Procédures modérées

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le coussinet adipeux mammaire sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant un mois d'un pro-médicament expérimental activé par les espèces réactives de l'oxygène. Le porteur ne détaille guère les nuisances liées à la croissance tumorale au-delà de la mention des greffes, et prévoit des points limites précoces. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" d'utiliser un modèle in vivo, le système immunitaire étant selon lui impossible à reconstituer in vitro.

Objectifs

Le mode d'action de la majorité des agents chimiothérapeutiques, qui ont été cliniquement approuvés pour le traitement de cancers hématologiques, reposent sur un ciblage rapide des cellules en croissance. Cependant, en dehors des cellules cancéreuses, certains types de cellules non malignes présentent également une telle propriété. Par conséquent, bien que de grands progrès aient été réalisés dans ce domaine au cours des dernières décennies, la spécificité des chimiothérapies est encore faible. Ce problème peut être approché en utilisant des médicaments anti-tumoraux ciblés. Cependant, les cancers qui dépendent d’un seul récepteur ou enzyme sont rares. Un ciblage plus robuste peut être potentiellement atteint par l’activation de pro-médicaments dans le microenvironnement spécifique du cancer. Il a été démontré que la majorité des cellules cancéreuses surproduisent les ROS (espèces réactives de l’oxygène) alors que dans les cas des cellules non-malignes, leur concentration est extrêmement faible. Étant donné que la production élevée de ROS semble être une caractéristique générale du cancer,, les pro-médicaments activés par les ROS sont potentiellement applicables pour le traitement de nombreux types de cancer différents. Nous nous intéressons particulièrement à un pro-médicament, dérivé du N-alkylaminoferrocene. Cette molécule induit une mortalité cellulaire via la perturbation des lysosomes, l’augmentation de la production de ROS, l’arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1 et d'autres mécanismes. Le traitement avec cette molécule chez la souris greffée nous permettra de confirmer l’effet anti-tumoral constaté in vitro. L’analyse des tumeurs (microenvironnement) après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule de stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec le médicament testé en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une greffe dans dans les coussinets adipeux mammaires (animal sous anesthésie générale) une fois (durée 15 minutes) puis à des injections intra-peritonéales (anesthésie locale), 3 fois par semaine pendant 1 mois (durée

Impact sur les animaux

Greffes de tumeurs en sous-cutané.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin pour analyses.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo. Nous avons choisi le modèle souris car notre projet s'applique à étudier l'implication du système immunitaire dans la lutte anti cancéreuse chez le mammifère. La souris est le mammifère le plus utilisé en expérimentation animale car suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler et suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Ceci a été confirmé par des calculs de puissance (puissance à de 80% et risque alpha à 5%). Pour cette expérience, on peut attendre une réduction de 20% de la taille de la tumeur dans les groupes traités par rapport au contrôle, avec une déviation standard d’environ 17%. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux témoins. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale seront des tests longitudinaux de suivi individuel permettant d'augmenter la puissance et de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (évaluation des experssions faciales), et examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.

Objectifs

Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.

13 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de trois à quatre heures pour l'implantation d'un substitut vasculaire tissé posé en pontage entre carotide et jugulaire, puis des contrôles échographiques répétés sous anesthésie et une ponction à l'aiguille simulant l'hémodialyse. Le porteur mentionne parmi les nuisances l'absence de traitement anti-inflammatoire, un risque d'hémorragie et de déchirement du greffon, et prévoit la mise à mort à quatre et huit semaines pour prélever le vaisseau. Il affirme qu'une implantation "chez le gros animal" est "indispensable" et que la brebis est la seule espèce dont les cellules produisent les feuillets recherchés.

Objectifs

Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.

Procédures

Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post- implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.

Impact sur les animaux

La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.

Devenir

A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.

Remplacement

Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.

Réduction

Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.

Raffinement

Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.

Choix des espèces

Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.

400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux incisions dans le dos permettent de glisser sous la peau un biomatériau à base d'acide polylactique, dont on veut évaluer la biocompatibilité en vue d'applications de régénération osseuse dentaire chez l'humain. Le porteur indique une inflammation de la zone opérée, une possible désunion de la plaie et un risque d'infection inférieur à 10 %, et précise que les prélèvements de peau ne sont faits qu'après la mise à mort. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" ni de méthode in silico pour vérifier la biocompatibilité dans un organisme vivant.

Objectifs

La pose d'un implant dentaire est généralement entravée par un volume osseux limité au niveau de l'os de la machoire. Afin d'augmenter ce volume osseux et assurer la pose efficace de l'implant, la greffe osseuse , technique de référence, est utilisée. Cependant cette technique présente des inconvénients. La nécessité de procéder à deux actes chirurgicaux (prélèvement et greffe), la faible quantité d'os disponible lors du prélèvement ainsi que les suites post-opératoires et les complications potentielles nous pousse à l'innovation et au développement de nouvelles techniques de régénération osseuse moins invasives. La régénération osseuse guidée (ROG) utilise des matériaux sous forme de membranes qui ont pour rôle de séparer le défaut osseux à régénérer des tissus mous périphériques (peau, muqueuse et muscle). Ces membranes barrières vont donc empêcher la colonisation du défaut osseux par ces tissus indésirables et favoriser la prolifération et la migration des cellules d'origine osseuse dans le défaut osseux. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées, mais leur manque de propriétés régénératrices, leur manque de tenue mécanique ainsi que leur résorption rapide pousse la recherche à dévelloper de nouvelles générations de membranes afin d'améliorer leurs propriétés. Ce projet de recherche vise (1) à étudier la compatibilité et (2) à évaluer la dégradation de nouvelles membranes fabriquées au laboratoire. Les études in vitro préalablements effectuées ont permis de sélectionner des membranes avec un potentiel thérapeutique important (dégradation, régénératrice et antimicrobien). Leur innocuité a été évaluée, mais les études in vitro ne peuvent modéliser la complexité des systèmes physiologiques mis en place lors de la réponse inflammatoire et lors de la cicatrisation in vivo. Le recours a un modèle animal est donc un préalable préclinique essentiel pour envisager une plausible application en clinique humaine. Pour ce projet, nous choisissons de travailler avec le rat, car l'enssemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font de cet animal, le modèle préférentiel pour mener à bien cette étude. Nous étudierons la biocompatibilité et la résorption de différentes membranes fabriquées à partir de polymères secondairement fonctionnalisées. Ces membranes seront implantées sous la peau dans le dos des animaux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court terme sont : (1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire (absence de réaction inflammatoire exacerbée et absence de fibrose cicatricielle au contact des membranes, (2) le développement de biomatériaux à dégradation tissulaire contrôlée pour une utilisation en ROG. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer en clinique chez l’homme, des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et biomécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles sur le marché dans le but de répondre à des impératifs cliniques élargis et adaptées à des situations pathologiques spécifiques (médecine régénératrice personnalisée). La réalisation de ce projet d’expérimentation animale sur le rat permettrait de confirmer la pertinence de la stratégie thérapeutique de vouloir améliorer les propriétés de membranes actuellement commercialisées destinées à la ROG.

Procédures

Les animaux seront sousmis à une seule procédure chirurgicale consistant à réaliser 2 incisions dans le dos, une de chaque côté de 1,5 - 2 cm afin de glisser sous la peau un biomatériau. La durée de la procédure chirurgicale n'excédera pas 5 minutes. Les analyses thermique seront pratiquées sur des animaux anesthésiés. Les prélèvements tissulaires (peau) ne seront réalisés qu'après la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues d'après la littérature occasionnées lors de cette procédure sont : une inflammation aigüe et subaigüe de la région opérée suite au décollement sous-cutanée et la mise place du biomatériau, une désunion des berges de la plaie et un risque d'infection de la plaie cutanée (

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de pouvoir procéder au prélèvements tissulaires et biologiques sans souffrance.

Remplacement

Les études in vitro permettent d'évaluer la cytotoxicité et la réponse inflammatoire induites par les biomatériaux. Pour une utilisation en clinique humaine la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) candidat doit être vérifiée par une implantation dans un organisme vivant. A ce jour il n’existe pas d’alternative ni de méthode in silico permettant de répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Nous utiliserons au minimum 6 rats et au maximun 10 rats par lot, nombre calculé pour permettre d'obtenir des résultats scientifiques probants et staristiquement significatifs. Dans l'optique d'une réduction maximale du nombre d'animaux à inclure, des analyses intermédiaires à 6 et 8 animaux/lot seront réalisées avant d'augmenter le nombre d'individus le cas échéant afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire (Stratégie go - no go).

Raffinement

A leur arrivée à l'animalerie les rats subiront une phase d'acclimatation de 14 jours aux conditions d'hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux (surface : 800 cm2 et hauteur : 18 cm) dans un environnement monitoré (20-24 °C ; cycle 12h lumière - 12h obscurité) avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage (en respectant une surface minimum de 250 cm2 par animal). La nourriture et l'eau seront mis à disposition ad libitum et la litière sera changée régulièrement. Les cages seront enrichies de tubes en carton avec lesquels les animaux construiront un nid et du sizzle-dry kraft. Après la procédure chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages individuelles jusqu'au retrait des fils (dépose des sutures prévues à 7 jours post-opératoires pour les lots concernés). Une analgésie préventive par injection de buprénorphine (0.05 mg/kg, en sous-cutanée dans la région abdominale) en post-opératoire immédiat (avant réveil des animaux) sera pratiquée et poursuivie pendant 72h à la demande en fonction du obtenus à partir d'une grille d'évaluation de la souffrance et du Bien-être animal reconnue (Morton et Griffiths, 1985). Une surveillance clinique biquotidienne au minimum durant les 4 premiers jours post-opératoires sera mise en place. A partir du 5ème jour, une surveillance uni-quotidienne pourra être envisagée si le score clinique le permet (score inférieur ou égal à 3), dans le cas contraire une surveillance biquotidienne sera maintenue jusqu'à l'obtention d'un score inférieur ou égal à 3. En cas d'atteinte d'un niveau défini de points limites, la mise à mort de l'animal sera anticipée. Après la dépose des fils, les animaux seront réunis par 2 ou 3 par cage jusqu'à la fin de l'expérimentation afin de garantir leur bien être et leur vie sociale.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation sous-cutanée est considéré comme une référence pour évaluer la réponse biologique (inflammation, cicatrisation et remodelage) vis-à-vis d’un biomatériau. Différentes espèces animales peuvent être utilisées mais le rat reste l’espèce de référence de par sa taille (en comparaison de la souris) favorisant une acte opératoire reproductible et rapide. Le rat immunocompétent est choisi car il permettra d’apporter une réponse vis-à-vis de la réaction immunitaire induite par l’implantations des membranes en PLA fonctionnalisées. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Sprague-Dawley et Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie (Wistar). Les animaux utilisés dans cette étude sont des rats adultes âgés de 8 à 12 semaines pesant entre 200-300g. Des rats juvéniles ne seront pas adaptés pour l’implantations des différentes membranes (1cm x 1cm). Généralement, des rats âgés de 8 à 12 semaines sont habituellement utilisés dans la littérature.

110 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien directement dans le cerveau par voie stéréotaxique pour induire une neuro-inflammation, puis des injections d'un candidat-médicament et une imagerie TEP sous anesthésie avec un traceur radioactif. Le porteur indique que l'inflammation peut provoquer un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie, et prévoit la mise à mort en cas de signes de détresse. Il affirme qu'il est "nécessaire" de valider l'effet des molécules chez "l'animal entier et vivant" et retient uniquement des mâles pour limiter la variabilité.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Face à ce constat, les stratégies thérapeutiques se tournent aujourd’hui vers une population cellulaire de plus en plus considérée que sont les cellules gliales et en particulier, les astrocytes, acteurs majeurs de la réponse inflammatoire. Ces processus neuro-inflammatoires, associés à une multitude de maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, atrophie multisystématisée ou sclérose en plaques par exemple) sont encore mal connus. La protéine translocatrice de 18kDa (TSPO), est considérée comme une cible de référence pour visualiser et quantifier la neuro-inflammation. Cette protéine est la plus étudiée actuellement au moyen de différents traceurs radioactifs par Tomographie par émission de positons (TEP). Elle est ainsi pour notre étude, un atout majeur pour la mise en évidence d’efficacité de candidats-médicaments pour certaines pathologies du système nerveux central. Un des modèles de prédilection dans l’étude de la neuro-inflammation est le modèle par administration de lipopolysaccharide (LPS), élément bactérien déclenchant une cascade de réactions inflammatoires dans l’organisme. Nous travaillerons sur un modèle d’inflammation chez le rat par administration stéréotaxique unilatérale de LPS. Ce modèle est reconnu pour l’étude de la neuro-inflammation chez l’animal, dont les données comportementales, phénotypiques et d’imagerie sont bien décrits dans la littérature. Ce modèle est certes plus contraignant que l’injection systémique, mais il présente l’avantage de produire une inflammation plus spécifique dans le cerveau (une inflammation généralisée pouvant entrainer une captation non spécifique du traceur et donc une réponse non-spécifique de nos candidats-médicaments). Ainsi, nous souhaitons évaluer l’effet de candidats-médicaments sur la neuroinflammation chez ce modèle par imagerie TEP du TSPO.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, la neuroinflammation apparait comme un processus physiopathologique d’intérêt car ce phénomène est exacerbé dans de nombreuses pathologies du cerveau, ce qui contribue aux symptômes des patients. La neuroinflammation est induite par la sécrétion de médiateurs moléculaires pro-inflammatoires par les cellules gliales dans le cerveau. Une stratégie thérapeutique prometteuse serait donc de réduire la production de médiateurs de l’inflammation dans un contexte de neuroinflammation. Ainsi, l’enjeu de cette étude est d’évaluer grâce à l’imagerie TEP de la TSPO (une protéine surexprimée par les cellules gliales lors de la neuroinflammation), l’efficacité de candidat-médicaments à réduire la neuroinflammation. Ces candidats-médicaments sont sélectionnés sur la base de données préliminaires suggérant leur capacité à réduire la sécrétion de médiateurs inflammatoires. Des analyses immunohistochimiques complémentaires permettront de préciser davantage le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire des candidats-médicaments dans le cerveau. Ce projet pourrait mener à l’identification d’un candidat-médicament efficace dans le traitement des maladies du système nerveux central.

Procédures

Les 110 animaux effectueront une procédure comprenant 2 interventions majeures : 1) Injections stéréotaxiques dont l’objectif est la mise en place du modèle inflammatoire (durée : 45 minutes) • Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) et analgésie • Sur la totalité des animaux décrits dans cette demande de projet : 110 rats • Chaque animal subira de manière unilatérale, une injection stéréotaxique dans une région d’intérêt d’une endotoxine (le lipopolysaccharide ; LPS) • Immédiatement après l’injection stéréotaxique, les animaux recevront une injection intrapéritonéale du candidat-médicament. Ils recevront également une injection du candidat-médicament 1 jour et 2 jours après la chirurgie. 2) Imagerie TEP /TSPO dont l’objectif est la visualisation de la neuro-inflammation (durée : 1h30) • Un examen d’imagerie TEP/CT avec injection intraveineuse d’un radiotraceur, le [11]PK11195, sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane), 3 jours après l’injection stéréotaxique • Sur la totalité des animaux décrits dans la demande

Impact sur les animaux

Les animaux subiront l’injection stéréotaxique dans un état d’anesthésie générale sous isoflurane, et sous analgésie (buprénorphine, et lidocaïne en local). Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une pilo-érection, une perte d’appétit et une léthargie. De plus, une nuisance possible de cette procédure serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie ou bien d’infection éventuelle à la suite de celle-ci. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum, nettoyage et désinfection de la zone, stérilisation du matériel).

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Etant donné la complexité du phénomène de neuroinflammation, il est nécessaire de valider l’effet des médicaments-candidats chez l’animal entier et vivant pour établir un effet thérapeutique avec un niveau de preuve suffisant pour justifier de futurs essais cliniques. L’utilisation de modèles in vitro, préalable à cette étude, s’inscrit dans une logique de sélection des composés les plus prometteurs mais ne dispense pas de vérifier l’efficacité in vivo des produits à l’issue de cette première phase de sélection.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la recherche de molécules thérapeutiques de ce projet, un criblage in vitro a permis en amont de réduire considérablement le nombre de candidats-médicaments sur la base de leur toxicité et leur d’efficacité. Un minimum de 8 animaux par condition est requis afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une taille d’effet de 7%, avec une variabilité de 5%, une puissance de 80% et un risque alpha de 5%. Le nombre final d’animaux par groupe a été choisi à 10 pour garantir cette puissance statistique en cas de perte éventuelle d’animaux au cours du protocole, tout en le réduisant à son minimum (selon notre expérience de ces conditions expérimentales, nous estimons une perte de données maximale de 2 animaux par groupe, incluant les éventuels décès suite à la chirurgie mais aussi les éventuelles images TEP non interprétables par passage du radiotraceur insuffisant en intraveineux). Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide d’un test d’analyse de variance à une dimension (one-way ANOVAs). Les résultats seront exprimés en moyennes affectées de l’erreur standard. La distribution normale des données sera d'abord testée et si tel est le cas, un test paramétrique sera utilisé (one-way ANOVAs) sinon un test non-paramétrique équivalent sera utilisé (Kruskal-Wallis).

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. L’acquisition TEP sera réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés tous les jours grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte l’éventuel état fébrile observable dans les heures suivant l’injection de LPS. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle animal pour lequel il existe de nombreuses données précliniques impliquant les différentes méthodes utilisées au sein de ce projet. De plus, l’utilisation du rat se justifie également par la taille du cerveau de cette espèce (plus importante que celle de la souris) favorable en TEP. Rats Mâles : Similairement aux autres études réalisées sur ce modèle et afin de limiter une possible variabilité dans notre étude (le LPS induisant des effets différents en fonction du sexe) et de réduire au maximum le nombre d’animaux, le choix se porte uniquement sur le sexe masculin.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau un dispositif puis on y dépose la bactérie Staphylococcus aureus, avant un prélèvement du cœur et une dislocation cervicale, pour tester un implant recouvert d'une molécule antibactérienne contre le biofilm. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui risquerait d'aggraver l'infection, et n'attend surtout que des atteintes locales. Il répond à la "demande de l'industriel" et présente l'essai in vivo comme un "besoin incontestable".

Objectifs

L’objectif de ce projet d’évaluer l’efficacité d’un implant coaté d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer un matériel innovant permettant de réduire ou même d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme. Les biofilms bactériens sont généralement définis comme des agrégats de cellules bactériennes attachés à une surface et enrobés d’une matrice visqueuse. La formation d’un biofilm se fait selon un modèle bien établi et suit différentes étapes (adhésion, croissance, maturation et dispersion). On estime que 80 % de la biomasse microbienne de notre planète réside sous forme d’un biofilm. Le biofilm protège les bactéries et leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles. Les bactéries du biofilm peuvent résister à la réponse immunitaire de l’hôte et sont beaucoup plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les cellules bactériennes planctoniques (non adhérentes). Ainsi, la présence de biofilm dans les infections est particulièrement redoutée en clinique (ex : prothèse orthopédiques, sondes de ventilation mécanique, cathéters veineux…). Parmi les espèces bactériennes largement retrouvées dans les biofilms figurent les espèces du genre Staphylococcus sp.

Procédures

La mise en place de l’implant coaté ou non en position sous-cutanée chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe en intra-péritonéal (kétamine 50mg/kg + xylazine 10 mg/kg). Les flancs seront rasés puis désinfectés par un cycle Bétadiné. Une incision cutanée de 0.5cm sera réalisée stérilement et l’implant sera inséré dans la poche ainsi constituée. L’infection bactérienne sera effectuée dans un même temps en déposant 50µL de l’inoculum au contact de l’implant dans la poche sous-cutanée. Deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris concernées par la phase 1 du projet seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylzaine 10 mg/kg) avant la mise à mort par dislocation cervicale. Toutes les autres souris seront mises à mort comme précédemment cité sans prélèvement intracardiaque.

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger non connu les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire. Aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une quantification bactérienne.

Remplacement

Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées par des méthodes traditionnelles in vitro. Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement mais ne suffisent pas à déterminer l’efficacité en conditions réelles des traitements en développement. En effet, de nombreux échecs thérapeutiques ont été décrits malgré une bonne sensibilité in vitro du pathogène à la molécule d’intérêt. Ainsi, la mise en place de méthodes d’évaluation préclinique in vivo des agents anti-infectieux dans des systèmes plus complexes constitue un besoin incontestable et est devenue l’une des exigences des sociétés savantes telles que l’EMEA (European Medicines Agency).

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (5 souris pour la phase pilote et 10 souris pour la troisième partie du projet) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne sur l’implant et dans le broyat du tissu environnant par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)). Pour la première partie (étude de la toxicité, le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe).

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées par un mélange de kétamine (50 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg). L’incision cutanée réalisée ne dépassant pas 5mm, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Par ailleurs, il s’agit d’une infection très localisée et en aucun cas une infection systémique n’est anticipée. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance bi quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris Balb/cByJ de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 26-27g

10 000 rongeurs, 5 000 souris et 5 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament par gavage ou injection puis subissent des prélèvements de sang et de tissus, parfois multiples, aux veines rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale, pour analyser la pharmacocinétique de molécules. Le porteur indique que l'effectif et le stade des animaux sont fixés par le "donneur d'ordre". Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses et juge le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La collecte de sang et de tissu sur rongeur est une étape nécessaire lors de recherches concernant un nouveau candidat médicament. En effet, elle permet l’analyse de la pharmacocinétique d’un composé concernant son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. L’objectif de la présente étude est de déterminer les méthodes de prélèvements sanguins et / ou tissulaires qui vont être nécessaires pour ces analyses.

Bénéfices attendus

Lors du développement d’un candidat médicament il est essentiel, au-delà de la recherche d’efficacité dans l’aire thérapeutique ciblée, de connaitre ses propriétés concernant sa pharmacocinétique. Cela permet d’obtenir des informations sur différentes caractéristiques comme son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. Afin d’obtenir ces informations, il est nécessaire de réaliser des dosages à partir d’échantillons sanguins et / ou tissulaires.

Procédures

La collecte de sang et de tissu sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements sont réalisés soit à la suite d’un test comportemental soit sur des animaux ayant seulement reçus le traitement du candidat médicament (prélèvement unique ou multiple); ils sont réalisés sur tout l’effectif de tous les groupes expérimentaux.

Impact sur les animaux

1- Les administrations - Elles sont réalisées une seule fois avant le prélèvement. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple) 2- Les prélèvements - Ils sont réalisés après l'administartion des produits. Les prélèvements de fèces sont réalisés sur des animaux vigiles, les autres prélèvements sont réalisés exclusivement sous anesthésie générale (à l’isoflurane).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post mortem.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour permettre l’analyse de la pharmacocinétique d’un candidat médicament à la suite d’un traitement, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables lors des bioanalyses. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées, ce nombre a été fixé à 10 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité des analyses, conduisant à les refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont exprimées sous forme de moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA) suivi du test de Tukey. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Dans le cas de prélèvements multiples (sang par sinus rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale), un suivi approfondi est effectué après chaque ponction pour vérifier : 1) que l’animal se réveille correctement; 2) qu’il y a bien un arrêt du saignement et 3) qu’il n’y a pas d’effets secondaires suite au prélèvement. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. De plus, la proximité clinique entre les modèles rongeurs et les maladies humaines rendent ces analyses de pharmacocinétiques fiables pour l’étude des caractéristiques de candidats médicaments. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées : C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR... Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées : SHR... Le stade de développement est déterminé par le donneur d’ordre en fonction de l’âge auquel est destiné le candidat médicament chez l’homme. Selon les études : 3 à 52 semaines au moment du prélèvement.

40 agneaux vont être utilisés, accompagnés de 20 brebis non comptées comme cibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants. Ils subissent des tests comportementaux, la pose répétée de ceintures à capteur cardiaque, deux prises de sang et des prélèvements de laine, pour évaluer l'effet d'un enrichissement du milieu sur leur bien-être et leur développement. Le porteur décrit un stress de courte durée lié aux manipulations et aux isolements. Il inscrit cette étude sur le bien-être dans une visée d'élevage "durable" et de recommandations pour l'élevage commercial.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’effet d’un enrichissement multimodal des agneaux, dès le plus jeune âge et jusqu’à 2 mois après sevrage sur le bien-être des agneaux, le développement de leurs capacités cognitives et leur réactivité à une phase d’élevage classique source de stress pour les agneaux : le sevrage. L’hypothèse est que l’enrichissement du milieu de vie des agneaux sera pertinent (induisant donc bien un bénéfice comportemental pour les agneaux, selon la définition de Bloomsmith, 1991), qu'il les placera dans un état émotionnel positif leur permettant de mieux affronter une situation stressante (le sevrage), tout en leur offrant une diversité d’activités possibles pouvant détourner leur attention de l’absence de la mère, et qu’il entraînera un meilleur développement cognitif leur permettant d’être plus efficace lors d’un test de type labyrinthe (test de flexibilité comportementale). Pour ce faire, deux lots d’animaux seront constitués : un lot témoin (T) avec des animaux élevés classiquement, avec leurs mères jusqu’au sevrage, et un lot enrichi (E) avec en plus de l’élevage classique appliqué au lot témoin l’apport de différents objets d’enrichissement afin d’offrir aux agneaux une diversité de stimulations, touchant plusieurs de leur sens, dont le toucher et l’olfaction, et couvrant différents types d’enrichissements. Les objets d’enrichissements prévus sont au nombre de 8 : une brosse en L avec ressort, une brosse fixe simple, une plateforme multi-niveaux, un ballon suspendu, une boîte diffusant des odeurs à valence positive pour les agneaux accompagnée d’une barrière de séparation, et trois objets suspendus pour des manipulations orales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, le cas échéant, de faire la preuve de concept que l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge des agneaux est pertinent, permettant d’améliorer le bien-être des agneaux tout au long de leur croissance, et notamment au cours de phases d’élevage stressantes comme le sevrage, en favorisant leurs émotions positives, en stimulant et en développant leurs capacités cognitives et en améliorant leur robustesse. Ce projet permettra aussi de formuler des recommandations pour la mise en place d’objets d’enrichissement du milieu pour les agneaux en élevage commercial.

Procédures

Les 20 brebis ne seront soumises à aucune intervention. Les 40 agneaux seront soumis à : - 3 tests comportementaux, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères - 5 mises en place et 5 retraits des ceintures nécessaires pour maintenir le capteur de l’activité cardiaque, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, de les mettre en contention pour la pose / retrait du matériel. - 2 prises de sang, réalisées à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la prise de sang. - 3 prélèvements de laine, réalisés pour 2 d’entre eux à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la tonte de la zone concernée. Le 3e prélévèment implique de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, et de les mettre en contention pour réaliser la tonte de la zone concernée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress de courte durée dans quelques phases du projet : manipulation par l'homme pour mesures physiologiques, tests de réactivité émotionnelle, test de flexibilité comportementale du fait d'une brève contention, d'une exposition à un environnement nouveau et/ou d'un isolement social. Les enrichissements du milieu peuvent éventuellement être source de compétition pour les animaux (et donc d’une augmentation des comportements agonistiques), mais dans le cas de cette étude le nombre d’objets d’enrichissement (8 pour 20 agneaux) mis à disposition des animaux est suffisant pour que ce phénomène de compétition ne soit pas négatif pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chacune des 2 procédures les animaux sont maintenus en vie et poursuivent l’expérimentation.

Remplacement

Ce projet a pour vocation de déterminer l'influence de l'apport d'enrichissements multimodaux sur le bien-être et sur le développement du comportement. Il est donc nécessaire d’étudier les animaux cibles, dans notre cas des agneaux, pour pouvoir appréhender leur comportement. NB : Le manque de connaissances scientifiques sur l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge chez les agneaux empêche la construction de modèles in silico pour cette étude.

Réduction

Au total 40 agneaux accompagnés de leurs mères, soit 20 brebis, sont utilisés dans l’expérimentation. Notre effectif statistique est donc de 20 agneaux par lot (les mères n’étant pas la cible de l’expérimentation). Cet effectif est nécessaire pour appréhender la variabilité inter-individuelle du comportement et des paramètres physiologiques (activité cardiaque et cortisolémie) ainsi que l’effet maternel (agneaux appairés à leur frère/sœur). Les modèles statistiques (modèles de regression linéaires et non linéaires généralisés mixtes) tiendront compte de l’effet du traitement (avec ou sans enrichissments), de l’effet de la mère et de l’effet de la période/répétition des mesures. Afin de minimiser le nombre d’animaux en expérimentation, les agneaux de ce projet serviront aussi à la mise au point méthodologique de dosage de cortisol dans la laine. Cette méthode de dosage n’est pas encore complétement au point et plutôt que de réaliser une expérimentation supplémentaire les prélèvements réalisés dans ce projet serviront à affiner la méthode d’extraction et de dosage. Si la méthodologie se révèle être réalisable et fiable au niveau des résultats, ces derniers seront utilisés pour répondre aux objectifs de l’étude. Si ce n’est malheureusement pas le cas, les prélèvements réalisés sur les agneaux auront permis de faire avancer le développement méthodologique sans avoir à faire appel à d’autres animaux expérimentaux. NB : L’absence d’études préexistantes similaires (enrichissement multimodal dès 15 jours d’âge chez l’agneau et jusqu’à 130 jours d’âge) ne permet pas de s’appuyer sur des données de variablité préexistantes pour affiner le nombre d’individus afin de maximiser les chances de voir des différences significatives entre nos deux lots (témoin vs. enrichi).

Raffinement

L’objet même de l’étude est de valider la possibilité de raffiner par l’enrichissement multimodal du milieu de vie des animaux en comparant deux lots : un lot témoin (environnement classique d’élevage) et un lot enrichi. Dans tous les cas, les agneaux vivent en groupe social (avec la mère jusqu'au sevrage). Le sol est paillé pour améliorer leur confort. De même, les animaux sont hébergés dans des salles chauffées dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. La surveillance des animaux (brebis et agneaux) des deux lots sera quotidienne afin de détecter le plus précocément possible tout problème de santé, indépendant de notre protocole. Les prises de sang seront réalisées sur des agneaux déjà habitués à la manipulation et à la contention par l’homme (via les trois périodes d’habituation à la pose des ceintures et capteurs pour les mesures d’activité cardiaque), ce qui permettra de minimiser le stress des agneaux et d’avoir ainsi des cortisolémies pertinentes pour l’étude. Le stress induit par les tests en environnement nouveau sera réduit par un passage avec un congénère connu lors de la prémière exposition. A terme, les analyses de cortisol dans la laine, si leur mise au point au cours de cette expérimentation se révèle faisable et pertinente, permettra de réduire le stress subi par les agneaux dans de futurs projets en limitant le recours aux prises de sang.

Choix des espèces

L'objectif est de contribuer à améliorer les connaissances et les recommandations sur l'élevage des ruminants, plus particulièrement en bâtiment, via l'apport d'enrichissements. Ceci dans une optique d’élevage durable et d'amélioration du bien-être. Le projet s’intéresse aux agneaux allaités par leurs mères, ce qui correspond à la très grande majorité des agneaux élevés en France en élevage ovin allaitant. Les ovins apparaissent donc comme étant à la fois une espèce cible (représentant une part importante de l’économie agricole française avec plus de 3,7 millions de brebis allaitantes en 2019 et environ le double d’agneaux) et une espèce modèle pertinente pour l’étude sur les ruminants. Le projet vise à déterminer l'influence de la présence d'enrichissement au jeune âge sur le développement comportemental et le bien-être des individus. Au regard de cet objectif, nous suivrons 40 agneaux de leur naissance jusqu'à la fin de la période d’engraissement (environ 130 jours).

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et dix réutilisées pour la formation de praticiens. Souris immunodéficientes greffées d'un carcinome à cellules de Merkel, elles reçoivent des injections intraveineuses hebdomadaires d'un anticorps-médicament à doses croissantes, avec prélèvements sanguins, pour fixer la dose à retenir avant un essai clinique. Le porteur définit des points limites au pelage "piqué", à une perte de 20% de poids ou à un volume tumoral dépassant 1 cm³. Il présente le modèle murin immunodéficient comme "indispensable" faute d'autre modèle disponible.

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de mettre en place un essai clinique de phase 1 chez l’Homme. Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).

Bénéfices attendus

Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).

Procédures

Les différentes doses préalablement définies (2, 5, 10 et 20 mg/kg) seront injectées une fois par semaine pendant cinq semaines en intra-veineuse (directement dans la veine caudale) sous un volume de 0.2 ml. Les animaux (demi-groupe) auront également un prélèvement de sang en submandibulaire à 6 et 21 jours permettant ainsi que chaque souris ne subisse qu'un seul prélèvement sanguin au cours de l'étude.

Impact sur les animaux

points limites: aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1 cm3 ou apparition d’ulcération

Devenir

Les souris utilisées pour la formation des pratricien seront réutilisés

Remplacement

L’efficacité de l’ADCTIMER a été préalablement démontrée in vitro et in vivo en modèle de xénogreffe murin. L’étude préliminaire in vivo consistait à l’évaluation de l’efficacité des 10 mg/kg suivant le schéma thérapeutique de 3 injections IV, chacune espacée de 15 jours. Cette étude a montré que la dose de 10 mg/kg induit une stabilisation de la croissance tumorale. Dans ces nouvelles études, un nouveau schéma thérapeutique d’une injection toutes les semaines pendant trois semaines (schéma thérapeutique usuellement utilisé en clinique pour un ADC) ainsi que trois nouvelles doses (une dose faible, une dose intermédiaire et une dose forte) seront évaluées. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de la dose optimale permettant à la fois une réponse anti-tumorale franche et une bonne tolérance du produit. Ces éléments, essentiels pour le développement d’un nouveau biomédicament et de son évaluation en phase I, nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immuno-déficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement sera stérilisé. La douleur et l’inconfort pouvant être subit durant ce projet par les animaux sont un maximum réduit. Afin de réduire la douleur pouvant être par l'injection du produit ou du véhicule en intraveineuse, l'utilisation d'une pomade anesthésiante sera systématiquement faite.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris NOD/SCID sont un modèle de référence dans les études de xénogreffe 7 semaines (incluant la semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance) Pour la formation , des souris Balb/c seront alors utilisées comme modèle par soucis de coût par rapport aux souris NOD/SCID mais également parce que ces souris seront plus facilement réutilisées pour des expérimentations.