des DT1 est réduite de 10 à 15 ans comparé à un individu non diabétique. Le DT1 survient suite à la destruction auto-immune de la plupart des cellules bêta β. Néanmoins, il persiste un petit nombre de cellules bêta fonctionnelles même 50 ans après le diagnostic. Il a par ailleurs été montré, en particulier dans un modèle de DT1 présentant des caractéristiques proches du DT1 humain, la souris diabétique, qu’activer la prolifération des cellules bêta prévenait l’apparition du DT1 dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de sélectionner une nouvelle molécule présentant un effet antidiabétique grâce à l’augmentation de la masse des cellules bêta pancréatiques, seul ou en combinaison avec les traitements existants et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques chez le patient diabétique de type 1.
Procédures
Chaque animal recevra une fois par semaine pendant 14 semaines une injection des protéines à tester ou du véhicule (14 injections) plus une administration de glucose le jour du test de tolérance au glucose, test qui dure 120 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal vigile : - 1 goutte de sang une fois par semaine pendant 14 semaines pour la mesure de la glycémie (durée de prélèvement 2-5 secondes) - 6 prélèvements de sang le jour du test de tolérance au glucose (durée de prélèvements 2-5 secondes, ou de 30 à 60 secondes pour les 4 temps où l'insuline sera dosée dans le plasma). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié : ponction aortique immédiatement avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux avec un diabète de type 1 (DT1), qui apparaît spontanément dans le modèle utilisé. La principale complication du DT1 est l’acidocétose diabétique, résultant de l’accumulation de corps cétonique dans le sang. Cependant, les souris utilisées ont la particularité d’être résistante à l’acidocétose, ou du moins son apparition est tardive (souris de plus d’un an); et leur utilisation dans ce projet est à 6 mois d’âge au maximum. Les nuisances attendues liées aux expérimentations sont: le stress dû aux multiples manipulations et mesures de glycémie, au gavage et éventuellement au point d'injection pour l'administration d'insuline. Les techniques employées dans ce projet pour suivre la glycémie sont des techniques utilisées également chez l’homme, comme le test de tolérance au glucose.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt, tels que le pancréas pour mesurer la masse des cellules bêta et évaluer l’infiltration par les cellules immunitaires et le thymus et la rate pour réaliser un profil immunologique.
Remplacement
L’objectif final du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés sélectionnés au préalable sur des tests in vitro pour le traitement du diabète de type 1. Cependant, avant tout essai clinique, il est nécessaire de démontrer l’efficacité de ces composés dans des modèles physiopathologiques dont les caractéristiques sont proches de la pathologie humaine.
Réduction
Les produits testés dans le projet sont des produits qui auront montré un effet positif significatif dans des tests in vitro (lignées de cellules bêta pancréatiques et îlots de Langerhans). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie, sachant que l’incidence du diabète est de 60 à 80% chez la souris femelle spontanément diabétique que nous allons utiliser. Pour limiter le nombre d‘animaux utilisés, 3 protéines seront testées par étude, évitant ainsi de multiplier le nombre de groupes contrôles. Par la suite, la protéine d’intérêt sélectionnée sera testée en combinaison avec une seule dose de produit commercial (dose usuelle dans la littérature) afin de limiter le nombre d’animaux par étude.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés à au moins 3 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels, de matériaux de nidification et de bûchettes de peuplier à ronger. Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les points limites sont les suivants : troubles du comportement; signes d'absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale); perte de poids supérieure à 20%. L’ensemble des procédures de ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation.
Choix des espèces
Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie et sont souvent utilisées comme modèles de pathologie humaine comme le diabète. Nous utiliserons une lignée de souris spontanément diabétique comme le modèle de choix du DT1, de par leur susceptibilité au développement spontané d’un diabète auto-immun avec des caractéristiques similaires au diabète humain de type 1. Il s'agit de jeunes adultes, âgés de 6 à 9 semaines à la livraison, qui seront traités pendant 14 semaines par les molécules à tester ou le placebo. Après acclimatation au sein de notre animalerie pendant au minimum une semaine, les traitements commenceront à l’âge de 9 – 10 semaines. A cet âge les souris sont déjà diabétiques mais sans que la maladie ne soit trop grave et provoque une acidocétose. Chez l'Homme, le diabète de type 1 apparait majoritairement chez les adolescents et jeunes adultes.
Mise au point de la cavitation ultrasonore pour la délivrance de chimiothérapie et le traitement du cancer du pancréas dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
739 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections de chimiothérapie et un traitement par ultrasons de puissance pendant cinq semaines, avec un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut causer une perte de poids et des signes de souffrance, pris en charge par analgésie, et qu'une soixantaine d'animaux subissent une chirurgie supplémentaire pour l'implantation de sondes. Il affirme que les cultures cellulaires en 3D ne représentent pas la physiologie tumorale et juge le modèle animal seul capable de la reproduire.
Objectifs
Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic. La raison principale de ce mauvais pronostic est que l’environnement de la tumeur (appelé stroma) est très dense et empêche la chimiothérapie d’atteindre sa cible. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie d’être plus efficace. Les ultrasons de puissance, focalisés, permettent de modifier cet environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains. En l’appliquant aux tumeurs du pancréas nous souhaitons savoir si ces ultrasons de puissance permettet d'améliorer l'efficacité de la chimiothérapie. Le projet se déroulera en deux phases : une première phase déterminera les paramètres ultrasonores optimaux augmentant l'efficacité de la chimiothérapie dans des tumeurs greffées. La deuxième phase utilisera ces réglages pour les appliquer dans un modèle génétique de tumeurs du pancréas, plus proche de la maladie humaine, mais pour lequel il est compliqué d’avoir suffisamment de tumeurs comparables en même temps pour réaliser une étude et nécessitant un nombre important d'animaux à élever. Ce projet de recherche translationnelle d’une durée de 3 ans mettra en œuvre un maximum de 739 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de valider le système de traitement ultrasonore ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais chez les patients pour traiter le cancer du pancréas par endoscopie.
Procédures
Pour la première phase de l'étude, des souris dépourvues de système immunitaire seront utilisées. Parmi ces souris, certaines se verront injecter des cellules tumorales par injection sous-cutanée (210 animaux). La croissance de ces tumeurs peut prendre jusqu'à 6 semaines . Les autres seront opérées sous anesthésie générale et analgésie pour greffer dans le pancréas des fragments tumoraux issus de ces tumeurs sous cutanées (489 animaux). Ces tumeurs mettent 3 semaines à se développer. Ces souris recevront ensuite des injections intra-péritonéales de chimiothérapie ainsi qu'un traitement par ultrasons de puissance pendant 5 semaines. Pour suivre la croissance des tumeurs dans le pancréas et leur réponse au traitement, les souris seront examinées par imagerie non-invasive sous anesthésie générale. Pour mesurer de manière précise les effets des ultrasons de puissance, certains animaux greffés (60) subiront une opération chirurgicale sous anesthésie générale pour appliquer des sondes de mesure directement dans la tumeur, les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Pour la deuxième phase de l'étude, des souris génétiquement modifiées seront croisées pour obtenir une mutation conduisant au développement de tumeurs du pancréas. Ces 40 souris voient appraître des tumeurs entre 10 et 20 semaines et seront ensuite traitées 5 semaines par injection intra-péritonéale de chimiothérapie et par ultrasons de puissance sous anesthésie générale. Tous ces animaux seront suivis par imagerie non-invasive pour suivre la croissance des tumeurs, et caractériser l'effet du traitement.
Impact sur les animaux
La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer des pertes de poids et des signes de souffrance si celles-ci sont trop importantes, d'où un suivi précis par imagerie non-invasive et une prise en charge de la douleur par analgésiques. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical, prise en charge par une analgésie adaptée.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort et les tumeurs prélevées seront utilisés pour les procédures 2 à 7. Tous les animaux des procédures 2 à 8 sont mis à mort en fin d'étude pour analyser les tumeurs qu'ils portent et caractériser les effets du traitement.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer la plage de fonctionnement à utiliser pour les ultrasons de puissance et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire 3D. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral (vascularisation, potentiel métastatique, réponse immune), seul un modèle animal le permet.
Réduction
Le nombre de souris suivies est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentiels et limitant le degré de souffrance des animaux, les tumeurs étant détectées très tôt. Les résultats de cette étude permettront de réduire par la suite le nombre d’animaux sur le modèle de référence.
Raffinement
Le suivi de la douleur et du stress sera réalisé un à deux fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort si nécessaire. Un suivi plus fréquent est prévu en suite opératoire et après injection des traitements. Les procédures d’imagerie et de chirurgie seront réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Dans ce projet de mise au point, les principaux organes seront prélevés afin de déceler d’éventuelles métastases. Les animaux seront hébergés dans des cages disposant d’enrichissement (tubes en carton et cotons compactés).
Choix des espèces
La souris est un bon modèle de tumeurs du pancréas et nous avons besoin de lignées spécifiques n'existant pour certaines que chez la souris. Les animaux utilisés pour les greffes de tumeur du pancréas seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines), les animaux transgéniques développant des tumeurs à partir de l'âge adulte (au delà de 10 semaines).